利用亚硫酸氢盐转化DNA的方法与流程

本发明属于基因检测，更具体地，本发明涉及一种利用亚硫酸氢盐转化dna的方法、以及一种检测dna甲基化水平的方法。

背景技术：

1、遗传学是研究由于dna序列的直接改变而引起的基因活性或功能的遗传变化，包括点突变、缺失、插入和易位。相比之下，表观遗传学是指研究基因活性或功能的可遗传性变化，表观遗传机制介导了多细胞生物中多种细胞和组织的多样化基因表达谱，而dna甲基化作为表观遗传的一种主要修饰，是dna上化学修饰的一种，可在不改变dna序列的条件下，使遗传表型发生了变化。

2、dna甲基化是由一个dna甲基转移酶(dnmts)来催化的，甲基转移酶将一个甲基从s-腺苷基蛋氨酸(sam)转移到胞嘧啶残基的第五个碳，形成5mc，一般发生在cpg位点。在人基因组中，90％以上的cpg位点是被甲基化的，但是cpg岛甲基化程度通常很低，这种情况下，不影响蛋白结合到dna的启动子区域来启动转录，进而使基因表达，当cpg岛被异常甲基化时，可导致转录沉默。dna甲基化对基因表达的调控可以作为一个分子开关，对于转录调控、调节组织特异性基因表达、基因组印迹和x染色体失活至关重要，不同基因组区域的dna甲基化可能会根据潜在的基因序列对基因活性产生不同的影响。

3、癌细胞主要表现特征为整体范围地失去甲基化遗传学修饰，反而增强子和启动子区域内出现异常的甲基化位点。这种甲基化分布的改变，导致了肿瘤抑癌基因的表达受抑制，并伴随着原癌基因表达的增加，从而进一步推动了肿瘤的发生、发展。

4、由于dna甲基化在调控生物学活动中的重要功能，研发出特异性检测甲基化位点的技术具有重要的意义。5-甲基胞嘧啶(5mc)与非甲基化的胞嘧啶(c)只存在一个甲基的差异，并不影响与鸟嘌呤进行正常的碱基互补配对，因此，常规的聚合酶链式扩增技术和测序技术无法直接检测到甲基化的胞嘧啶。

5、目前，对于dna甲基化的检测，大部分所用的技术是亚硫酸氢盐转化处理，转化dna的原理即：在亚硫酸氢盐的作用下，dna上正常的胞嘧啶(c)脱氨基被转变成尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶(5mc)则保持不变，5mc与c碱基就可以通过化学处理产生变化使得原来的序列发生改变；由于尿嘧啶与胸腺嘧啶(t)的结构相似，在pcr反应及测序过程中会被识别为t，而发生甲基化的胞嘧啶位点仍会保持为c碱基，这样就实现了对dna序列上5-甲基胞嘧啶的精准检测。基于亚硫酸氢盐的技术原理，已经开发了甲基化特异性pcr(msp)、甲基化敏感性高分辨率熔解技术(ms-hrm)、靶向亚硫酸氢盐测序及全基因组亚硫酸氢盐测序(wgbs)等技术。

6、基于亚硫酸氢盐转化处理来检测dna甲基化状态的方法仍是表观遗传学研究的“金标准”，在临床诊断的应用上也被广泛使用。但是传统的亚硫酸氢盐转化过程也存在一些问题：(1)转化时间较长，长时间的变温转化过程导致dna发生降解，从而造成大量dna损失，使得回收率降低；(2)市面上现有的转化试剂盒并没有dna保护试剂或dna保护试剂对转化过程的dna降解所起的作用有限。

7、转化效率指的是转化后未被甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶的比例，转化不完全容易导致假阳性，或者纯化回收的效率低也会导致结果不理想。亚硫酸氢盐转化法的效率容易受到亚硫酸氢盐浓度、dna保护试剂、脱磺回收等方面的影响，因此市面上的转化试剂也良莠不齐，另外高浓度的亚硫酸氢盐容易导致dna链降解。

8、因此，提供一种转化率高、转化时间短、dna回收率高的转化方法，非常有意义。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种利用亚硫酸氢盐转化dna的方法和检测甲基化水平的方法，采用本发明的转化dna方法，转化率高、转化时间短。

2、实现上述发明目的的技术方案包括如下。

3、本发明的第一方面，提供了一种利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，包括以下步骤：

4、(1)、在没食子酸溶液中加入亚硫酸氢钠、亚硫酸铵和亚硫酸氢铵，再加入1,4-二氧六环，得到亚硫酸氢盐转化液；所述亚硫酸氢盐转化液中，亚硫酸氢钠的浓度为3～7m，亚硫酸铵的浓度为0.5～1.5m，亚硫酸氢铵的浓度为5～20wt％；所述1,4-二氧六环占亚硫酸氢盐转化液体积的25％～35％；

5、(2)、在步骤(1)的亚硫酸氢盐转化液中加入待转化dna，涡旋震荡混匀后进行转化反应；所述转化反应程序为：95-98℃5-15min，85-95℃10-20min，50-70℃30s-3min。

6、本发明的第二方面，提供了一种检测dna甲基化水平的方法，包括以下步骤：按上述方法转化dna后，95±1℃孵育1～3min，再进行单链建库；对单链建库得到的文库进行二代测序，计算dna转化率。

7、本发明具有以下有益效果：

8、在本发明中，通过选择合适浓度的亚硫酸氢钠、亚硫酸铵和亚硫酸氢铵作为亚硫酸氢盐转化液的主要成分，并在亚硫酸氢盐转化液中加入没食子酸和1,4-二氧六环作为dna转化保护剂，同时精心设计dna转化的反应程序，在以上这些构思的共同作用下，本发明利用亚硫酸氢盐转化dna的转化率高(与现有市面上认可度较高的甲基化检测试剂盒转化率相当或更高)、转化时间短(仅需要20～30min即可完成转化)、有效减少dna降解。

9、在利用亚硫酸氢盐完成dna转化后，本发明还提出了一套纯化转化产物的方法，可以明显提高dna的回收率。

10、此外，在检测dna甲基化水平时，本发明的发明人发现，与双链建库二代测序相比，采用单链建库进行二代测序的方法具有转化率更高的优点。

技术特征：

1.一种利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，步骤(1)中所述没食子酸溶液的浓度为95mm～105mm，优选为99mm～101mm。

3.根据权利要求1所述的利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，步骤(1)中所述1,4-二氧六环占亚硫酸氢盐转化液体积的28％～32％；优选为29％～31％。

4.根据权利要求1所述的利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，步骤(1)中所述亚硫酸氢盐转化液中，亚硫酸氢钠的浓度为3～6m，亚硫酸铵的浓度为0.5～1.2m，亚硫酸氢铵的浓度为5～15wt％；优选地，所述亚硫酸氢盐转化液中，亚硫酸氢钠的浓度为3～5m，亚硫酸铵的浓度为0.5～1.0m，亚硫酸氢铵的浓度为5～10wt％；更优选地，所述亚硫酸氢盐转化液中，亚硫酸氢钠的浓度为4.5～5m，亚硫酸铵的浓度为0.8～1.0m，亚硫酸氢铵的浓度为8～10wt％。

5.根据权利要求1所述的利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，步骤(2)中所述待转化dna与亚硫酸氢盐转化液的体积比为1：6～7。

6.根据权利要求1所述的利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求1～6任一项所述的利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，步骤(2)转化反应后，还包括纯化的步骤，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的利用亚硫酸氢盐转化dna的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述转化反应后得到的转化产物、羟基磁珠与4～6m盐酸胍的体积比为3～4：1：18～20。

9.一种检测dna甲基化水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：按权利要求1～8任一项所述的方法转化dna后，95±1℃孵育1～3min，再进行单链建库；对单链建库得到的文库进行二代测序，计算dna转化率。

10.根据权利要求9所述的检测dna甲基化水平的方法，其特征在于，所述单链建库包括以下步骤：高温孵育结束后立即进行冰上降温，37±1℃孵育10～20min，再95±1℃孵育1～3min；合成单链dna互补链后，在延伸产物的5’端连接truncated t5 adapter，再利用高保真的dna聚合酶完成dna文库的扩增。

技术总结
本发明公开了一种利用亚硫酸氢盐转化DNA的方法，其是在包括亚硫酸氢钠、亚硫酸铵和亚硫酸氢铵的亚硫酸氢盐转化液中加入没食子酸和1,4‑二氧六环作为保护试剂，再加入待转化DNA，涡旋震荡混匀后进行转化反应。本发明利用亚硫酸氢盐转化DNA的转化率高、转化时间短、有效减少DNA降解，可以明显提高DNA的回收率。

技术研发人员：庄雪晴,欧小华,李浩基,陈嘉昌,胡朝晖,柳俊
受保护的技术使用者：广州市金圻睿生物科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27