一种基于催化发夹组装的用于miR-21检测的A-CHA系统及其应用

本发明涉及生物检测，特别是涉及一种基于催化发夹组装的用于mir-21检测的a-cha系统及其应用。

背景技术：

1、目前，癌症是导致人类疾病死亡的主要原因之一。癌症的诱因复杂，是遗传因素和环境因素相互作用的结果。在癌症的诊断与治疗中，早发现早治疗能够大大提高患者的五年生存率。例如乳腺癌患者的五年生存率接近90％，而远处转移患者的五年生存率仅为27％。近几年来，随着一些microrna、特异性抗原、表面蛋白等肿瘤生物标志物的发现，癌症早期诊断技术迅速发展。micrornas(mirnas)是一类长度为18-25nt的非编码单链rnas，已被证实在一些生理和病理过程中发挥着重要作用，包括胚胎发育、细胞分化、组织发育、细胞凋亡、肿瘤进展、病毒繁殖和细胞死亡。近年来，mirnas被认为是疾病诊断的重要肿瘤标志物，因为许多研究证据表明，各种人类疾病与mirnas表达失调之间存在密切关系。因此，mirnas进行快速、高效的临床检测需求渐增，对进一步研究mirnas的功能，进而作为肿瘤早期诊断和预后的诊断依据的需求迫切。

2、在过去的几十年里，传统的技术，包括northern blotting、基因芯片技术、聚合酶链式反应(pcr)和荧光原位杂交(fish)技术，已经被开发用于mirnas检测。然而，这些方法在实际分析中出现了明显的局限性，如northern blotting的敏感性差强人意，而基因芯片的开发和使用需要专业技术人员。pcr因其高灵敏度而成为体外和细胞内基因检测中最常用和最可靠的方法，也被公认为是金标准。但pcr技术面临着一个不可避免的事实：对mirna的定量检测需要经过逆转录步骤，步骤繁琐且专业要求高。在这种情况下，设计实现mirnas快速精准的扩增技术是非常必要的。等温扩增技术(iat)是一种革命性的核酸扩增工艺，能够快速有效地积累丰富的核酸序列。自20世纪90年代初以来，各种iats被广泛报道，称其为pcr的替代品，如链式置换扩增(sda)、滚环扩增(rca)、循环介导的等温扩增(l amp)和级联信号扩增反应(expar)，其中大部分已被应用于生化分析。特别是基于ch a的技术，作为一种序列确定的、长度合适的dna纳米线，已经成功设计出实现细胞内外m irnas的扩增。

3、2008年，张辰宇团队发现mirnas在包括唾液、尿液和母乳在内的细胞外生物体液中以稳定、无细胞形式循环，使得mirnas直接从生物体液样品中检测成为热点。但迄今为止，直接从生物体液样品中定量测定mirna的表达仍然面临着以下几个方面的挑战：(1)样品的收集和处理过程常常对循环核酸标志物的定量产生不可忽视的影响，使其无法进行直接比较；(2)内生mirna在个体中含量极低并且其绝对浓度在不同个体中存在严重的差异；(3)复杂的生物样品产生的严重背景干扰使得低丰度的mirna的定量相当困难。

4、传统的cha循环(命名为t-cha，原理如图1中(b)所示)不但信噪比和检测灵敏度低，特异性也较差，绝大部分cha反应对mirna单碱基错配的检测效果不佳，不能很好的区分靶标和单碱基错配的mirna，难以精准评估真实血清样品中的靶标。

5、考虑到上述情况，本发明以癌症生物标志物microrna-21(mir-21)为目标模型，拟开发一种基于发卡和cha反应介导的反馈系统(a-cha)，以实现mir-21的体外快速高效检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于催化发夹组装的用于mir-21检测的a-cha系统及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明设计的a-cha系统具有检测快速、高特异性和复杂环境高普适性的优点，可以实现早期肿瘤标志物mir-21的检测，使其成为早期疾病诊断的有用工具。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种基于催化发夹组装的用于mir-21检测的a-cha系统及其应用，所述a-cha系统包括p-3-a和p-3-b；

4、所述p-3-a是由四底座l1-a*、l2-a*、l3-a*和l4与发夹p2-a通过退火反应得到；

5、所述p-3-b是由四底座l1-b*、l2-b*、l3和l4-b*与发夹p1-bf通过退火反应得到；

6、所述l1-a*的核苷酸序列如seq id no.1所示；

7、所述l2-a*的核苷酸序列如seq id no.5所示；

8、所述l3-a*的核苷酸序列如seq id no.6所示；

9、所述l4的核苷酸序列如seq id no.4所示；

10、所述p2-a的核苷酸序列如seq id no.10所示；

11、所述l1-b*的核苷酸序列如seq id no.7所示；

12、所述l2-b*的核苷酸序列如seq id no.8所示；

13、所述l3的核苷酸序列如seq id no.3所示；

14、所述l4-b*的核苷酸序列如seq id no.9所示；

15、所述p1-bf的核苷酸序列如seq id no.12所示；

16、所述p1-bf的第22bp处碱基连接有荧光淬灭基团。

17、进一步地，所述荧光淬灭基团为bhq1。

18、本发明还提供上述的a-cha系统在制备用于外周血游离mir-21检测的产品中的应用。

19、进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。

20、本发明还提供一种用于外周血游离mir-21检测的产品，包括上述的a-cha系统。

21、进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。

22、进一步地，所述产品还包括1×pbs+12.5mm mg2+缓冲液。

23、本发明公开了以下技术效果：

24、本发明开发了一种基于cha反应的三发卡自反馈检测系统(a-cha)，展示了a-cha系统可应用于mirna快速和特异的荧光检测，该过程不需要额外的dna探针或聚合引物，引入靶标mirna后，即可启动信号转导过程和等温扩增。

25、本发明构建的a-cha平台在mirna检测方面具有几个独特的优势：

26、(i)a-cha设计和装配过程简单。直接退火即可完成组装，信号传递过程不需要任何额外的探针例如聚合引物。

27、(ii)a-cha具备较高的信噪比和检测灵敏度，a-cha系统的信噪比是t-cha系统的2倍，靶标mirna可检测到5.5fm。

28、(iii)a-cha具有极高的特异性。绝大部分cha反应对mirna单碱基错配的检测效果不佳，不能很好的区分靶标和单碱基错配的mirna，而本发明对非靶mirna可100％识别。

29、(iv)a-cha可以精准评估真实血清样品中的靶标。

30、总之，由于a-cha系统具有良好的检测性能、对复杂生物样品的适用性、简单的探针组装和快速的检测过程，有望在生物标志物的早期诊断中具有良好的应用潜力。