一株低产后苦味物质的酿酒酵母菌及其在黄酒酿造中的应用

本发明属于微生物，尤其是涉及一株低产后苦味物质的酿酒酵母菌及其在黄酒酿造中的应用。

背景技术：

1、黄酒是世界三大古酒之一，被誉为中华酿造技艺之瑰宝。传统黄酒是以优质糯米、小麦和鉴湖水为主要原料，采用边糖化边发酵的工艺，在开放环境中低温长时间(70-90天)发酵而成，具有浓郁协调、刚劲爽口和醇厚柔和的风味特点。

2、传统黄酒自然开放的发酵模式易受温度、环境条件等因素影响而发生异常发酵，易造成黄酒滋味品质的不稳定。适当的苦味可以刺激消费者的饮欲，衬托黄酒的特性与风格，而持续性的苦味则会影响黄酒的整体口感。温度偏高时所酿制的黄酒中自身特色的苦味易转化为欠佳的“后苦味”，这种异常后苦味(苦味留口)在口中消失缓慢且余味绵长。前期研究确定了传统黄酒中挥发性后苦味物质为3-甲基丁醇、苯甲醛、辛酸乙酯、苯乙醇、辛酸、异丁醇、苯酚、糠醛、壬酸乙酯、棕榈酸乙酯、苯乙酮。这些挥发性后苦味物质导致的过于冗长的后苦味严重降低黄酒的饮用品质和影响消费者喜好度。

3、黄酒发酵是一个复杂的微生物体系作用的过程，发酵过程中每个环节都会带入种类不同的微生物，麦曲带入的真菌与细菌，发酵剂中的酿酒酵母，通过三者的生长代谢与相互作用产生黄酒独特的风味品质，通过微生物手段控制黄酒后苦味物质生成来改善黄酒不良后苦味是一种有效和安全的策略。根据已有的研究及专利检索，目前尚没有具有低产后苦味物质的酿酒酵母菌株及其应用的报道，因此利用现代生物技术来筛选优良性能和减少关键后苦味物质生成的优势酿酒酵母菌株对于系统改善黄酒后苦味和风味品质稳定性具有重要意义，进而实现传统黄酒产业高质量、科学的可持续发展。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：克服黄酒后苦味过重和风味特性不稳定的问题。为了解决上述技术问题，本发明提供了一株低产后苦味物质的酿酒酵母菌及其在黄酒酿造中的应用。

2、本发明提供的酿酒酵母菌株具有减控后苦味物质生成的功能，还提供了含有上述菌株的酿酒发酵剂在黄酒酿造中的应用。

3、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

4、本发明首先提供一株低产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-6(saccharomycescerevisiae sc-6)，保藏编号为cctcc no：m 20232363，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2023年11月28日。

5、本发明还提供的一株高产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-yi19(saccharomycescerevisiae sc-yi19)，保藏编号为cctcc no：m 20232362，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2023年11月28日。

6、本发明还提供了上述低产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-6和高产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-yi19在制备黄酒发酵剂中的应用。

7、本发明还提供一种具有减控后苦味物质生成功能的黄酒发酵剂，为经低产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-6和高产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-yi19发酵的简易酒母发酵剂。

8、在本发明的一个实施方式中，所述低产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-6和高产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-yi19的接种体积比为1:1-10:1。

9、本发明还提供所述黄酒发酵剂的制备方法，包括以下步骤：

10、步骤1)：菌株活化：在无菌操作台中将甘油保藏中的低产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-6和高产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-yi19分别以体积比1％-2％的接种量接种到灭菌的ypd液体培养基中，28-30℃、150-200r/min摇瓶培养12-24h，以此反复三代，第三代得到的菌液作为工作液；

11、步骤2)：大米糖化液制备：将蒸熟米饭和去离子水按照重量比1:3-1:4的比例混合，然后加入液化酶、糖化酶和生麦曲进行糖化，糖化温度控制在50-60℃且糖化3-4h，八层或者更多层纱布过滤后高压蒸汽进行灭菌，得到大米糖化液；

12、步骤3)：接种与发酵：将活化好的低产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-6和高产后苦味物质的酿酒酵母菌sc-yi19种子工作液按sc-yi19：sc-6体积比为1:1-1:10的接种比例混合后，按照2％-5％体积比接入大米糖化液中，将接种完成的大米糖化液置于28-30℃、150-200r/min条件下摇床培养24-48h，培养成熟后即得到黄酒发酵剂。

13、在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，液化酶的加入量为1.0‰-1.1‰(m/m)、糖化酶的加入量为1.0‰-1.1‰(m/m)，生麦曲的加入量为5％-10％(m/m)。

14、本发明还提供所述具有减少后苦味物质生成功能的黄酒发酵剂在制备黄酒中的应用。

15、本发明还提供一种黄酒发酵方法，包括以下步骤：

16、步骤1)：浸米蒸饭：先将糯米用水浸泡36-48h，再用蒸饭锅蒸0.3-0.5h左右，直到糯米熟透无白芯；

17、步骤2)：补水降温：将蒸熟的米饭用冷水快速淋饭，并将饭温控制在25-30℃，沥水至少到基本不滴；

18、步骤3)：落缸：将冷却后的米饭加入发酵容器中，加入去离子水、生麦曲和黄酒发酵剂搅拌均匀，搭窝发酵；

19、步骤4)：前发酵：前发酵温度为28-30℃发酵96-120h，第一天搅拌两次并通气，之后每隔20-24h搅拌一次并通气；

20、步骤5)：后发酵：后发酵温度保持在14-15℃，发酵15-20天；

21、步骤6)：压榨过滤：压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，用8层或者更多层纱布对发酵结束的醪液进行过滤；

22、步骤7)：澄清、灭菌：将酒液放于4-6℃自然澄清2-4天，上清液于70-80℃灭菌15-20min，制得黄酒，密封保存于4-10℃。

23、在本发明的一个实施方式中，步骤3)中，加入去离子水的量为生米重量的120％-125％，加入生麦曲的量为生米重量的13.0％-13.6％，加入黄酒发酵剂的量为生米重量的11.0％-11.4％。

24、本发明还提供一种低产后苦味物质的酿酒酵母菌的筛选策略，包括黄酒模拟发酵体系和基于后苦味物质的仪器检测气相色谱-质谱和高效液相色谱、人工感官评价与电子舌相结合，包括以下步骤：

25、步骤1)：菌株模拟发酵：将鉴定得到的酿酒酵母菌株分别以2％(体积比)接种量接种到ypd液体培养基中，28℃、200r/min摇瓶培养24h，以此反复三代，第三代得到的菌液作为工作液。4℃4500r/min下离心10分钟，倒掉滤液后用无菌水清洗菌体并加入等体积的无菌水，将菌株培养物分别以10％体积比接种到黄酒模拟培养基(大米糖化液培养基)中模拟培养48h，即得菌株发酵液；

26、步骤2)：菌株发酵液产后苦味物质能力分析：用hs-spme-gc-ms测定菌株发酵液中的后苦味物质含量。首先称量5g的发酵液样品与20μl内标(2-辛醇，220mg/l)置于20ml顶空瓶中；顶空瓶在50℃恒温水浴锅中平衡5min以后，将hs-spme萃取头(100μm，dvb/car/pdms涂层)暴露在顶空瓶的顶空环境中萃取50min，且在萃取过程中，转子以250r/min的转速持续搅拌。色谱条件：色谱柱：安捷伦hp-innowax(60m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；升温程序：初始温度为40℃，3℃/min升至120℃，保持5min，最后以3℃/min升到至200℃，保持5min；载气：氦气(纯度为99.99％)；流速：1ml/min；进样方式：不分流进样；质谱条件：离子源：electron ionization；电离能：70ev；离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；质量扫描范围：30-450amu。每个样品做三次重复实验。

27、步骤3)：苦味氨基酸含量分析：利用高效液相色谱测定不同共培养发酵液样品的苦味氨基酸含量。具体方法如下：首先准确称重1g发酵液样品，以5％三氯乙酸溶液溶解，保证样品中三氯乙酸的终浓度为5％，并静置沉淀2h以上，然后双层滤纸过滤，对双层滤纸过滤后的清液按照12000r/min，30min的条件进行离心；接着取离心后的上清液，观察样品有无沉淀或分层，用0.22μm膜再次过滤；最后进行上机检测。

28、步骤4)：电子舌评价：通过ts-5000z电子舌系统对不同菌株发酵液样品的包括酸、甜、苦、涩、鲜和后苦味在内的6种滋味进行评估。首先是电子舌系统通过自检、诊断和矫正等程序，分别在清洗液、参比液中清洗90s、120s，传感器在平衡位置归零30s；然后在仪器达到平衡条件无误后进入样品信息采集阶段，cao、gl1、coo、ae1、aae、aftertaste-b传感器分别采集样品的酸、甜、苦、涩、鲜、后苦六种滋味信息。

29、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

30、1.本发明建立了一种气相色谱-质谱、高效液相色谱、人工感官评价结合电子舌的系统的菌株选育策略来确定减控后苦味物质生成的优良酵母菌株，该菌株能显著降低后苦味物质总含量、苦味氨基酸含量和降低发酵液中后苦味强度，以及确定核心减控菌株的比例，获得了一种具有减控后苦味物质生成的人工黄酒发酵剂，有效克服了传统黄酒生产过程中后苦味过重和风味特性不稳定的问题。

31、2.本发明提供的具有减控后苦味物质生成的黄酒发酵剂，其组分包含的酿酒酵母菌株是从传统黄酒生产中通过分离筛选获得，具有低产后苦味物质和风味品质优良的特点。该菌株为首次从传统黄酒酿造过程中获得的低产后苦味物质且风味品质优良的酿酒酵母。

32、3.用hs-spme-gc-ms和高效液相色谱比较本发明与高产后苦味物质菌株制备的发酵剂酿造的黄酒，发现本发明的黄酒发酵剂制备的发酵黄酒后苦味物质含量远低于高产后苦味物质菌发酵酒且酿造的黄酒理化指标均符合黄酒国标要求，说明本发明的黄酒发酵剂可以有效降低黄酒酿造过程中的后苦味物质含量和有效增强黄酒的整体风味品质。

33、4.sc-yi19是从传统黄酒发酵醪液中筛选出来的高产后苦味物质的酿酒酵母菌株，sc-6具有抑制sc-yi19合成后苦味物质的能力。通过添加酿酒酵母sc-6和酿酒酵母sc-yi19进行发酵得到黄酒发酵剂，通过将本发明的黄酒发酵剂与高产后苦味物质菌sc-yi19黄酒发酵剂酿造的黄酒做对比，以黄酒后苦味物质含量和理化参数为主要指标，所筛选出来的减控菌株制作的黄酒发酵剂所酿造的黄酒可达到有效降低后苦味物质含量和增强黄酒的整体品质的目的，为提高黄酒品质稳定性及风味调控提供理论依据。