一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用

本发明涉及基因工程及纤维素酶解，更具体地，涉及一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用。

背景技术：

1、木质纤维素是非常丰富的可再生资源可以被纤维素酶水解为葡萄糖、木糖等可发酵糖对其进行有效的利用具有非常重要的社会经济意义。然而由于纤维素链间氢键的作用，自然界中木质纤维多以牢固的结晶状态存在导致纤维素酶催化分解木质纤维素的效率很低，大多数木质纤维素尚难以被有效利用。

2、膨胀素（expansin，也称作扩张素、扩张蛋白或膨胀蛋白）对植物细胞生长具有重要作用。植物生长过程中会受到细胞壁的限制，在植物细胞生长期间，膨胀素能够使细胞壁软化，伸展。在许多植物中都发现了膨胀素，近年通过对膨胀素的研究发现，膨胀素并不能直接水解纤维素分子的糖苷键，而是把纤维素链间的氢键打断，有效破坏纤维素结构，使其从结晶状态转化为非结晶状态，有效降低纤维素强度，从而提高纤维素的水解程度。

3、然而膨胀蛋白在细胞分泌物中含量很少，目前主要是通过真核表达系统来体外表达膨胀素蛋白从而对其进行应用。目前微生物来源的膨胀蛋白的体外重组表达表达有较多的研究，例如姚杨等公开了里氏木霉膨胀素基因awol在黑曲霉中表达（姚杨.里氏木霉膨胀素基因swo1在黑曲霉中的表达[d].东北农业大学,2014.），专利cn107488221a公开了真菌来源的膨胀素蛋白及其基因和应用，专利cn114561303a公开了通过基因工程手段对里氏木霉rut-c30进行改造获得了一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株，而植物来源的膨胀蛋白的体外异源表达目前还鲜有报道，且植物膨胀素重组蛋白的酵母异源表达存在表达活性不高的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种重组玉米膨胀蛋白的制备方法。

2、本发明的第二个目的在于提供一种利用所述制备方法得到的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质中的应用。

3、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

4、一种重组玉米膨胀蛋白的制备方法，包括如下步骤：

5、s1.合成密码子优化后的玉米膨胀素基因expa17；

6、s2.将步骤s1的玉米膨胀素基因expa17插入到毕赤酵母分泌性表达载体的多克隆位点区，得到含玉米膨胀素基因expa17的重组质粒；

7、s3.将步骤s2的重组质粒线性化，再转入到毕赤酵母中，获得重组表达玉米膨胀素基因expa17的重组菌株；

8、s4.将步骤s3的重组菌株进行甲醇诱导表达，分离菌株发酵上清液浓缩后的混合物，得到重组玉米膨胀蛋白粗酶液；

9、步骤s1所述密码子优化后的玉米膨胀素基因expa17的核苷酸序列如seq id no.2所示。

10、本发明提供了一种新型的植物源重组膨胀蛋白，由玉米膨胀素基因expa17编码，由于玉米膨胀素基因expa17在酵母中异源表达较难，因此本发明首先对膨胀素基因expa17基因编码序列进行密码子优化，使其在酵母中更好地表达，然后再合成优化后的膨胀素基因，然后将其与毕赤酵母分泌性表达载体连接，形成重组质粒。通过化学转化法将重组质粒转化到毕赤酵母中，经检测膨胀素基因通过同源重组整合到毕赤酵母染色体上，成功获得重组菌株。将获得的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶用于玉米秸秆和微晶纤维素酶水解实验，结果表明，所述重组玉米膨胀蛋白的添加不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶水解速率，而且可以快速获得较高的葡萄糖得率。

11、进一步地，步骤s2所述毕赤酵母分泌性表达载体为ppiczαa，重组质粒为ppiczαa-expa17。

12、进一步地，步骤s3所述毕赤酵母为毕赤酵母x33。与毕赤酵母gs115相比，x33的转化率和表达量较高，具有更好的耐受性。

13、进一步地，步骤s4甲醇诱导表达时，甲醇添加浓度为0.5%～1%。

14、优选地，甲醇添加浓度为1%。

15、优选地，甲醇诱导表达时间为96h。

16、所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶用于玉米秸秆和微晶纤维素酶水解实验，不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶水解效率，而且可以快速获得较高的葡萄糖产率。因此本发明还提供上述任一所述制备方法得到的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质中的应用。

17、具体地，重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质的过程为：以预处理后的木质纤维素类生物质为原料，分别添加重组玉米膨胀蛋白粗酶液、纤维素酶和酶解缓冲液进行酶解；所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.005mg/g～0.015mg/g，纤维素酶用量为2fpu/g～8fpu/g。

18、优选地，所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.015mg/g，所述纤维素酶添加量为2fpu/g。

19、进一步地，所述木质纤维素类生物质为玉米秸秆、水稻秸秆、玉米芯中的任意一种。

20、进一步地，所述预处理为稀硫酸预处理、氢氧化钠预处理、蒸汽爆破预处理、离子液体预处理中的任意一种。

21、优选地，所述原料为经过蒸汽爆破预处理的玉米秸秆糖化渣。

22、进一步地，所述酶解缓冲液为柠檬酸缓冲液。

23、优选地，所述酶解缓冲液为ph 4.8、0.05m的柠檬酸缓冲液。

24、进一步地，所述酶解温度为45～55℃，酶解时间为2～72h。

25、优选地，所述酶解时间为50℃，酶解时间为6～24h。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供了一种新型的植物源重组玉米膨胀蛋白的制备方法，通过对玉米膨胀素基因expa17进行密码子优化后再进行酵母表达，成功制备得到了重组玉米膨胀蛋白粗酶液。得到的重组玉米膨胀蛋白粗酶液可加快纤维素酶水解玉米秸秆的反应速率，减少了纤维素酶的使用量，显著提高纤维素酶水解效率，且与对照组bsa相比，效果更加显著。所述重组玉米膨胀蛋白的添加不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶水解效率，而且可以快速获得较高的葡萄糖产率。本发明对有效利用纤维素资源解决食品、能源等缺乏问题具有重要的理论和现实意义。

技术特征：

1.一种重组玉米膨胀蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤s2所述毕赤酵母分泌性表达载体为ppiczαa，重组质粒为ppiczαa-expa17。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤s3所述毕赤酵母为毕赤酵母x33。

4.权利要求1～3任一所述制备方法得到的重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，重组玉米膨胀蛋白粗酶液协同纤维素酶在降解木质纤维素类生物质的过程为：以预处理后的木质纤维素类生物质为原料，分别添加重组玉米膨胀蛋白粗酶液、纤维素酶和酶解缓冲液进行酶解；所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.005mg/g～0.015mg/g，纤维素酶用量为2fpu/g～8fpu/g。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述木质纤维素类生物质为玉米秸秆、水稻秸秆、玉米芯中的任意一种。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述预处理为稀硫酸预处理、氢氧化钠预处理、蒸汽爆破预处理、离子液体预处理中的任意一种。

8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述酶解缓冲液为柠檬酸缓冲液。

9.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述酶解温度为45～55℃，酶解时间为2～72h。

10.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述重组玉米膨胀蛋白粗酶液的添加量为0.015mg/g，所述纤维素酶添加量为2fpu/g。

技术总结
本发明公开了一种重组玉米膨胀蛋白及其协同纤维素酶在降解木质纤维素中的应用。本发明先对玉米膨胀素基因ExpA17‑corn进行密码子优化，再合成优化后的玉米膨胀素基因ExpA17‑Yeast，然后将其与毕赤酵母分泌性表达载体连接，形成重组质粒。通过化学转化法将重组质粒转化到毕赤酵母中，经检测膨胀素基因通过同源重组整合到毕赤酵母染色体上，成功获得重组菌株。将获得的重组玉米膨胀蛋白协同纤维素酶用于玉米秸秆酶水解实验，结果表明，所述重组玉米膨胀蛋白的添加不仅可大幅度降低纤维素酶的使用量、提高酶解速率。

技术研发人员：谢君,楼琳,葛良法,姜华彬
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29