一种热稳定性提高的果胶裂解酶突变体及其制备方法

本发明属于蛋白质工程领域，特别涉及一种热稳定性提高的果胶裂解酶突变体及其制备方法。

背景技术：

1、果胶(pectin)是植物细胞壁中层的一种天然成分，由α-1,4-糖苷键连接的半乳糖醛酸链组成，具有较高的甲基酯化率，并能与其他非纤维素材料形成网络，需要在多种果胶酶协同作用下才能够完全降解。果胶裂解酶(pectin lyases)是果胶酶家族中的一种重要的酶，可通过反式消除作用断开聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，生成不饱和寡聚半乳糖醛酸，在制浆造纸行业中的木材脱胶、胶黏物控制以及脱墨等过程发挥着重要的作用，具有广阔的发展前景。然而天然的果胶裂解酶稳定性不好，在高温条件下容易失活，这严重限制了果胶裂解酶在工业上的应用。因此，筛选出热稳定性好的果胶裂解酶突变体，对于提高其工业应用效率以及促进相关工业的发展具有重要的作用。

2、目前常用的酶分子改造策略有定向进化(directed evolution)、理性设计(rational design)和半理性设计(semirational design)。定向进化通过对目标酶分子进行多轮突变、表达和筛选，从而获得所需功能的酶突变体。但是此法筛选工作量极大、耗时长、成本高，常因缺乏易实现的高通量筛选技术而受到限制。相反，理性设计和半理性设计通过计算模拟考察某位点突变对催化性能的影响，从而对酶定向进化进行设计指导和虚拟筛选，在酶工程领域发挥着重要的作用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体及其制备方法。其中，组合突变体p8、p31、p41、p54和p55，与野生型相比，在75℃下的半衰期由原来的10.48min分别提高至553.42min、486.52min、646.57min、453.63min和600.52min，分别提高了大约53倍、46倍、62倍、43倍和57倍，在80℃下的半衰期由原来的3.03min分别提高至88.52min、78.35min、97.45min、67.83min和93.72min，分别提高了大约29倍、26倍、32倍、22倍和31倍；具有较大的工业应用潜力以及经济价值。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、一种热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体，其氨基酸序列为seq id no.1经如下任意一种突变而得：

4、1)r11h、t21v、q35p、s115p、v195i、g200s、n255d、s264g、t305v、r310l、w317y、y357f、k360y、t432p和t451s中的至少一个；其中，r11h即第11位氨基酸由r突变为h，其他同理；

5、2)r340y，且r11h、t21v、q35p、s115p、v195i、g200s、n255d、s264g、t305v、r310l、w317y、y357f、k360y、t432p和t451s中的至少一个；

6、3)r340w，且r11h、t21v、q35p、s115p、v195i、g200s、n255d、s264g、t305v、r310l、w317y、y357f、k360y、t432p和t451s中的至少一个；

7、4)s361n，且t21v、g200s、n255d、s264g、t305v、w317y、r340y、t432p和t451s中的至少一个；

8、5)s361n，且t21v、g200s、n255d、s264g、t305v、w317y、r340y、t432p和t451s中的至少一个；且r11h、q35p、s115p、v195i、r310l、r340w、y357f和k360y中的至少一个；

9、进一步的，热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体，其氨基酸序列为seq idno.1经如下任意一种突变而得：

10、r11h、t21v、q35p、s115p、v195i、g200s、n255d、s264g、t305v、r310l、w317y、y357f、k360y、t432p、t451s、y357f/r310l、r340w/r310l、r340w/n255d、r340w/t451s、y357f/v195i、y357f/r340y、k360y/n255d、r310l/k360y/t451s、y357f/t21v/r310l、y357f/t432p/r310l、k360y/r340w/r310l、y357f/r340y/t432p、t21v/t432p/k360y、r11h/y357f/t432p/r310l、r11h/y357f/r340w/r310l、r11h/q35p/r340w/r310l、y357f/t21v/t432p/r310l、t451s/k360y/r310l/s264g、v195i/y357f/r340y/r310l、k360y/r340w/r310l/g200s、t21v/r310l/r340w/y357f/t451s、v195i/y357f/r340y/t21v/t451s、y357f/t21v/t432p/r310l/r340y、r11h/q35p/v195i/y357f/r340w/r310l、t21v/r310l/r340w/y357f/t451s/v195i/y367f、r11h/t21v/q35p/v195i/r310l/r340w/y357f/t451s、s361n/t432p、s361n/t451s、s361n/r340y、s361n/n255d、s361n/t21v、t21v/s361n/r310l、t451s/t432p/s361n、t451s/s361n/k360y、n255d/k360y/s361n、t21v/r310l/r340w/s361n、n255d/r310l/y357f/s361n、t21v/r310l/w317y/s361n、y357f/k360y/s361n/y367f、k360y/s361n/r340w/t451s、k360y/s361n/r340w/n255d、r310l/k360y/s361n/s264g、r310l/k360y/s361n/g200s、n255d/k360y/s361n/y357f、n255d/k360y/s361n/w317y、r310l/r340w/y357f/s361n/t451s、t21v/r310l/r340w/s361n/t451s、v195i/r310l/r340w/s361n/t451s、y357f/s361n/r310l/v195i/t451s、r310l/k360y/s361n/r340w/t451s、y357f/s361n/r310l/t451s/t432p、t21v/s361n/r310l/g200s/s264g、r340w/y357f/s361n/t451s/w317y、n255d/k360y/s361n/w317y/y357f、t21v/r310l/r340w/y357f/s361n/t451s、r310l/r340w/y357f/s361n/t451s/k360y、t21v/t432p/r310l/k360y/s361n/r340y、r310l/r340w/y357f/s361n/t451s/v195i/t432p、r310l/r340w/y357f/s361n/t451s/k360y/t432p、v195i/r310l/r340w/s361n/t451s/k360y/g200s、v195i/r310l/r340w/s361n/t451s/k360y/t432p、v195i/r310l/r340w/s361n/t451s/n255d/s264g、t21v/r310l/r340w/y357f/s361n/t451s/v195i、r11h/q35p/s115p/v195i/g200s/r310l/r340y/y357f/k360y/s361n、q35p/v195i/g200s/t305v/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/q35p/s115p/v195i/n255d/r310l/r340y/y357f/k360y/s361n、r11h/q35p/s115p/v195i/g200s/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/s115p/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/q35p/s115p/v195i/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/t21v/q35p/s115p/v195i/n255d/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/t21v/q35p/v195i/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、t21v/q35p/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/q35p/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n、s115p/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/t21v/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/q35p/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/t21v/q35p/r310l/r340w/s361n、r11h/t21v/q35p/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/q35p/v195i/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/q35p/v195i/n255d/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/t21v/q35p/r310l/r340w/s361n/t451s、r11h/q35p/s115p/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/q35p/v195i/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/q35p/v195i/g200s/r310l/r340y/y357f/k360y/s361n、r11h/q35p/t305v/r310l/w317y/r340y/y357f/k360y/s361n、q35p/s115p/n255d/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、q35p/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/v195i/n255d/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/s115p/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/s115p/t305v/r310l/w317y/r340y/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/s115p/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、s264g/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、s115p/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、s115p/s264g/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/s115p/s264g/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、s115p/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、s115p/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、r11h/s264g/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、q35p/s115p/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、t305v/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/s264g/t305v/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、n255d/s264g/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、n255d/s264g/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、n255d/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、t21v/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、n255d/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、t305v/r310l/r340w/k360y/s361n/t451s、n255d/t305v/r310l/r340w/k360y/s361n、r310l/w317y/r340w/y357f/s361n/t451s、v195i/g200s/t305v/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s、v195i/g200s/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s。

11、优选的，编码seq id no.1所示氨基酸序列的基因序列如seq id no.2所示。

12、一种所述突变体的编码基因。

13、优选的，一种热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体p41(r11h/s115p/t305v/r310l/w317y/r340w/y357f/k360y/s361n/t451s)，所述突变体的氨基酸序列如seq idno.3所示。

14、具体，所述突变体p41的第11位、115位、305位、310位、317位、340位、357位、360位、361位和451位发生突变，分别由精氨酸r突变为组氨酸h、丝氨酸s突变为脯氨酸p、苏氨酸t突变为缬氨酸v、精氨酸r突变为亮氨酸l、色氨酸w突变为酪氨酸y、精氨酸r突变为色氨酸w、酪氨酸y突变为苯丙氨酸f、赖氨酸k突变为酪氨酸y、丝氨酸s突变为天冬酰胺n和苏氨酸t突变为丝氨酸s。

15、一种如上述所述热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体p41的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

16、上述突变体相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

17、(a)含有上述编码基因的表达盒；

18、(b)含有上述编码基因的重组表达载体；

19、(c)含有(a)中所述表达盒的重组表达载体；

20、(d)含有上述编码基因的重组微生物；

21、(e)含有(a)中所述表达盒的重组微生物；

22、(f)含有(b)或(c)中所述重组表达载体的重组微生物。

23、进一步的，(b)、(c)中所述重组表达载体的出发载体为pet系列的载体或ppiczα载体等；优选为pet-28a(+)载体或ppiczαa载体。

24、进一步的，(d)、(e)、(f)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物或酵母等；所述原核生物包括埃希氏菌属(escherichia)等细菌；所述酵母包括毕赤酵母等酵母。更具体而言，所述原核生物是大肠杆菌(escherichia coli，e.coli)，具体可为大肠杆菌bl21(de3)；所述酵母是毕赤酵母x33或gs115。

25、一种固定化酶，含有上述突变体。

26、上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在制备热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体中的应用。

27、上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在降解果胶中的应用；

28、进一步的，上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在造纸中的应用。

29、一种获得上述突变体的方法，包括如下步骤：通过设计引物对编码果胶裂解酶pmgl-ba的基因进行定点突变后表达。

30、进一步的，设计含有突变位点的引物向编码果胶裂解酶pmgl-ba的基因中引入突变，经测序正确后转化至大肠杆菌bl21(de3)中进行表达，得到热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体。

31、更进一步的，是以质粒pet-28a(+)-pmgl-ba为模板，设计含有突变位点的引物向编码果胶裂解酶pmgl-ba的基因中引入突变，然后转化至大肠杆菌top10中，随机挑取转化子提质粒进行测序。

32、一种热稳定性提高的果胶裂解酶pmgl-ba突变体的酶活测定方法，其特征在于，步骤如下：

33、酶活测定采用540nm光吸收法，以果胶为底物测定果胶裂解酶pmgl-ba突变体的酶活，一个酶活力单位指在ph 8.0、60℃的条件下，1min内产生1μmol还原糖的反应效力；反应体系在1.5ml的ep管中加入190μl的底物溶液，所述底物溶液为0.5％的果胶溶液，恒温混匀仪中60℃预热5min，加入10μl适当稀释的酶液，反应10min，立即加入300μl的dns溶液，煮沸5min终止反应；取200μl反应后的溶液在540nm处测量其吸光度值。

34、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

35、本发明通过fireprot和bayestab网站预测以及共有序列设计等半理性设计方法获得了18个热稳定性增强的突变体；进一步地，通过将18个热稳定性增强的突变体进行随机组合，测定其在65℃下热处理30min后的残余酶活，最终获得117个热稳定性提高的组合突变体；其中，组合突变体p8、p31、p41、p54和p55，与野生型相比，在75℃下的半衰期由原来的10.48min分别提高至553.42min、486.52min、646.57min、453.63min和600.52min，分别提高了大约53倍、46倍、62倍、43倍和57倍，在80℃下的半衰期由原来的3.03min分别提高至88.52min、78.35min、97.45min、67.83min和93.72min，分别提高了大约29倍、26倍、32倍、22倍和31倍。这一发明获得了一种热稳定性显著提高的果胶裂解酶突变体，在工业生产中具有较大的应用潜力。