检测UGT1A1基因多态性的引物组及试剂盒与方法与流程

本发明涉及一种ugt1a1基因多态性检测的引物组及试剂盒与方法，属于生物检测分析。

背景技术：

1、遗传性非结合性高胆红素血症，包括crigler-najjar综合征ⅰ型(cn-1)、crigler-najjar综合征ⅱ型(cn-2)和gilbert综合征(gs)，都是由胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1a1(udp-gt酶)基因突变所引起的。udp-gt酶的编码基因ugt1a1位于2q37.1，其dna包括13027个碱基，mrna由2361个碱基组成，蛋白质由533个氨基酸编码。在胆红素代谢中，非结合胆红素(ibil)经ugt1a1代谢为结合胆红素(dbil)，ugt1a1为该反应中主要的限速代谢酶。当ugt1a1基因突变导致酶活性降低或丧失时，非结合胆红素因无法转化为结合胆红素而在体内蓄积。

2、在正常人群中，大约有6～12％的人存在udp-gt酶缺乏，其生化指标为间接胆红素升高、alt等肝功能指标正常。患者表现为易疲劳、精神不振等，发病诱因包含感染(例如感冒或流感)、禁食或吃低热量饮食、脱水、剧烈运动、压力、女性月经等。ugt1a1基因多态性是gilbert综合征的分子遗传学基础，可用于辅助诊断gilbert综合征。

3、ugt1a1基因突变包括插入、缺失和单核苷酸多态性等多种形式，因此导致序列间的个体差异很大。目前已发现该基因的突变体有160个，按国际通用命名方式，野生型标识为ugt1a1*1，突变型依次标识为*2，*3，*4，*5等。目前，ugt1a1基因遗传多态型主要有3种形式：①外显子区域的错译突变，如：ugt1a1*6(c.211g＞a，g71r)、ugt1a1*27(c.686c>a，p229q)、ugt1a1*63(c.1091c>t，p364l)、ugt1a1*7(c.1456t>g，y486d)等，以外显子1上核苷酸211位点g＞a(g71r)最为常见。②启动子tata盒ta插入突变，表现为二核苷酸(ta)插入到ugt1a1基因启动子上游约25-35个bp处的tata盒中，使正常野生型a[ta]6taa突变为a[ta]7taa或a[ta]8taa等多态型。③苯巴比妥反应增强元件(phenobarbital-responsiveenhancer module，pbrem)区，c.-3279t>g，该突变与a[ta]7taa有很强的连锁现象。近年来，依据间接胆红素水平与基因检测结果，结合遗传规律已是诊断gilbert综合征的一个重要手段。

4、公开号为cn112592970a的专利公开了一种gilbert综合征ugt1a1多位点突变检测试剂盒，该试剂盒包括分别针对ugt1a1的四个突变位点p.g71r、p.p229q、p.y486d和a[ta]7taa进行非标记探针hrm检测用的引物对及探针，该方法对仪器的温度分辨率和温度均一性要求相当高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中检测ugt1a1基因多态性产品分型的种类不全、操作繁琐且时间长的问题，为达到上述目的，本发明提供一种检测ugt1a1基因多态性的引物组，包括：

2、用于检测ugt1a1*6基因的引物，含有：

3、c.211a分型用上游引物u-6a-f1：5'-cgttgtacatcagagaca-3'，

4、c.211g分型用上游引物u-6g-f1：5'-cgttgtacatcagagacg-3'，

5、c.211g/a分型共用下游引物ugt*6-r1：5'-ccgagactaacaaaagactct-3'；

6、用于检测ugt1a1*28基因的引物，含有：

7、c.-53ta6/ta7分型共用上游引物u-286-f1：5'-cctgctacctttgtggactg-3'，

8、c.-53ta7分型用下游引物u-7r-r21：5'-gccctctcctacttatatatatatataagg-3'，c.-53ta6分型用下游引物u-6r-r21：5'-gccctctcctacttatatatatatatataagg-3'；

9、用于检测ugt1a1*60基因的引物，含有：

10、c.-3279t分型用上游引物u-3279t-22f1：5'-ccaagggtagagttcagtt-3'，

11、c.-3279g分型用上游引物u-3279g-22f1：5'-ccaagggtagagttcagtg-3'，

12、c.-3279t/g分型共用下游引物u-3279-22r1：5'-atcaaacttcctttgatgttct-3'；

13、用于检测ugt1a1*27基因的引物，含有：

14、c.686c分型用上游引物u-p229-f1：5'-gacgtggtttattcccc-3'，

15、c.686a分型用上游引物u-p229q-f1：5'-gacgtggtttattccca-3'，

16、c.686c/a分型共用下游引物u-p229-r2：5'-agaggacagtcacctctctctgaa-3'；

17、用于检测ugt1a1*63基因的引物，含有：

18、c.1091c/t分型共用上游引物u-p364-f11：5'-gacacctagatgtgtccagc-3'，

19、c.1091c分型用下游引物u-p364-r1：5'-aggcacgggtcatcgg-3'，

20、c.1091t分型用下游引物u-p364l-r102：5'-aaaggcacgggtcatca-3'；

21、用于检测ugt1a1*7基因的引物，含有：

22、c.1456t分型用上游引物u-y486-f1：5'-cctcacctggtaccagt-3'，

23、c.1456g分型用上游引物u-y486d-f4：5'-gacctcaactggtaccagg-3'，

24、c.1456t/g分型共用下游引物u-y486-r1：5'-gtttccaagaggaaaccaatcac-3'。

25、优选地，所述引物u-6a-f1、u-6g-f1、u-p229-f1、u-p229q-f1、u-y486-f1、u-y486d-f4、u-7r-r21、u-6r-r21、u-3279t-22f1、u-3279g-22f1、u-p364-r1、u-p364l-r102的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；优选地，同一位点不同标记引物用相同标记物进行标记。

26、优选地，所述5'端标记有荧光报告基团包括fam、texas red、rox、hex、vic、ned、cy5中的一种或多种，3'端标记有荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3中的一种或多种。

27、优选地，所述引物的3'端进行脱羟基修饰。

28、本发明还提供一种检测ugt1a1基因多态性的试剂盒，包括pcr反应液和gs反应管，所述gs反应管含有检测ugt1a1基因多态性的引物组。

29、优选地，所述pcr反应液包括0.1～0.2u/μl taq酶、1.5～5mm mgcl2、20mm tris-hcl、100mm kcl、0.05～0.5mm dntps、5mm焦磷酸钠。

30、优选地，所述引物组的浓度为12pmol/管。

31、本发明还提供一种检测ugt1a1基因多态性的方法，包括：

32、从待测样品中提取基因组dna；

33、使用检测ugt1a1基因多态性的试剂盒配制荧光定量pcr预混液；

34、取配置好的荧光定量pcr预混液加入到gs反应管中，放入荧光定量pcr仪中进行荧光定量pcr反应，检测荧光信号并判定结果。

35、优选地，所述荧光定量pcr预混液包括44μl的pcr反应液、120～400ng的样本dna和水。

36、优选地，所述荧光定量pcr的反应程序为：95℃、10min；95℃、10s，60℃、45s，5个循环；95℃、10s，60℃、35s，40个循环；25℃、10s

37、本发明所达到的有益效果：

38、1.本发明使用焦磷酸解启动的荧光pcr法(pap-qpcr)检测ugt1a1基因多态性，该方法的原理为：在pcr反应体系中，加入无机焦磷酸，此时，引物3'端无羟基时，引物与模板完全互补，则发生无机焦磷酸分解引物3'端碱基(可认为是dna聚合作用的逆反应，而且这种水解dna链作用需要有模板dna的存在)，引物脱掉3'端第一个碱基后，则在3'端形成能供发生pcr反应的引物，即pcr反应启动；经标记的引物经5'荧光基团-3'淬灭基团标记，当发生焦磷酸解时，淬灭基团从引物上脱落，形成荧光信号。

39、2.相较于pcr-sanger测序法，本发明提供的基于荧光pcr仪的pap-qpcr检测法的试剂盒不仅操作简便、检测时间短，而且报告响应及时。此外，pap-qpcr能够更精准的分析重复序列的重复数量、性能更优，且具有操作步骤少、便捷、易于标准化的优势，适合在临床实验室进行推广。