酮泛解酸羟甲基转移酶突变体、编码基因及应用

(一)本发明属于生物，具体涉及一种来源于谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体及其编码基因、含有该突变体基因的重组载体以及酮泛解酸羟甲基转移酶突变体在生成酮泛解酸和制备d-泛酸中的应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、酮泛解酸羟甲基转移酶(ketolytic acid hydroxymethyltransferase,kphmt,ec2.1.2.11)，是panb基因的表达产物，也是大肠杆菌w3110催化泛酸生物合成途径的关键步骤：底物α-酮异戊酸与5,10-亚甲基四氢叶酸在酮泛解酸羟甲基转移酶催化作用下反应生成酮泛解酸，该反应过程是可逆的。

2、d-泛酸，又称遍多酸或维生素b5，是一种水溶性维生素，d-泛酸的化学索引号(cas)为79-83-4，相对分子质量为219.23500，相对密度为1.266g/cm3，其化学式为ch2ohc(ch3)2chohconhch2ch2cooh，由泛解酸和β-丙氨酸组成。有旋光性，仅d型([α]＝+37.5°)有生物活性。消旋泛酸具有吸湿性和静电吸附性；纯游离泛酸是一种淡黄色粘稠的油状物，具酸性，易溶于水和乙醇，不溶于苯和氯仿，泛酸在酸、碱、光及热等条件下都不稳定。泛酸是脂肪酸合成类固醇所必需的物质；也可参与类固醇紫质、褪黑激素和亚铁血红素的合成；还是体内柠檬酸循环、胆碱乙酰化、合成抗体等代谢所必需的中间物。泛酸在体内可作用于正常的上皮器官如神经、肾上腺、消化道及皮肤，提高动物对病原体的抵抗力。泛酸也可以增加谷胱甘肽的生物合成从而减缓细胞凋亡和损伤。泛酸及其衍生物还可以减轻抗生素等药物引起的毒副作用，参与多种营养成分的吸收和利用。

3、现有的d-泛酸生产方法是化学-酶法，异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合，再添加氢氰酸，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到dl-泛解酸内酯，dl-泛解酸内酯经l-泛解酸内酯水解酶水解，留下d-泛解酸内酯，产生的l-泛解酸再经化学内酯、外消旋转为dl-泛解酸内酯。得到的d-泛解酸内酯与β-氨基丙酸钙缩合直接制得d-泛酸钙。综合考虑d-泛酸现有生产方法的回收率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵生产d-泛酸受到越来越多的关注。

4、大肠杆菌w3110中d-泛酸的生物合成途径(泛酸生物合成途径参见图1)需要四种酶的参与，包括酮泛解酸羟甲基转移酶(panb)，酮泛解酸还原酶(pane,ketopantoatereductase,ec 1.1.1.169)，泛酸合成酶(panc,pantothenate synthetase,ec 6.3.2.1)和l-天冬氨酸-α-脱羧酶(pand,aspartate decarboxylase,ec 4.1.1.11)。第一步：5,10-亚甲基四氢叶酸和α-酮异戊酸生成酮泛解酸，该反应由panb基因编码酮的泛解酸羟甲基转移酶催化，在大肠杆菌、尼度曲霉和伤寒沙门氏菌中已有功能鉴定。第二步：由pane基因编码的酮泛解酸还原酶，还原酮泛解酸生成泛解酸；泛酸生物合成的最后一步是由panc编码的泛酸合成酶催化的，该酶催化泛解酸和β-丙氨酸(由pand编码的天冬氨酸脱羧酶催化l-天冬氨酸生成)缩合生成泛酸。aileen rubi和d.m.downs认为由panb基因编码的酮泛解酸羟甲基转移酶催α-酮异戊酸与5,10-亚甲基四氢叶酸反应生成酮泛解酸，是合成d-泛酸的限速步骤(elevated levels of ketopantoate hydroxymethyltransferase(panb)lead toa physiologically significant coenzyme a elevation in salmonella entericaserovar typhimurium.[j].journal of bacteriology,2002,184(10))，通过加强panb基因的表达或提高酮泛解酸羟甲基转移酶的催化活力可提高泛酸的产量。

5、自上个世纪90年代开始，一些著名的化学制药公司basf、dsm和degussa ag等开始关注d-泛酸发酵法合成。miki hiroshi等人通过运用紫外诱变和亚硝基胍诱变技术与特殊培养基筛选相结合进行高产d-泛解酸菌株的选育，筛选得到一株高产d-泛酸的基因工程菌，通过外源添加β-丙氨酸在经过72h补料发酵后d-泛酸产量达65.4g/l(process forproducing d-pantoic acid and d-pantothenicacid or salts thereof:us 5932457[p].1999-08-03.)。rogers r.y ocum等人致力于构建高产d-泛酸的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，通过解除panbcd、ilvbnc、pane和ilvd的调控来增强d-泛酸合成，构建过表达panbd的质粒，能有效促进d-泛酸积累(microorganisms and processes forenhancedproduction of pantothenate.us 7291489[p].2007-11-06.)。显然，kphmt(panb)作为催化泛酸生物合成中的第一步，也是关键一步，起着重要的影响。从1957年起，mcintosh等人首次从大肠杆菌中提取得到kphmt粗酶，并于1993年由carol等人纯化该蛋白，对其进行了晶体结构研究。2002年，aileen rubio等人发现在来源于鼠伤寒沙门(salmonella enterica)的panb基因上游添加一个cg碱基对，使启动子的10和35个六聚体之间的间距达到了17bp的一致间距，导致泛操纵子转录增加。并且这种突变引起的panb过度表达，增加了泛酸和辅酶a合成的增加。2003年，florian schmitzberger等人对kphmt的晶体结构进行了详细的比较分析，并对其结构同系物进行了鉴定，表明kphmt的结构属于(β/α)8磷酸烯醇式丙酮酸/丙酮酸超家族(comparative analysis of the escherichiacoli ketopantoate hydroxymethyltransferase crystal structure confirms that itis a member of the(β/α)8phosphoenolpyruvate/pyruvate superfamily.[j].journalof bacteriology,2003,185(14))。

6、总体而言，目前报道的关于发酵法生产d-泛酸存在的问题是产量偏低，生产成本较高，不能达到规模化工业生产的要求。并且对于panb的研究较少，因此panb是一个有力的突破点。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明的目的是提供一种谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum atcc13032)来源的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体、编码基因、含有该突变体基因的重组载体，以及酮泛解酸羟甲基转移酶突变体在制备酮泛解酸和制备d-泛酸中的应用。该突变体对5,10-亚甲基四氢叶酸和α-酮异戊酸催化生成酮泛解酸的催化活力较野生酶有提高，可有效提高终产物d-泛酸的产量，降低了生产成本。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一种酮泛解酸羟甲基转移酶突变体，由seq id no:1所示氨基酸经点突变获得，所述点突变为：第24位谷氨酰胺突变为丙氨酸，且第27位丝氨酸突变为丙氨酸。

4、本发明还提供所述酮泛解酸羟甲基转移酶酶突变体的编码基因，含所述编码基因的重组载体以及由所述编码基因构建的工程菌，所述工程菌表达宿主通常为e.coli bl21(de3)。

5、本发明所述重组酮泛解酸羟甲基转移酶突变体是通过对野生型酮泛解酸羟甲基转移酶进行多个氨基酸的突变，通过过表达panb，提高其对α-酮异戊酸的催化活力进而提高泛酸的产率。

6、所述突变体获得方法如下：首先将野生型酮泛解酸羟甲基转移酶编码基因(seqid no.2)与表达载体pet28a(+)连接，构建重组表达质粒。然后将panb基因转化至表达宿主e.coli bl21(de3)中，得到含有酮泛解酸羟甲基转移酶基因的重组基因工程菌。以含有酮泛解酸羟甲基转移酶基因的重组表达质粒为模板，通过定点突变技术进行基因改造。对所得突变后的基因工程菌进行iptg诱导培养，培养液与菌体分离后通过超声破碎得到酮泛解酸羟甲基转移酶突变体粗酶液。并将突变体酮泛解酸羟甲基转移酶与原始酮泛解酸羟甲基转移酶进行催化活力的比较，筛选得到催化性能优异的突变体。

7、本发明还涉及所述酮泛解酸羟甲基转移酶突变体在生物催化制备酮泛解酸和泛酸中的应用。

8、所得酶活有明显改变的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体可与pane基因编码的酮泛解酸还原酶(kpr)和panc基因编码的泛酸合成酶(ps)耦联，用于酶法生产泛酸。

9、本发明的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体的氨基酸数量只有271个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包括这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

10、这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

11、当做为生物催化剂用于生产时，本发明的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等：所述菌体的形式包括存活菌体细胞和死亡菌体细胞。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

13、本发明得到了一系列对酮泛解酸羟甲基转移酶酶活有明显改变的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体，所得酮泛解酸羟甲基转移酶突变体可与pane基因编码的酮泛解酸还原酶(kpr)和panc编码的泛酸合成酶(ps)耦联，用于酶法生产泛酸。相较野生型酮泛解酸羟甲基转移酶，本发明构建的酮泛解酸羟甲基转移酶突变体c.glu-panb-k20a，c.glu-panb-q24a，c.glu-panb-k25a，c.glu-panb-v26n，c.glu-panb-s27a，c.glu-panb-t83r，c.glu-panb-i109l，c.glu-panb-e123a，c.glu-panb-e189a，c.glu-panb-v222n，c.glu-panb-a254r，c.glu-panb-v21e/q24a，c.glu-panb-q24a/s27a，通过与野生型酶比较，酶活有所提高，优于现有报道的酮泛解酸羟甲基转移酶。