一种miRNA标志物在制备鉴别体液斑产品中的应用

本发明属于基因工程诊断，具体涉及一种mirna标志物在制备鉴别体液斑产品中的应用。

背景技术：

1、数字pcr（digital pcr）是一种核酸分子绝对定量技术。同传统pcr以及qpcr相比，数字pcr增加了一步分液的操作，将几十微升的已经配好的包含有引物、模板、缓冲液、酶等组分的pcr反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系。模板dna分子随机地进入到各个小的反应体系中，经过pcr扩增后，包含模板的体系完成扩增，不包含模板的体系无扩增。模板dna分子进入各个小的反应体系的过程满足泊松分布规律，因此，检测扩增pcr产物的信号强度，带入泊松分布计算，即可计算出起始模板分子的拷贝数。相较于qpcr，数字pcr可直接数出dna分子的个数，是对起始样品的绝对定量，具有测量独立性与无需任何校准物的特点。

2、在体液斑鉴别领域，现有的检测手段主要基于酶促反应或免疫学检测的方法，难以应用于陈旧检材和痕量物证。目前应用分子生物学的手段来解决体液斑鉴别的问题成为法医学新的研究热点，常用的分子标记物包括dna甲基化、mrna、微小rna（microrna，mirna）。其中mirna具有稳定性强，不易降解等优点，目前主要应用于体液斑鉴别。目前针对mirna主要采用高通量测序、rna芯片以及荧光定量pcr方法进行分析，高通量测序、rna芯片通量高，存在步骤繁琐，对样本质量要求较高，荧光定量pcr技术的灵敏度较低，在法医学痕量物证的分析中存在困难。数字pcr是一种新型pcr技术，能够实现绝对定量，具有灵敏度高，重复性好的优点。但目前数字pcr技术进行体液斑鉴别的应用尚未报道。

技术实现思路

1、本发明提供了一种mirna标志物在制备鉴别体液斑产品中的应用，以hsa-mir-412-3p为标志物，结合数字pcr技术和svm模型，可精准快速的鉴别出静脉血和月经血。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供一种mirna标志物在制备鉴别体液斑产品中的应用，所述mirna标志物为hsa-mir-412-3p。

4、优选的，所述体液斑包括静脉血和月经血。

5、本发明提供一种鉴别体液斑的试剂盒，所述试剂盒包括hsa-mir-412-3p的正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述反向引物为mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒中的反向引物。

6、优选的，所述试剂盒还包括2×qx200tm ddpcrtm evagreen supermix、cdna模板和双蒸水。

7、本发明还提供一种以非疾病诊断目的的利用mirna标志物鉴别体液斑的方法，包括如下步骤：（1）提取样品mirna，反转录得cdna；（2）对获得的cdna进行数字pcr扩增，对数字pcr数据进行数据分析，设定阈值线，计算出hsa-mir-412-3p拷贝数；（3）基于hsa-mir-412-3p拷贝数用svm模型进行数据分析，判断出样品类型。

8、优选的，对cdna用无菌水稀释后进行pcr扩增。

9、优选的，所述数字pcr的扩增反应体系包括：总体积20μl，10µl 2×qx200tmddpcrtm evagreen supermix，0.4µl正向引物，0.2µl反向引物，1µl cdna模板溶液，8.4µl双蒸水。

10、优选的，所述数字pcr的扩增反应程序包括：95℃ 5min；95℃ 30s，60℃ 1min，共45个循环；4℃ 5min；90℃ 5min；最后维持在4℃；每步升降温速度为1.5℃/s。

11、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

12、本发明以hsa-mir-412-3p为标志物，结合数字pcr技术和svm模型的方法适用于体液斑的鉴别，该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好和分析效率高的优点。利用筛选的hsa-mir-412-3p结合数字pcr和svm模型方法，所需鉴别时间仅需4h即可完成全部实验，一次检测最多可实现96个样本的分析。

技术特征：

1.一种mirna标志物在制备鉴别体液斑产品中的应用，其特征在于，所述mirna标志物为hsa-mir-412-3p。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述体液斑为静脉血和月经血。

3.一种鉴别体液斑的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括hsa-mir-412-3p的正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述反向引物为mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒中的反向引物。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×qx200tm ddpcrtmevagreen supermix、cdna模板和双蒸水。

5.一种以非疾病诊断目的的利用如权利要求1中所述的mirna标志物鉴别体液斑的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，对cdna用无菌水稀释后进行数字pcr扩增。

7.如权利要求5所述的方法，其特在于，所述数字pcr的扩增反应体系包括：总体积20μl，10µl 2×qx200tm ddpcrtm evagreen supermix，0.4µl正向引物，0.2µl反向引物，1µlcdna模板溶液，8.4µl 双蒸水。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述数字pcr的扩增反应程序包括：95℃5min；95℃ 30s，60℃ 1min，共45个循环；4℃ 5min；90℃ 5min；最后维持在4℃；每步升降温速度为1.5℃/s。

技术总结
本发明提供一种miRNA标志物在制备鉴别体液斑产品中的应用，属于基因工程诊断技术领域。本发明以hsa‑miR‑412‑3p为标志物，结合数字PCR技术，得出hsa‑miR‑412‑3p拷贝数，以SVM模型分析出hsa‑miR‑412‑3p的拷贝数与体液斑类型的对应关系，输入待检样本的hsa‑miR‑412‑3p拷贝数，确定体液斑类型。本发明应用方法具有高检测灵敏度的特点，仅需要0.01ng的体液斑miRNA即可实现体液斑类型的鉴别，该方法具有重复性好和分析效率高的优点，所需时间仅需4h即可完成全部实验，一次检测最多可实现96个样本的分析。

技术研发人员：马鲁豫,王嘉慧,方晨,严江伟,周鹏,李杨,王郡,杨彭逸,燕泽宇,李敏,孟德萍,许晓群,于春江,王昕宇,熊若彤,张佳,赵财成,魏然,纪璇,王郡甫,孙广莲
受保护的技术使用者：山东第一医科大学（山东省医学科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24