特异性结合IL-12的抗体、抗体片段及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及特异性结合il-12的抗体及其应用。

背景技术：

1、il-12，全称白细胞介素12(interleukin-12)，是一种由树突状细胞、巨噬细胞以及b细胞等免疫细胞产生的异源二聚体细胞因子。它在免疫系统中扮演着重要的角色，尤其是在促进细胞免疫和th1细胞分化方面。il-12由p35和p40两个亚基通过二硫键连接而成，是免疫调节网络中一个关键的节点。il-12也作用于其他类型的细胞，但其主要作用于淋巴细胞，il-12是th1细胞免疫应答的决定因素，可有效地促进th1类细胞因子如ifn_γ的产生，另一方面又可抑制th2类因子如il-4、il-13的产生，从而抑制th2型应答反应。il-12的减少或缺失导致th2优势免疫反应。另外，il-12能诱导多种细胞因子的产生，如inf_γ、il-10等。il-12是最为强的诱导t淋巴细胞特别是活化的t细胞和nk细胞产生ifn_γ的细胞因子，il-12的许多体内作用就是通过诱导ifn-γ的产生来发挥的。il-12生物学活性的发挥是通过t细胞和nk细胞上的il-12受体介导的。当nk细胞、cd4+、cd8+的t细胞被活化后在其细胞表面上能表达出高亲和力的il-12受体(il-12r)，已在植物凝集素(pha)活化的人外周血单个核细胞(pbmc)中检测到表达两个il-12r亚单位(il-12rβ1和il-12rβ2)的克隆。il-12和il-12rβ2结合，通过jak2(janus酪氨酸激酶)/stat4(signal transducer andactivator oftranscription protein 4)途径增加了ifn_γ的产生。此外，在小鼠体内观察到il-12还能够诱导il-10的产生，并且作为一种协同刺激因子在体外能活化人的t淋巴细胞产生il-10。由于il-10能够抑制il-12的产生和合成，并使il-12的作用降低，故认为il-12所诱导的il-10的产生很可能是这种细胞因子限制其自身反应的一种负反馈调节机制。il-12还能增强细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和lak细胞的生成，同时，通过诱导编码细胞毒颗粒相关分子基因的转录和通过上调黏附分子的表达，它也能增加ctl和nk细胞的细胞毒活性。il-12还能直接影响b细胞的增殖、分化和ifn_γ产生，对b细胞的活化作用和诱导特定免疫球蛋白同种型(igg增加，ige减少)生成的效应。il-12还通过ifn_γ的作用而抑制tgf-β的产生。由此可以看出，il-12及其所诱导的细胞因子与其他细胞因子之间的相互作用是一个比较复杂的网络系统，它们之间相互作用而调节机体细胞之间的相互平衡，以利达到相应的应答水平。

2、il-12在抵御病毒、细菌和寄生虫感染方面具有重要作用。通过激活细胞免疫应答，il-12能够帮助机体清除感染源，恢复健康。在某些自身免疫性疾病中，如多发性硬化症和类风湿性关节炎，il-12的表达水平可能会升高，从而加剧疾病进展。因此，针对il-12的治疗策略可能对这些疾病具有潜在的治疗效果。il-12在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。通过激活细胞免疫应答，il-12可以抑制肿瘤细胞的生长和扩散，从而提高患者的生存率。il-12已被用于多种肿瘤的临床试验，如黑色素瘤、肾癌和乳腺癌等。研究表明，il-12可以增强肿瘤细胞的免疫原性，从而提高抗肿瘤免疫应答。针对感染性疾病，il-12可以作为辅助治疗手段，提高机体对病原体的清除能力。例如，在艾滋病和结核病等慢性疾病中，il-12的应用可能有助于改善病情。尽管il-12在自身免疫性疾病中的作用复杂，但针对il-12的治疗策略仍具有潜力。通过抑制il-12的产生或阻断其功能，可能有助于缓解疾病的进展。

3、抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。免疫球蛋白(不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应b细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型y形蛋白质，仅发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其b细胞的细胞膜表面。抗体通常使用免疫动物的b细胞制备，通过融合永生细胞系形成分泌所需抗体克隆的杂交瘤细胞。该杂交瘤技术可大量生产一致性高、特异性强、灵敏度高的抗体。然而，随着时间的推移，杂交瘤细胞系会出现遗传漂变，导致抗体出现微小差异。抗体可以和抗原特异性结合，可利用此原理从复杂成分中分离出特异性的抗体。抗体作为研究工具，可以用于生物标志物的发现和研究，也可以作为机体内蛋白互相作用、蛋白与核酸互相作用的研究工具。抗体具有多种应用。例如一些与相应的蛋白、核酸、酶等生物大分子特异性结合的抗体，标记上荧光标记或者化学发光标记后，能详尽的这些大分子在细胞中的位置、分布、表达量等情况。抗体的应用领域还包括免疫组化(ihc)、免疫荧光(if)、免疫印迹(westernblot)、酶联免疫吸附(elisa)等。抗体可以作为免疫抑制剂或者治疗药物，还可以作为医学检测或者检验试剂使用。单抗灵敏度高、特异性好，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。目前，抗体产品已经延伸到兽医检测检疫，食品安全检测、药物残留、致病微生物等领域。

4、杂交瘤抗体筛选技术为筛选具有靶点特异性且高亲和力的抗体提供了平台。该技术主要将能分泌抗体但不能无限增殖的浆b细胞与能在体外增殖且长期培养的骨髓瘤细胞相融合，筛选得到既能分泌特异性抗体且能长期培养无限增殖的杂交瘤细胞。并通过该杂交瘤的扩大培养实现抗体的生产制备，还可以通过液氮冷冻保存杂交瘤细胞，为后期抗体生产提供了便利。

5、需要对il-12具有更高亲和力的抗体，以治疗人类il-12介导的相关疾病。

技术实现思路

1、有鉴于此，发明人通过抗原免疫、杂交瘤筛选、抗体表达纯化到生物活性鉴定，筛选到2个具有全新cdr序列的抗人il-12抗体。与已知的抗人il-12抗体相比，该抗体对于与已知抗人il-12抗体相比，具有更高的灵敏度和特异性，可用于il-12的检测，并可用于人类il-12相关疾病的诊断、治疗和预防。

2、根据本发明的一个方面，提供了一种特异性结合il-12的抗体，所述抗体的重链可变区hcdr1、hcdr2、hcdr3和轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3选自如下组合之一：

3、1)hcdr1的序列如seq id no：1所示；

4、hcdr2的序列如seq id no：2所示；

5、hcdr3的序列如seq id no：3所示；

6、lcdr1的序列如seq id no：4所示；

7、lcdr2的序列如seq id no：5所示；

8、lcdr3的序列如seq id no：6所示；或者

9、2)hcdr1的序列如seq id no：7所示；

10、hcdr2的序列如seq id no：8所示；

11、hcdr3的序列如seq id no：9所示；

12、lcdr1的序列如seq id no：10所示；

13、lcdr2的序列如seq id no：11所示；

14、lcdr3的序列如seq id no：12所示。

15、所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:13所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:14所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:16所示。

16、根据本发明的另一个方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：(i)所述抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

17、根据本发明的另一个方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：(1)所述的抗体；或(2)所述的重组蛋白。优选地，所述多核苷酸的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no:17所示，轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no:18所示；或者所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no:19所示，轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no:20所示

18、根据本发明的另一个方面，提供了一种载体，所述载体含有所述多核苷酸。

19、根据本发明的另一个方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的载体或基因组中整合有所述多核苷酸。

20、根据本发明的另一个方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1或2所述的抗体；以及(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

21、根据本发明的另一个方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达所述抗体。

22、根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：(i)所述抗体、所述重组蛋白、所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述抗体偶联物、所述免疫细胞、或其组合；以及(ii)药学上可接受的载体。

23、根据本发明的另一个方面，提供了一种检测或测定人il-12的方法，所述方法包括使用所述抗体、所述重组蛋白、所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞、所述抗体偶联物、所述免疫细胞或其组合；优选地，所述检测方法包括酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞分析。

24、本技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。