抗猴痘病毒的抗体或其抗原结合片段及其应用的制作方法

本发明涉及抗体，尤其是涉及抗猴痘病毒的抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术：

1、猴痘是由猴痘病毒引起一种病毒性人畜共患病。猴痘病毒（monkeypox virus，mpxv）属痘病毒科，正痘病毒属，与其同属的还有天花病、痘苗病毒和牛痘病毒等。血清学研究表明历史天花疫苗（mva-bn疫苗）诱导低水平的猴痘病毒中和抗体，不能为高危人群提供完全的保护。而目前还尚无针对mpxv感染的特异性疫苗或药物。因此，开发一种能够有助于预防猴痘病毒感染的抗体非常重要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗痘病毒的抗体或其抗原结合片段，对m1r蛋白具有很好的亲和力，对猴痘病毒和痘苗病毒都具有很好的中和活性。

2、本发明还提供一种重组蛋白。

3、本发明还提供与上述抗体或其抗原结合片段、或重组蛋白相关的生物材料。

4、本发明还提供一种偶联物。

5、本发明还提供上述抗体或其抗原结合片段、上述重组蛋白、上述生物材料或上述偶联物的应用。

6、本发明还提供一种包含上述抗体或其抗原结合片段、上述重组蛋白、上述生物材料或上述偶联物的产品。

7、本发明还提供上述抗体或其抗原结合片段、或重组蛋白的制备方法。

8、根据本发明的第一方面实施例的抗痘病毒的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选自a1）至a9）中的任一种；且具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均分别含有互补决定区cdr1、cdr2、cdr3；

9、a1）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1中第26~33位、第51~58位、第97~110位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:2中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；

10、a2）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:5中第26~33位、第51~60位、第99~115位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:6中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；

11、a3）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:9中第26~33位、第51~58位、第97~109位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:10中第26~33位、第50~52位、第89~97位所示；

12、a4）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:13中第26~33位、第51~58位、第97~111位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:14中第27~32位、第50~52位、第89~96位所示；

13、a5）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:17中第26~33位、第51~58位、第97~103位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:18中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；

14、a6）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:21中第26~33位、第51~58位、第97~112位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:22中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；

15、a7）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:25中第26~33位、第51~59位、第97~112位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:26中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；

16、a8）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:29中第26~33位、第51~58位、第97~112位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:30中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；

17、a9）所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:33中第26~33位、第51~58位、第97~109位所示；所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:34中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示。

18、根据本发明实施例的抗体或其抗原结合片段，至少具有如下有益效果：

19、实施例的抗体或其抗原结合片段对m1r蛋白均具有很好的亲和力，且对反式互补缺陷猴痘病毒以及痘苗病毒（vacv）具有很好的中和活性，与其他mpxv表面蛋白特异性抗体混合使用时可更有效中和mpxv和vacv等正痘病毒，有望在未来的mpxv治疗中替代牛痘免疫球蛋白（vig）。实施例的抗体或其抗原结合片段不仅可用于m1r抗原蛋白、mpxv和vacv的检测，还可用于天花病毒、牛痘病毒、猴痘病毒以及痘苗病毒等正痘病毒感染治疗药物的开发。

20、根据本发明的一些实施例，a1）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

21、a111）如seq id no:1所示的氨基酸序列；或

22、a112）将seq id no:1经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

23、a113）与seq id no:1具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

24、a1）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

25、a121）如seq id no:2所示的氨基酸序列；或

26、a122）将seq id no:2经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

27、a123）与seq id no:2具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

28、a2）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

29、a211）如seq id no:5所示的氨基酸序列；或

30、a212）将seq id no:5经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

31、a213）与seq id no:5具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

32、a2）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

33、a221）如seq id no:6所示的氨基酸序列；或

34、a222）将seq id no:6经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

35、a223）与seq id no:6具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

36、a3）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

37、a311）如seq id no:9所示的氨基酸序列；或

38、a312）将seq id no:9经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

39、a313）与seq id no:9具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

40、a3）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

41、a321）如seq id no:10所示的氨基酸序列；或

42、a322）将seq id no:10经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

43、a323）与seq id no:10具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

44、a4）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

45、a411）如seq id no:13所示的氨基酸序列；或

46、a412）将seq id no:13经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:13所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

47、a413）与seq id no:13具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:13所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

48、a4）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

49、a421）如seq id no:14所示的氨基酸序列；或

50、a422）将seq id no:14经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

51、a423）与seq id no:14具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

52、a5）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

53、a511）如seq id no:17所示的氨基酸序列；或

54、a512）将seq id no:17经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

55、a513）与seq id no:17具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

56、a5）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

57、a521）如seq id no:18所示的氨基酸序列；或

58、a522）将seq id no:18经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

59、a523）与seq id no:18具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

60、a6）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

61、a611）如seq id no:21所示的氨基酸序列；或

62、a612）将seq id no:21经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:21所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

63、a613）与seq id no:21具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:21所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

64、a6）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

65、a621）如seq id no:22所示的氨基酸序列；或

66、a622）将seq id no:22经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:22所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

67、a623）与seq id no:22具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:22所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

68、a7）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

69、a711）如seq id no:25所示的氨基酸序列；或

70、a712）将seq id no:25经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

71、a713）与seq id no:25具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

72、a7）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

73、a721）如seq id no:26所示的氨基酸序列；或

74、a722）将seq id no:26经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

75、a723）与seq id no:26具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

76、a8）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

77、a811）如seq id no:29所示的氨基酸序列；或

78、a812）将seq id no:29经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

79、a813）与seq id no:29具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

80、a8）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

81、a821）如seq id no:30所示的氨基酸序列；或

82、a822）将seq id no:30经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

83、a823）与seq id no:30具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列;

84、a9）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：

85、a911）如seq id no:33所示的氨基酸序列；或

86、a912）将seq id no:33经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

87、a913）与seq id no:33具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

88、a9）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：

89、a921）如seq id no:34所示的氨基酸序列；或

90、a922）将seq id no:34经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

91、a923）与seq id no:34具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

92、根据本发明的一些实施例，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区；

93、所述重链恒定区的氨基酸序列包含：

94、b11）如seq id no:37所示的氨基酸序列；或

95、b12）将seq id no:37经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:37所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

96、b13）与seq id no:37具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:37所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

97、所述轻链恒定区的氨基酸序列包含：

98、b21）如seq id no:38所示的氨基酸序列；或

99、b22）将seq id no:38经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seq id no:38所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

100、b23）与seq id no:38具有80%、85%或90%以上的同源性，且与seq id no:38所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

101、本文中，术语“同源性”指氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似性。同源性可以通过计算机软件进行评价。

102、本文中，所述至少80%同源性可以为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。

103、根据本发明的一些实施例，所述抗体或其抗原结合片段选自fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、双体、融合抗体和完整抗体中的任一种。

104、根据本发明的第二方面实施例的一种重组蛋白，包含标签以及上述抗体或其抗原结合片段。所述标签可以连接在所述抗体或其抗原结合片段的n端或/和c端。所述标签可以为利于所述抗体或其抗原结合片段的溶解和/或纯化的标签。

105、根据本发明的一些实施例，所述标签包括his标签、gggs序列、flag标签、strep标签、nus标签、麦芽糖结合蛋白、gst标签中的至少一种。本发明的重组蛋白可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。

106、根据本发明的第三方面实施例的与上述抗体或其抗原结合片段、或上述重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料为c1）至c5）中的任一种；

107、c1）编码上述抗体或其抗原结合片段、或上述重组蛋白的核酸分子；

108、c2）含有c1）中所述核酸分子的表达盒；

109、c3）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒的重组载体；

110、c4）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒或c3）中所述重组载体的重组微生物；

111、c5）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒或c3）中所述重组载体的转基因细胞系。

112、根据本发明的一些实施例，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

113、根据本发明的一些实施例，所述核酸分子为编码上述抗体或其抗原结合片段、或上述重组蛋白的dna分子。

114、根据本发明的一些实施例，所述dna分子为d1）至d10）中的任一种，且包含编码所述重链可变区的核苷酸序列和编码所述轻链可变区的核苷酸序列；

115、d1）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:3所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:4所示；

116、d2）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:7所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:8所示；

117、d3）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:11所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:12所示；

118、d4）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:15所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:16所示；

119、d5）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:19所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:20所示；

120、d6）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:23所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:24所示；

121、d7）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:27所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:28所示；

122、d8）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:31所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:32所示；

123、d9）编码所述重链可变区的核苷酸序列如seq id no:35所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:36所示；

124、d10）与d1）至d9）中任一限定的核苷酸序列具有80%、85%或90%以上的同源性，且编码所述抗体或其抗原结合片段的dna分子；

125、d11）在严格条件下与d1）至d10）中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗体或其抗原结合片段的dna分子。

126、本领域技术人员可以采用已知的方法（如定向进化和点突变）对核苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰的，具有与本发明所述抗体或其抗原结合片段具有一定同源性的核苷酸序列，只要编码所述抗体或其抗原结合片段或变体并且具有所述抗体或其抗原结合片段相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列。

127、根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段的dna，该dna不但可以包括启动编码所述抗体或其抗原结合片段的dna分子转录的启动子，还可包括终止编码所述抗体或其抗原结合片段的dna分子转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括复制起始位点、转录起始序列、增强子序列、选择元件或报告基因。

128、根据本发明的一些实施例，所述重组载体可为质粒、噬菌体、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒。所述重组载体用于实现外源目的基因在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达；其可以为克隆载体，也可以为表达载体。例如：c3）中所述重组载体具体可以为将所述核酸分子插入cmv载体得到的重组质粒。

129、根据本发明的一些实施例，所述重组微生物可为细菌（如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等）或真菌（如酵母或曲霉菌等）。例如：c4）中所述重组微生物具体可以为大肠杆菌dn5α。

130、根据本发明的一些实施例，所述转基因细胞系可为昆虫细胞（如s2果蝇细胞或sf9细胞等）、动物细胞系（如293t细胞、293f细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞或hek293细胞等）或植物细胞（如拟南芥或烟草等）。所述转基因细胞系均可为非繁殖材料。

131、根据本发明的第四方面实施例的一种偶联物，包含：上述抗体或其抗原结合片段，或上述重组蛋白；

132、以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、放射性核素、酶中的至少一种。

133、根据本发明的一些实施例，所述可检测标记物选自放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质中的至少一种。

134、根据本发明的第五方面实施例的上述抗体或其抗原结合片段、上述重组蛋白、上述生物材料或上述偶联物在e1）至e5）任一项中的应用；

135、e1）制备预防和/或治疗痘病毒的药物；

136、e2）非诊断治疗目的地检测痘病毒；

137、e3）制备检测痘病毒的试剂盒；

138、e4）非诊断治疗目的地检测猴痘病毒m1r蛋白；

139、e5）制备检测猴痘病毒m1r蛋白的试剂盒；

140、所述痘病毒包括猴痘病毒、痘苗病毒中的至少一种。

141、根据本发明的第六方面实施例的产品，包括f1）至f4）中的至少一种；

142、f1）上述抗体或其抗原结合片段；

143、f2）上述重组蛋白；

144、f3）上述生物材料；

145、f4）上述偶联物；

146、所述产品选自药物、试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒的至少一种。

147、根据本发明的一些实施例，所述产品具有g1）至g3）中至少一种功能；

148、g1）预防和/或治疗痘病毒感染相关疾病；

149、g2）检测痘病毒的存在或其含量；

150、所述痘病毒包括猴痘病毒、痘苗病毒中的至少一种；

151、g3）检测猴痘病毒m1r蛋白的存在或其含量。

152、根据本发明的一些实施例，所述产品为药物；所述产品还包括药学上可以接受的辅料。其所用剂量对接受者无毒。

153、根据本发明的一些实施例，所述辅料包括溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、等张剂、调味剂、载体中的至少一种。所述辅料用于促进所述抗体或其抗原结合片段的吸收，以发挥预防和/或治疗作用。

154、根据本发明的第七方面实施例的抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括以下步骤：

155、通过培养上述重组微生物或转基因细胞系得到。

156、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。