一种双链靶DNA序列的制备方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种双链靶dna序列的制备方法及对应的质粒。

背景技术：

1、质粒dna作为基因传递的载体，已在传染病预防疫苗、肿瘤治疗、蛋白质替代治疗等领域得到应用。重组质粒由复制起始位点（originofreplication，ori）、抗性基因（resistance gene）、靶基因表达元件和多克隆位点（multiplecloningsite,mcs）组成。靶基因表达元件由启动子序列（promoter）、稳定mrna结构的内含子序列、编码靶蛋白的cds序列、polya序列等组成。在患者体内直接使用治疗性质粒dna面临着各种挑战，如质粒dna有整合到靶细胞基因组的风险，会触发原癌基因的活性或抑制肿瘤抑制基因；此外，存在于质粒dna序列上的cpg基序(一类以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为核心的序列)可能具有免疫刺激作用，存在于人体内的细菌可能会发生质粒转化，导致质粒dna复制，从而使体内的细菌携带耐药元素并产生耐药性。因此，在临床使用治疗性质粒时，应尽可能酶切去除细菌来源的dna序列，防止患者在治疗过程中出现并发症，但是，质粒酶切后会产生靶基因序列片段与非靶基因序列片段，而大规模分离性质相同的靶基因序列片段与非靶基因序列片段的工艺是不成熟的，也是目前工业界面临的主要问题。

技术实现思路

1、本发明提供一种双链靶dna序列（dsdna）的制备方法，可以有效酶切质粒，消化非靶基因序列片段并保留靶基因序列片段，最后经过纯化制备靶基因序列片段，能有效解决大规模制备靶基因序列片段的问题。

2、在一方面，本发明提供一种双链靶dna序列的制备方法，包含以下步骤：

3、s1：设计dna质粒模板，质粒模板包含靶dna序列和非靶dna序列，靶dna序列两端插入归位内切酶识别序列，非靶dna序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列；

4、本技术所涉及的质粒，是一种双链的dna质粒，包括承载目的基因片段的靶dna序列，以及不包含任何目的基因片段的非靶dna序列，质粒中除目的片段以外的其他序列均可视为非靶dna序列。

5、在一些实施方式中，质粒上的靶dna序列可以是一个，也可以是多个，具体地，可以是两个、三个、或四个。在一些实施方式中，质粒上的非靶dna序列可以是一个，也可以是多个，具体地，可以是两个、三个、或四个。

6、在靶dna序列的两端分别插入归位内切酶识别序列，归位内切酶识别序列可以被归位内切酶识别并切割。在一些实施方式中，归位内切酶选自pi-scei、i-ceui或pi-pspi中的一种或多种。

7、在非靶dna序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列，具体地，可以是一个、两个、三个、四个或五个，辅助内切酶识别序列可以被辅助内切酶识别并切割。在一些实施方式中，辅助内切酶选自asei、agei、afei、apai、asisi、aatii、 mlui、bamhi、bspei、drai、eco53k、fspi、hindiii、kpni、mfei、noti、ndei、nrui、nsii、psii、sali、scai、spei、sphi、stui、smai、sspi、tspmi、xhoi、xmai或zrai中的一种或多种。

8、在一些实施方式中，采用化学法合成dna质粒模板，在另一些实施方式中，也可用其他常规方法制备质粒模板。

9、在一些实施方式中，非靶dna序列的内部插入一个辅助内切酶识别序列。在一些实施方式中，非靶dna序列的内部插入两个辅助内切酶识别序列。

10、s2：复制dna质粒模板，得到dna质粒，分别用归位内切酶和辅助内切酶切割dna质粒，得到靶dna序列和非靶dna序列短片段的混合物；

11、对dna质粒模板进行复制，得到大量dna质粒。复制方法例如可采用引入宿主菌后在宿主菌中随宿主菌生长复制。采用归位内切酶和辅助内切酶双酶切质粒，得到靶dna序列短片段和非靶dna序列短片段的混合物，其中，靶dna序列由于两端设置的归位内切酶识别序列被归位内切酶识别并切割；非靶dna序列由于内部插入至少一个辅助内切酶识别序列，因此被辅助内切酶切割，生成的短片段两端或者至少一端为辅助内切酶切割端。

12、在一些实施方式中，非靶dna序列内部插入了一个辅助内切酶识别序列，质粒双酶切后产生一个靶dna序列短片段和两个非靶dna序列短片段。其中靶dna序列短片段两端为归位内切酶切割端；非靶dna序列短片段的一端为辅助内切酶切割端，另一端为归位内切酶切割端。

13、在一些实施方式中，非靶dna序列内部插入了两个辅助内切酶识别序列，质粒双酶切后产生一个靶dna序列短片段和三个非靶dna序列短片段。其中靶dna序列短片段两端为归位内切酶切割端；两个非靶dna序列短片段的一端为辅助内切酶切割端，另一端为归位内切酶切割端；一个非靶dna序列短片段的两端均为辅助内切酶切割端。

14、s3：采用dna水解酶水解混合物中的包括非靶dna序列的短片段，得到双链靶dna序列；

15、上一步获得的混合物中包含靶dna序列短片段和非靶dna序列短片段，向混合物中加入dna水解酶，水解酶会水解掉非靶dna序列短片段，从而留下靶dna序列短片段。具体地，水解酶选自核酸外切酶 iii（exonuclease iii）、t5 核酸外切酶（t5 exonuclease）、t7 核酸外切酶（t7 exonuclease）或λ核酸外切酶（lambda exonuclease）中的一种或多种。

16、质粒的双酶切及水解过程可参照图1，将同一归位内切酶序列插入到质粒dna靶基因序列的两端，同时将两辅助内切酶序列插入到质粒dna的非靶向基因序列中间（如图1中的a所示）。后使用归位内切酶和辅助内切酶对质粒同时进行双酶切反应，质粒酶切后会得到两端均为归位酶切割端的靶基因序列片段，一端有归位内切酶切割端和一端有辅助内切酶切割端的非靶基因序列片段，以及两端均为辅助内切酶切割端的非靶基因序列片段（如图1中的b所示）。后直接使用水解酶消化非靶基因序列片段，水解酶消化后剩余两端均为归位酶序列的靶基因序列片段（如图1中的c所示），最后经过纯化得到靶基因序列片段（如图1中的d所示）。

17、在另一方面，本发明还提供一种质粒，质粒包含靶dna序列和非靶dna序列，靶dna序列的两端均插入归位内切酶识别序列，非靶dna序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列。在一些实施方式中，非靶dna序列的内部插入两个辅助内切酶识别序列。

18、在另一方面，本发明还提供一种从质粒中获得靶dna序列的方法，包含以下步骤：

19、a：分别采用归位内切酶和辅助内切酶切割所述质粒，得到包括靶dna序列和非靶dna序列短片段的混合物 。优选地，归位内切酶的比活性高于0.125 u/μg质粒，辅助内切酶的比活性高于0.25 u/μg质粒。

20、b：采用dna水解酶水解混合物中的非靶dna序列短片段，得到所述靶dna序列。优选地，水解酶的比活性高于0.5 u/μg质粒。

21、本发明提供一种双链靶dna序列的制备方法，首先，设计dna质粒，质粒包含靶dna序列和非靶dna序列，靶dna序列两端插入归位内切酶识别序列，非靶dna序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列；其次，分别用归位内切酶和辅助内切酶切割所述质粒，得到靶dna序列和非靶dna序列短片段的混合物；最后，采用dna水解酶水解混合物中的非靶dna序列短片段，得到靶dna序列。本技术提供的方法，可以有效酶切质粒，消化非靶基因序列片段并保留靶基因序列片段，最后经过纯化制备靶基因序列片段，能有效解决大规模制备靶基因序列片段的问题。