一种富集铁氨氧化功能菌群的方法及其应用

本发明属于微生物，涉及一种富集铁氨氧化功能菌群的方法及其应用。

背景技术：

1、环境中氨氮超标会导致水体富营养化，使本已脆弱的水资源系统遭受更加严峻的挑战。重金属污染具有潜伏期长、毒性大、难去除和可在食物链中被富集吸收等特点，对人类和动植物都有较大的危害。以我国南方离子型稀土矿区为例，现有的原位开采模式往往会投加过量硫酸铵作为浸矿剂，开采过程中残留于山体中的硫酸铵会通过淋滤和渗透等作用污染矿区及周边环境。除此之外，原地浸矿采矿模式致使稀土矿体内部重金属元素的赋存形态发生转化，其迁移特性及其生物有效性随之发生改变，造成重金属元素在母液或外围土体中逐渐富集，继而导致矿区及周边水体和土壤严重的重金属污染。因此，氨氮和重金属污染已成为稀土产业绿色发展的两大危害。

2、传统微生物脱氮途径主要有硝化作用、反硝化作用和厌氧氨氧化作用，具有安全性高、适用性强、处置成本低以及无二次污染等优点，但仍然存在处理工艺流程长、处理速率偏低等问题。随着对氮循环研究的深入，在微生物厌氧氨氧化与fe(iii)还原耦合的过程中，科研人员发现了一种新的氮循环的途径——铁氨氧化(anaerobic ammoniumoxidation coupled to iron reduction,feammox)，它是指在厌氧条件下，铁氨氧化类微生物以三价铁为电子受体，将氨氮作为电子供体，在缺氧条件下生成亚硝酸盐、硝酸盐或氮气等，同时还原三价铁为二价铁的生化反应过程，铁氨氧化过程产生的fe(ii)与发生铁盐反硝化从而可以实现fe(ⅱ)/fe(ⅲ)的循环。相关研究在不同环境和生态系统中广泛开展，以富集feammox微生物。如热带高地土壤，水稻土，森林河岸湿地，潮间带湿地，农业土壤和废水处理系统。

3、feammox已被证明在全球氮循环中起重要作用，特别是在富含fe(ⅲ)的土壤或湿地等厌氧环境中。同时，与feammox过程相关的微生物介导的异化铁还原过程也是重要的生物地球化学过程，相关微生物诱导生成的次生铁矿有独特的形态和特征，如纳米颗粒、高表面积和高反应活性，这些矿物特征对土壤重金属形态转化起到重要作用。与异化铁还原微生物类似，铁氨氧化以fe(iii)为电子受体，并将fe(iii)还原成fe(ii)，微生物的异化还原fe(iii)过程能够影响一些重金属元素的价态形式，转化污染物，达到治理重金属污染的目的。铁氨氧化相关微生物可以还原fe(iii)矿物质，这一过程伴随着fe(iii)和fe(ii)的循环，可能成为离子型稀土矿山中重金属固定化的有效途径之一。

4、尽管如此，对feammox功能微生物驱动氮素转变和固定重金属的研究较少，对其菌的富集和培养及应用研究鲜有。究其原因，feammox作为一种新兴的厌氧微生物，其富集培养存在一定难度，可供参考的案例和方法不多。有别于厌氧氨氧化、硝化、反硝化功能微生物，feammox功能微生物伴随的是一种全新的氮素转变途径。同样地，有别于异化铁还原，不需要h2、有机酸等作电子供体，在利用氨氮的同时实现异化铁还原过程，但其机制并不明确，因此对其培养有极大难度。

5、cn111979144a公布了一种筛选厌氧氨氧化菌的方法，该方法以土壤悬浊液的厌氧培养为初步富集阶段，二次富集时添加氯化铵及铁氧化物的培养基，随后设计了连续流厌氧培养模式，通过底部设置滤膜控制截留菌种的流出，对厌氧铁氨氧化菌做长期的定向富集培养。而本发明不需要设计该模式，通过转接小型培养瓶即可实现定向富集培养。

6、cn115975903 a公布了一种甲烷氧化菌群的富集驯化及应用方法，该方法通过对富甲烷环境样品中微生物进行富集活化获得甲烷氧化菌群富集液，再通过稻田土壤上清液和nms培养基混合制成的稻田驯化培养液进行驯化培养，在驯化培养期间逐级提高稻田驯化培养液中稻田上清液的体积比，以逐步提高其对稻田环境的适应性，制备得到甲烷氧化菌群。本发明不需要改变培养基成分及比例即可高效稳定获取厌氧铁氨氧化功能微生物，在此基础上，通过逐步提高培养基中重金属的添加量实现不同浓度重金属的耐受性驯化过程。

7、cn106698676 b公布了一种甲烷氧化耦合高氯酸盐还原菌群的富集方法及应用，该方法包括初始菌群的接种和引入添加了clo4-的无机培养基的反应阶段，即富集了能降解高氯酸盐的菌群。该发明在第一阶段需要以2天一次、连续40天供给无机培养基，步骤繁琐冗长，同时在第二阶段需要提供甲烷气体作为碳源，为异养型微生物。而本发明培养基不需要频繁更换和供给，不需要外加碳源，筛选所得厌氧铁氨氧化功能菌群为自养型。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种富集铁氨氧化功能菌群的方法及其应用。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种富集铁氨氧化功能菌群的方法，所述方法包括：

4、(1)将样品进行预处理，与去离子水混合，得到第一混合液；

5、(2)将第一混合液与培养基混合，进行第一次富集培养，得到第一培养液，所述第一培养液的铁还原率为50％以上，氨氧化率为10％以上；

6、(3)将第一培养液与培养基混合，进行第二次富集培养，即得。

7、所述铁还原能力可以为50％、55％、60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％等，氨氧化率可以为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

8、本发明提供的铁氨氧化功能菌群及其应用方法，不仅对环境修复具有重要的实际意义，还能有效促进氨氮的氧化和重金属的固定，且具有操作简便、成本低廉等优点。本发明的目的是提供一种高效稳定筛选出具备氨氮转化和重金属固定的铁氨氧化功能菌群的方法。该功能菌群能够利用土壤中的氨氮作为氮来源，以及铁氧化物作为铁源，自发地实现氨氮的氧化以及铁氧化物的还原。其筛选及驯化方法高效稳定，可以为南方离子型稀土矿区土壤氨氮和重金属污染的协同治理提供理论支撑。

9、优选地，所述预处理包括：将样品于2-6℃在黑暗条件下保存15-30天。

10、所述温度可以选择2℃、3℃、4℃、5℃、6℃等，所述时间可以选择15天、18天、20天、22天、25天、28天、30天等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

11、优选地，所述与去离子水混合的时间为22-26h，例如22h、23h、24h、25h、26h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

12、优选地，所述培养基包括nh4cl 176.7-177.3mg/l、(nh4)2so477.6-78.2mg/l、nahco319.5-20.2mg/l、khco370.7-71.3mg/l、kh2po48.7-9.3mg/l、mgso4·7h2o 99.7-100.3mg/l、cacl2·2h2o 59.7-60.3mg/l、微量元素0.7-1.3mg/l和维生素0.7-1.3mg/l、水铁矿29.7-30.3mmol/l和水。

13、所述nh4cl的浓度可以选择176.7mg/l、176.8mg/l、176.9mg/l、177mg/l、177.1mg/l、177.2mg/l、177.3mg/l等，所述(nh4)2so4的浓度可以选择77.6mg/l、77.7mg/l、77.8mg/l、77.9mg/l、78mg/l、78.1mg/l、78.2mg/l等，所述nahco3的浓度可以选择19.5mg/l、19.6mg/l、19.7mg/l、19.8mg/l、19.9mg/l、20mg/l、20.1mg/l、20.2mg/l等，所述khco3的浓度可以选择70.7mg/l、70.8mg/l、70.9mg/l、71mg/l、71.1mg/l、71.2mg/l、71.3等，所述kh2po4的浓度可以选择8.7mg/l、8.8mg/l、8.9mg/l、9mg/l、9.1mg/l、9.2mg/l、9.3mg/l等，所述mgso4·7h2o的浓度可以选择99.7mg/l、99.8mg/l、99.9mg/l、100mg/l、100.1mg/l、100.2mg/l、100.3mg/l等，所述cacl2·2h2o的浓度可以选择59.7mg/l、59.8mg/l、59.9mg/l、60mg/l、60.1mg/l、60.2mg/l、60.3mg/l等，所述微量元素的浓度可以选择0.7mg/l、0.8mg/l、0.9mg/l、1mg/l、1.1mg/l、1.2mg/l、1.3mg/l等，所述维生素的浓度可以选择0.7mg/l、0.8mg/l、0.9mg/l、1mg/l、1.1mg/l、1.2mg/l、1.3mg/l等，所述水铁矿的浓度可以选择29.7mmol/l、29.8mmol/l、29.9mmol/l、30mmol/l、30.1mmol/l、30.2mmol/l、30.3mmol/l等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

14、优选地，所述微量元素包括n(ch2cooh)31.2-1.8mg/l、mgso4·7h2o 2.7-3.3mg/l、mnso4·h2o 0.2-0.8mg/l、nacl 0.7-1.3mg/l、cocl2·6h2o 0.1-0.2mg/l、znso4·7h2o0.1-0.2mg/l、cuso4·5h2o 0.01-0.04mg/l、alk(so4)2·12h2o 0.01-0.04mg/l、h3bo30.01-0.04mg/l、na2moo40.025-0.03mg/l、nicl2·6h2o 0.024-0.026mg/l、na2wo4·2h2o 0.025-0.03mg/l、cacl2·2h2o 0.1-0.2mg/l、feso4·7h2o 0.1-0.2mg/l。

15、所述n(ch2cooh)3的浓度可以选择1.2mg/l、1.3mg/l、1.4mg/l、1.5mg/l、1.6mg/l、1.7mg/l、1.8mg/l等，所述mgso4·7h2o的浓度可以选择2.7mg/l、2.8mg/l、2.9mg/l、3mg/l、3.1mg/l、3.2mg/l、3.3mg/l等，所述mnso4·h2o的浓度可以选择0.2mg/l、0.3mg/l、0.4mg/l、0.5mg/l、0.6mg/l、0.7mg/l、0.8mg/l等，所述nacl的浓度可以选择0.7mg/l、0.8mg/l、0.9mg/l、1mg/l、1.1mg/l、1.2mg/l、1.3mg/l等，所述cocl2·6h2o的浓度可以选择0.1mg/l、0.12mg/l、0.14mg/l、0.16mg/l、0.18mg/l、0.2mg/l等，所述znso4·7h2o的浓度可以选择0.1mg/l、0.12mg/l、0.14mg/l、0.16mg/l、0.18mg/l、0.2mg/l等，所述cuso4·5h2o的浓度可以选择0.01mg/l、0.02mg/l、0.03mg/l、0.04mg/l等，所述alk(so4)2·12h2o的浓度可以选择0.01mg/l、0.02mg/l、0.03mg/l、0.04mg/l等，所述h3bo3的浓度可以选择0.01mg/l、0.02mg/l、0.03mg/l、0.04mg/l等，所述na2moo4的浓度可以选择0.025mg/l、0.026mg/l、0.027mg/l、0.028mg/l、0.029mg/l、0.03mg/l等，所述nicl2·6h2o的浓度可以选择0.024mg/l、0.025mg/l、0.026mg/l等，所述na2wo4·2h2o的浓度可以选择0.025mg/l、0.026mg/l、0.027mg/l、0.028mg/l、0.029mg/l、0.03mg/l等，所述cacl2·2h2o的浓度可以选择0.1mg/l、0.12mg/l、0.14mg/l、0.16mg/l、0.18mg/l、0.2mg/l等，所述feso4·7h2o的浓度可以选择0.1mg/l、0.12mg/l、0.14mg/l、0.16mg/l、0.18mg/l、0.2mg/l等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

16、优选地，所述维生素包括维生素h1.7-2.3mg/l、维生素b24.7-5.3mg/l、核黄素4.7-5.3mg/l、维生素b69.7-10.3mg/l、维生素b14.7-5.3mg/l、烟酸0.01-0.02mg/l、维生素b34.7-5.3mg/l、维生素b120.1-0.2mg/l、对氨基苯甲酸4.7-5.3mg/l、硫辛酸4.7-5.3mg/l。

17、所述维生素h的浓度可以选择1.7mg/l、1.8mg/l、1.9mg/l、2mg/l、2.1mg/l、2.2mg/l、2.3mg/l等，所述维生素b2的浓度可以选择4.7mg/l、4.8mg/l、4.9mg/l、5mg/l、5.1mg/l、5.2mg/l、5.3mg/l等，所述核黄素的浓度可以选择4.7mg/l、4.8mg/l、4.9mg/l、5mg/l、5.1mg/l、5.2mg/l、5.3mg/l等，所述维生素b6的浓度可以选择9.7mg/l、9.8mg/l、9.9mg/l、10mg/l、10.1mg/l、10.2mg/l、10.3mg/l等，所述维生素b1的浓度可以选择4.7mg/l、4.8mg/l、4.9mg/l、5mg/l、5.1mg/l、5.2mg/l、5.3mg/l等，所述烟酸的浓度可以选择0.01mg/l、0.012mg/l、0.014mg/l、0.016mg/l、0.018mg/l、0.02mg/l等，所述维生素b3的浓度可以选择4.7mg/l、4.8mg/l、4.9mg/l、5mg/l、5.1mg/l、5.2mg/l、5.3mg/l等，所述维生素b12的浓度可以选择0.1mg/l、0.12mg/l、0.14mg/l、0.16mg/l、0.18mg/l、0.2mg/l等，等，所述对氨基苯甲酸的浓度可以选择0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l、0.4mg/l等，所述硫辛酸的浓度可以选择0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l、0.4mg/l等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

18、优选地，所述水铁矿由下述制备方法制得：将三价铁盐与碱混合，调节ph，离心，即得。

19、优选地，所述培养基的ph为4.5-5.0，例如4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

20、优选地，所述进行第二次富集培养后，所得培养液的的铁还原能力为80％以上，氨氧化率为20％以上。

21、所述铁还原能力可以为80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％等，所述氨氧化率可以为20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％、40％等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

22、优选地，步骤(2)中第一混合液与培养基的体积比为(1-2):(3-5)。

23、其中(1-2)中的具体点值均可选择1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等，(3-5)中的具体点值均可选择3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

24、优选地，步骤(3)中第一培养液与培养基的体积比为(1-2):(3-5)。

25、其中(1-2)中的具体点值均可选择1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等，(3-5)中的具体点值均可选择3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

26、第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的富集铁氨氧化功能菌群的方法富集得到的菌群。

27、第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述的菌群在重金属污染修复中的应用。

28、优选地，所述重金属包括铅、镉或铬中的任意一种或至少两种的组合。

29、优选地，所述应用的具体方法包括：

30、(1)将菌群与低镉溶液混合，培养，得到第一混合液；

31、(2)将第一混合液与高镉溶液混合，培养。

32、优选地，所述低镉溶液中镉的浓度为0.02-0.06mg/kg，例如0.02mg/kg、0.025mg/kg、0.03mg/kg、0.035mg/kg、0.04mg/kg、0.045mg/kg、0.05mg/kg、0.055mg/kg、0.06mg/kg等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

33、优选地，所述高镉溶液中镉的浓度为0.15-0.2mg/kg，例如0.15mg/kg、0.16mg/kg、0.17mg/kg、0.18mg/kg、0.19mg/kg、0.2mg/kg等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

34、优选地，步骤(1)所述培养的时间为35-40天，例如35天、36天、37天、38天、39天、40天等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

35、优选地，步骤(2)所述培养的时间为45-50天，例如45天、46天、47天、48天、49天、50天等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

36、(1)本发明所获得的厌氧铁氨氧化功能菌群经过富集驯化后，具有稳定高效的铁还原能力和氨氧化能力，同时其诱导次生成矿过程明显，生成的次生铁矿物质结晶度高，采用jade6软件，用以下公式进行计算：结晶度＝sc/(sc+sa)，其中，sc、sa分别为矿物对应的晶态和无定形态的面积，最终算出在第0天，26天和53天的结晶度分别为0.00％，77.27％和79.32％。

37、(2)本发明的培养及筛选方法能够有效解决现有技术中厌氧铁氨氧化功能微生物富集培养困难的问题，以提供一种厌氧铁氨氧化菌的富集和培养研究方式。

38、(3)本发明所筛选的厌氧铁氨氧化菌群能够高效去除氨氮的同时固定重金属，具有生态环保、成本低、有效期长、效果稳定等优点，可用于土壤中的氨氮和重金属复合污染的协同修复。具体来说，85天培养周期内氨氧化率为23.25％，随着feammox功能菌群生长富集，fe(ⅱ)含量显著上升，且第二代铁还原率明显高于第一代，铁还原率为：第一代31.93％，第二代83.24％。对于重金属固定效果来说，在s1驯化阶段，cd的去除率在86.57％～100％间，在s2驯化阶段，cd的去除率在99.29％～100％间。

39、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

40、1.微生物群体的特异性和效能：

41、本发明识别了一组具有高效氨氮氧化和铁还原能力的微生物群体，包括间孢囊菌属、无色芽孢杆菌属等。这些微生物不仅能够氧化氨氮，还能还原铁，进而固化重金属，这在环境修复领域是一个重大突破。

42、2.富集和筛选方法的创新：

43、发明中描述的富集和筛选方法是针对这些特定微生物的。它包括多阶段的培养过程，逐步提高微生物的氨氮氧化和铁还原能力，这种方法在微生物学和环境工程领域是创新的。

44、3.环境适应性和应用范围：

45、本发明特别适用于处理稀土矿区等特定环境的氨氮和重金属污染。这种方法的应用范围广泛，可以用于土壤和底泥的修复，提供了一种新的环境修复策略。

46、4.环境修复效率的提升：

47、与传统的微生物脱氮途径相比，本发明提供的方法在处理速率和效率上有显著提升，特别是在处理重金属污染方面。

48、5.技术简化和成本效益：

49、本发明简化了培养和筛选流程，与现有技术相比，更加高效且成本效益更高。这对于大规模的环境修复项目尤其重要。

50、6.对全球氮循环的潜在影响：

51、铁氨氧化过程在全球氮循环中可能起着重要作用，尤其是在富含fe(iii)的土壤或湿地等厌氧环境中。本发明的应用可能对全球氮循环产生重要影响。

52、7.土壤重金属形态转化：

53、与异化铁还原微生物类似，铁氨氧化过程中的fe(iii)还原可能对土壤中重金属元素的价态形式和转化产生影响，这对于理解和处理土壤中的重金属污染至关重要。

54、8.创新的重金属固定化途径：

55、本发明提供了一种新的重金属固定化途径，这对于处理重金属污染具有重要意义，尤其是在难以处理的稀土矿区环境中。

56、总体而言，本发明在微生物学、环境工程和土壤科学领域提供了一种创新的方法，不仅能有效处理特定环境中的氨氮和重金属污染，还可能对全球氮循环和土壤重金属形态转化产生重要影响。