一种长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶及其制备方法与应用

本发明属于医用敷料领域，具体涉及一种长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、作为人体一种重要的保护器官，皮肤在阻挡外部有害物质入侵以及维持体内生理环境稳定等方面发挥着不可替代的作用。皮肤一旦受损，未经保护的组织就会出现渗血的情况，并增加了伤口感染的风险。如果缺乏适当的治疗，不仅会延长伤口恢复的周期，而且还可能会因为细菌感染导致截肢，甚至死亡等严重后果。虽然传统伤口敷料具有使用便捷、价格低廉、便于生产等优势，但它们在调节伤口湿度，提供长期抗菌性能和促进伤口组织再生等方面的效果不及水凝胶伤口敷料。近年来，各种多功能伤口敷料被相继开发，但现有的皮肤伤口敷料缺乏黏附性、止血性和长期抗菌性，导致潜在的细菌感染，从而使伤口愈合受阻甚至使伤口状况恶化。因此急需研制出一种合适的创伤敷料，使其同时具有长效抗菌性、快速止血性以及强组织粘附性促进创口愈合。

2、羧甲基壳聚糖(cmc)是壳聚糖羧甲基化的产物，不仅具有良好的水溶性，而且表现出了优异的生物学特性，如良好的生物相容性、可生物降解性和一定的抗菌活性。作为一种水溶性壳聚糖衍生物，其应用范围更广，在创面修复、药物递送和组织工程等生物医学领域均受到了广泛的关注和深入的研究。但单一组分的羧甲基壳聚糖材料在止血性、组织粘附性和长期抗菌性等方面的不足限制了cmc在生物医学领域中的应用。科研人员通常会对cmc进行化学改性，以达到改善cmc的理化性质的目，例如，(1)王胜,杨黎明,陈捷,等.温度及ph敏感性聚乙烯醇/羧甲基壳聚糖水凝胶的制备与性能研究[j].化学世界,2006,47(3):149-152.doi:10.3969/j.issn.0367-6358.2006.03.007。(2)[1]徐咏梅,周伟,殷磊,等.巯基化羧甲基壳聚糖微凝胶的制备及其生物黏附性能[j].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(29):4.doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.29.009.(3)cn110483662a一种羧甲基壳聚糖交联凝胶。

3、但是，现有技术中改性后的羧甲基壳聚糖水凝胶的抗菌性一般，大多不具备长效抗菌性。

技术实现思路

1、为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明提供一种长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶的制备方法。该方法通过在羧甲基壳聚糖材料上分别接枝邻苯二酚和鱼精蛋白以提高其组织粘附性、止血性和抗菌性，接着通过与氧化透明质酸发生席夫碱反应进一步提高其机械性能。

2、本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制得的羧甲基壳聚糖凝胶，其具有长期抗菌性、良好组织粘附性、促凝血性、快速止血性。

3、本发明的再一目的在于提供上述羧甲基壳聚糖凝胶的应用。

4、本发明目的通过以下技术方案实现：

5、一种长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶的制备方法，包括以下步骤：以羧甲基壳聚糖为原料，在其表面引入邻苯二酚官能团制得羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛；以羧甲基壳聚糖为原料，在其表面引入叠氮基团制得羧甲基壳聚糖-叠氮；以鱼精蛋白为原料，在其表面引入二苯并环辛炔基团制得鱼精蛋白-二苯并环辛炔；再进一步利用羧甲基壳聚糖-叠氮和鱼精蛋白-二苯并环辛炔的无铜催化叠氮炔环加成(spaac)反应合成羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白；最后利用邻苯二酚官能团的氧化交联作用以及羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛、羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白和氧化透明质酸的席夫碱反应合成凝胶材料，即所述长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶。

6、进一步的，所述氧化透明质酸的制备步骤如下：在透明质酸溶液中加入高碘酸盐，透明质酸与高碘酸盐的质量比为1:0.25-0.5，室温避光反应8-24h，乙二醇淬灭后经去离子水透析、真空冻干得到氧化透明质酸。

7、进一步的，所述羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛的制备步骤如下：在氮气保护的条件下，在羧甲基壳聚糖水溶液中加入3,4-二羟基苯甲醛-乙醇溶液，羧甲基壳聚糖与3,4-二羟基苯甲醛的质量比为1:1.25-1.75，加热至50-60℃，反应1-3小时，经无水乙醇沉淀、真空干燥，即可得到羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛(dcmc)。

8、进一步的，所述羧甲基壳聚糖-叠氮的制备步骤如下：将羧甲基壳聚糖溶于去离子水，加入叠氮-聚乙二醇-活性酯，室温下反应12-24小时，叠氮-聚乙二醇-活性酯与羧甲基壳聚糖的质量比为1:25-50，经去离子水透析、真空冻干得到羧甲基壳聚糖-叠氮。

9、进一步的，所述羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白的制备步骤如下：将鱼精蛋白溶于pbs缓冲溶液，加入二苯并环辛炔-聚乙二醇-活性酯，室温下反应12-24小时，二苯并环辛炔-聚乙二醇-活性酯与鱼精蛋白的质量比为1:20-40；反应12-24小时后，加入羧甲基壳聚糖-叠氮，室温下反应12-24小时，羧甲基壳聚糖-叠氮与鱼精蛋白-二苯并环辛炔的质量比为1:0.5-1，经去离子水透析、真空冻干得到羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白(pcmc)。

10、进一步的，制得氧化透明质酸和羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛后，进一步的操作步骤如下：分别取氧化透明质酸、羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛和羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白溶于去离子水，按照氧化透明质酸、羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛与羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白的质量比为10:2.5:1，将三者的溶液充分混匀，在室温下1-3分钟后形成新的高分子生物医学材料即所述长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶。

11、进一步的，氧化透明质酸溶于去离子水后获得的溶液浓度为3-5wt％。

12、进一步的，羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛溶于去离子水后获得的溶液浓度为5-10wt％。

13、进一步的，羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白溶于去离子水获得的溶液浓度为4wt％。

14、本发明主要通过以下步骤实现：

15、(1)配制透明质酸溶液，加入高碘酸盐，避光反应8-24h；乙二醇淬灭后，透析，冻干制得氧化透明质酸；

16、(2)配制羧甲基壳聚糖溶液，然后加入3,4-二羟基苯甲醛-乙醇溶液，加热至50-60℃，在氮气保护的条件下反应1-3小时，在无水乙醇溶液中沉淀得到羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛；

17、(3)配制羧甲基壳聚糖溶液，然后加入叠氮-聚乙二醇-活性酯，室温下反应12-24小时，透析、冻干制得羧甲基壳聚糖-叠氮；

18、(4)将鱼精蛋白溶于pbs溶液，然后加入二苯并环辛炔-聚乙二醇-活性酯，室温下反应12-24h；接着加入步骤(3)中制得的羧甲基壳聚糖-叠氮，室温下反应12-24小时，透析、冻干制得羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白；

19、(5)将上述步骤制得的氧化透明质酸、羧甲基壳聚糖-3,4-二羟基苯甲醛与羧甲基壳聚糖-鱼精蛋白溶解于去离子水，将三者的溶液在模具中混合均匀，室温1-3分钟后交联形成所述长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶。

20、进一步的，所述的二苯环辛炔-聚乙二醇-活性酯优选为二苯并环辛炔-四聚乙二醇-活性酯，二苯并环辛炔-五聚乙二醇-活性酯或是二苯并环辛炔-十二聚乙二醇-活性酯的至少一种。

21、进一步的，所述的高碘酸盐为高碘酸钠或高碘酸钾。

22、进一步的，所述的羧甲基壳聚糖分子量为40万-100万，脱乙酰度为≥80％。

23、进一步的，所述3,4-二羟基苯甲醛-乙醇溶液浓度为450-550mg/ml。

24、上述方案制备得到的一种长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶，兼具长期抗菌性、良好的组织粘附性、促凝血性以及快速止血性，并且可注射使用。

25、所述长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶可以制成冻干海绵、水凝胶等临床使用的敷料或器械。

26、所述长效抗菌的羧甲基壳聚糖凝胶可以作为止血、水性皮肤等用来治疗和预防创伤和疾病。

27、本发明相对于现有技术具有以下优点：

28、1)本发明把邻苯二酚结构化合物接枝到羧甲基壳聚糖上，可提高羧甲基壳聚糖材料机械性能、组织粘附性、促凝血性和快速止血性。

29、2)本发明把鱼精蛋白接枝到羧甲基壳聚糖上，可实现羧甲基壳聚糖材料的长效抗菌性、促凝血性和快速止血性。

30、3)本发明提供的具有长效抗菌性、组织粘附性、快速止血性、可注射的羧甲基壳聚糖凝胶有潜力作为一种新型生物材料在细胞、组织工程、药物递送等生物医学领域得到广泛应用。