一种用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物和试剂盒及使用方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物和试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、随着人们生活水平的提高，生活压力也随之增大，以及生活环境发生的改变、妊娠年龄的拖后，人类面临生殖健康的严峻挑战。目前，多囊卵巢综合征(polycystic ovarysyndrome，pcos)是造成女性不排卵、不孕的主要原因，其发生率达70％。临床上，pcos出现在各个年龄段的女性人群中，青春期因为pcos月经不调；育龄期因为不排卵而无法妊娠；围绝经期面临子宫内膜癌和代谢性疾病风险。虽说口服避孕药或激素替代疗法(hormonereplacementtherapy，hrt)可调经，使用促排卵药后可促使多个卵泡发育，也有优势卵泡的出现，但临床发现，促排卵患者存在卵子质量差、成熟度低、受孕率低等问题。

2、纵观传统医学的发展历程可见，中医各类经典书籍中未曾出现多囊卵巢综合征相关的文献记载，但据其临床表现可归属于一些妇科常见病的领域，比如不孕、闭经、月经后期以及崩漏等。中医中药在其特有的整体观和辨证论治理论的基础上能根据临床症状的差异性进行辩证施治，且能明显改善pcos患者的临床症状。诸多中医学者认为本病的主要病因是痰湿内盛，多从痰湿角度进行施治。

3、目前，市场上还没有针对多囊卵巢综合征的快速高效诊断试剂盒问世，影响到多囊卵巢综合征早期发现及治疗。因此，找到一种基于生物标志物的诊断方法，结合现有的临床指标，来预测和诊断多囊卵巢综合征，对于多囊卵巢综合征的疾病风险评估有很大的意义。最新的研究表示，pcos的症状与患者体内microrna的表达有密切关系。据此，本发明提出一种用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物和试剂盒及使用方法，来诊断受试者是否患有多囊卵巢综合征。

4、本背景技术所公开的上述信息仅仅用于增加对本发明背景技术的理解，因此，其可能包括不构成本领域普通技术人员已知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物和试剂盒及使用方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于多囊卵巢综合征诊断试剂盒，包括：rna提取液、三氯甲烷、异丙烷、无水乙醇、hypuretm molecularbiology grade water、revertaid first strand cdnasynthesis kit、faststartuniversal sybr green master(rox)、引物，所述试剂盒还包含由hypuretm molecularbiology grade water配置的75％乙醇，所述引物适用于rna提取液所提取的rna基因。

4、优选的，所述引物根据mirbase数据库提供的mirnas序列设计特异性反转录基因序列得到，并选用u6作为内参，所述rna提取液所提取的rna基因包括mir-223-3p和mir-223-5p。

5、优选的，所述该试剂盒中采用mir-223-3p和mir-223-5p作为诊断多囊卵巢综合征的生物标志物，所述引物包含mir-223-3p和mir-223-5p的引物基因序列。

6、表1mirna引物合成序列

7、

8、一种用于多囊卵巢综合征诊断试剂盒的使用方法，所述在该方法中采用qrt-pcr检测受试者血清、卵泡液或颗粒细胞中mir-223-3p和mir-223-5p的表达，结合临床指标数值对受试者是否患有多囊卵巢综合征进行判定。

9、优选的，所述该方法包括以下步骤：1)受试者样品的前处理；2)受试者样品总rna的抽取；3)对提取的总rna进行反转录；4)定量pcr处理；5)qrt-pcr检测。

10、优选的，所述在进行操作的过程中，所使用的枪头和离心管及pcr操作均经过湿热灭菌，且无rna酶存在。

11、优选的，所述受试者样品的前处理包括：①从-80℃冰箱中取出含样本的冻存管，在冰上缓慢解冻，然后加入匀浆器中；②充分研磨直至成细胞悬液，此过程在通风橱中操作。

12、优选的，所述受试者样品总rna的抽取包括以下步骤：①取匀浆器，加入1ml的trizol reagent；②12000rpm离心10min，加入250μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min；③4℃下12000rpm离心10min，将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙酮，颠倒混匀；④-20℃放置15min；⑤4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为rna；⑥吸除液体，加入75％乙醇1.5ml洗涤沉淀；⑦4℃下12000rpm离心5min，将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min；⑧加入15μl无rna酶的水溶解rna，55℃孵育5min；⑨使用超微量分光光度计检测rna浓度及纯度：仪器空白凋零后取2.5μl待测rna溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测；⑩将浓度过高的rna进行适当比例的稀释，使其浓度为200ng/μl。

13、优选的，所述对提取的总rna进行反转录包括以下步骤：①取一pcr管，加入含2μgrna的溶液；②加入1μl特异性mirna反转录引物，用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl；③于pcr仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却；④依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mmdntps，1μl rna inhibitor和1μl反转录酶，用枪抽吸混匀；⑤于pcr仪上42℃保温1h，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

14、优选的，所述定量pcr处理包括以下步骤：①取0.2mlpcr管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管：2×qpcr mix 12.5μl、7.5μm基因引物2.0μl、反转录产物2.5μl、ddh2o 8.0μl；②pcr扩增：预变性95℃，10min，循环(40次)95℃，15s→60℃,60s，溶解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃。

15、优选的，所述采用2-△△ct方法分析，ct值为目标扩增产物到设定阈值所经历的循环数，将3个复孔数值差异大的样本删除，用以减少误差，△ct＝ct(目的基因)-ct(内参基因)，△△ct＝△ct(实验样本)-ct(对照样本)，表达倍数＝2-△△ct。

16、优选的，所述在处理检测结果时，采用spss17.0统计软件进行处理，检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的数据以表示，两组间比较用t检验；不符合正态分布的数据采用非参数检验法，两组间比较用mann-whitney u检验；双变量的相关性分析，服从正态分布用pearson相关分析，不符合正态分布则用等级相关分析，p<0.05设定为数据差异有统计学意义。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、本发明以mir-223-3p和mir-223-5p作为生物标志物，通过qrt-pcr检测患者血清、卵泡液或颗粒细胞中mir-223-3p或mir-223-5p的表达量，结合患者的临床指标数据来诊断患者是否患有多囊卵巢综合征；本发明对患者是否患有多囊卵巢综合征的诊断具有较高的准确率，为其中医证候诊断的标准化提供理论依据。

19、上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。