乳酸菌外膜囊泡的制备方法及应用

本发明涉及生物。更具体地说，本发明涉及一种乳酸菌外膜囊泡的制备方法及应用。

背景技术：

1、抗生素在治疗由细菌感染引起的疾病中具有重要作用，然而，随着抗生素的广泛使用，环境中抗生素耐药菌逐渐增加，对人类的健康造成潜在威胁，因此寻找更加天然、安全、不易产生耐药性的抗菌剂具有重要意义。

2、囊泡是由细菌分泌的，具有双层膜结构的天然纳米级小体，在许多细菌的生命事件中发挥重要生物学功能，如进行细胞间通讯、促进生物膜的形成和参与免疫反应等。近年来，越来越多的研究表明，细菌分泌的囊泡可作为药物输送载体发挥抗菌作用。但有关乳酸菌外膜囊泡的相关研究较少，对于乳酸菌外膜囊泡在抗菌方面的研究更是鲜有耳闻。此外，目前对细菌外膜囊泡提取的方法多为超速离心法，这种方法分离得到的外膜囊泡易破裂，且不易检测，导致提取的外膜囊泡数量较少，质量较差。因此，建立一种能够快速获得大量乳酸菌外膜囊泡的提取和纯化方法是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种乳酸菌外膜囊泡的制备方法及应用，以至少解决上述问题。

2、为了实现本发明的目的和其它优点，提供了一种乳酸菌外膜囊泡的制备方法，包括：制备乳酸菌种子液；将所述乳酸菌种子液涂布在固体平板培养基上，继续培养；对所述固体平板培养基长出的乳酸菌进行刮洗，收集菌液；将所述菌液进行离心，并将得到的上清液用微滤膜过滤；采用超滤管对过滤后的滤液进行截留，并将得到的截留液用微滤膜进行二次过滤，即得乳酸菌外膜囊泡；其中，

3、所述离心的条件为：离心温度4℃、离心力不大于8000g、离心时间5-30min；所述超滤管的大小为30kd。

4、优选的是，所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，所述制备乳酸菌种子液是将乳酸菌菌种加入mrs液体培养基中，于30℃~37℃下培养12 h。

5、优选的是，所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，所述固体平板培养基为mrs固体平板培养基，在所述固体平板培养基上的培养时间为24h。

6、优选的是，所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，采用0.01m的pbs缓冲液对所述固体平板培养基长出的乳酸菌进行刮洗。

7、优选的是，所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，所述离心的条件为：离心温度4℃、离心力4000g、离心时间10min。

8、优选的是，所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，所述微滤膜的孔径为0.22μm。

9、优选的是，所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，所述截留的条件为：离心温度4℃、离心力4000g、离心时间10min。

10、优选的是，所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，在所述二次过滤前，在超滤管中用0.01m的pbs缓冲溶液洗涤截流液三次，所述洗涤的条件为：离心温度4℃、离心力4000g、离心时间10min。

11、本发明还提供了一种采用上述的制备方法制备的乳酸菌外膜囊泡在制备抗菌剂中的应用。

12、优选的是，所述的应用，所述抗菌剂用于抑制屎肠球菌、单增李斯特菌和/或肺炎链球菌的生长。

13、本发明至少包括以下有益效果：

14、第一、本发明采用固体平板培养结合超滤截留的方式，有效解决了乳酸菌外膜囊泡传统提取方法中囊泡易破裂，难检测，杂质多的问题，提取得到的乳酸菌外膜囊泡具有杂质少，不易破碎，完整性好，背景干净及纯度高等特点。

15、第二、本发明提取的外膜囊泡对屎肠球菌、单增李斯特菌和肺炎链球菌具有非常好的生长抑制作用，为乳酸菌外膜囊泡在抗菌剂中的应用提供了技术基础。

16、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

技术特征：

1.乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述制备乳酸菌种子液是将乳酸菌菌种加入mrs液体培养基中，于30℃~37℃下培养12 h。

3.如权利要求1所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述固体平板培养基为mrs固体平板培养基，在所述固体平板培养基上的培养时间为24h。

4.如权利要求1所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，采用0.01m的pbs缓冲液对所述固体平板培养基长出的乳酸菌进行刮洗。

5.如权利要求1所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述离心的条件为：离心温度4℃、离心力4000g、离心时间10min。

6.如权利要求1所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述微滤膜的孔径为0.22μm。

7.如权利要求1所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述截留的条件为：离心温度4℃、离心力4000g、离心时间10min。

8.如权利要求7所述的乳酸菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，在所述二次过滤前，在超滤管中用0.01m的pbs缓冲溶液洗涤截流液三次，所述洗涤的条件为：离心温度4℃、离心力4000g、离心时间10min。

9.采用如权利要求1~8任一项所述的制备方法制备的乳酸菌外膜囊泡在制备抗菌剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂用于抑制屎肠球菌、单增李斯特菌和/或肺炎链球菌的生长。

技术总结
本发明公开了乳酸菌外膜囊泡的制备方法，包括：制备乳酸菌种子液；将乳酸菌种子液涂布在固体平板培养基上，继续培养；对固体平板培养基长出的乳酸菌进行刮洗，收集菌液；将菌液进行离心，并将得到的上清液用微滤膜过滤；采用超滤管对过滤后的滤液进行截留，并将得到的截留液用微滤膜进行二次过滤，即得；其中，离心的条件为：离心温度4℃、离心力不大于8000g、离心时间5‑30min；超滤管的大小为30KD；以及，乳酸菌外膜囊泡在制备抗菌剂中的应用。本发明制备的乳酸菌外膜囊泡具有杂质少，不易破碎，完整性好，背景干净及纯度高等优点。

技术研发人员：李平兰,王玉,尚楠,黄悦滢
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8