本发明属于基于核酸技术检测肉类成分，具体涉及检测食品中马肉成分的引物对、试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、随着肉类消费量的快速增长，肉类掺假和肉类产品欺诈已成为食品行业的重大问题。用廉价或不受欢迎的肉类替代昂贵的肉类是一种常见做法。因此，为了有效避免掺假事件的发生，维护消费者利益和市场诚信，必须建立一种简单、准确、高效的方法来鉴别掺假肉中的马肉成分。
2、目前，基于核酸的检测技术是检测动物源成分的主流方法。该技术可扩增特定的核酸序列，从而实现对目标序列的检测。核酸广泛存在于所有动植物细胞和微生物中，具有相对稳定性。聚合酶链式反应(pcr)检测法因其高灵敏度和特异性而成为黄金标准，但其缺点是程序耗时，需要复杂的仪器。相比之下，等温扩增技术是很有前途的替代方法。这些技术操作简单，不需要变温系统进行扩增。在这些技术中，重组酶聚合酶扩增(rpa)检测尤其引人注目。rpa利用三种核心酶：重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换聚合酶。rpa的最佳工作温度为37-42℃，扩增时间短，是快速鉴定物种的理想选择。
3、许多研究探讨了rpa技术的应用，特别是在肉类掺假检测中的应用，为其开发和应用提供了充足的数据支持。例如，zhou等人开发了一种基于rpa的鸭肉特异性检测方法，用于快速检测动物源性食品中的鸭肉成分。他们成功开发了实时rpa和rpa与侧流试纸条(rpa-lfs)相结合的检测方法，分别可在39℃和40℃温度下20min内快速检测鸭肉。在鸭肉和羊肉混合粉中检测到的鸭肉成分最低为0.1％(重量比)。等人开发了两种基于rpa的快速分子检测方法，可在6至11min内检测出猪肉和马肉。这些检测方法具有很高的特异性，可识别肉类混合物中低至0.1％的目标dna。此外，liu等人还开发了一种rpa-crispr-cas12a检测方法，可对目标基因进行荧光强度的检测。rpa-cas12a-fs系统可在37℃下45min内特异性检测低至10个拷贝的目标基因。cao等人开发了一种rpa结合sybrgreen i的肉类掺假视觉鉴定方法。该技术在37℃下反应时间为30min，可对特定肉类进行视觉检测，检测出的猪肉掺假率最低为1％。该技术可用于水煮、微波、高压或油炸的样品。尽管这些技术很有效，但仍存在一些缺点。凝胶电泳需要复杂的仪器和操作，延长了检测时间。肉眼检测比较主观，容易出现假阳性结果。lfs和实时荧光检测需要专门的探针，通常需要大量的合成和筛选，成本高且耗时。实时荧光检测也依赖于实时监测荧光的专用仪器。因此，rpa可通过终点荧光检测进行量化。
4、磁珠(mb)具有快速简单的磁性分离、高表面积体积比和可结合多种功能基团等优点，因此已被广泛应用于核酸(包括扩增子)的分离和检测。链霉亲和素包被的磁珠(mb@sa)能有效结合生物素化的捕获探针，便于直接从粗样品中捕获dna，通过实时定量pcr(qpcr)进行检测。同样，在与固定在磁珠上的sdna探针杂交后，mb也能捕获生成的扩增子。此外，使用生物素标记的引物也能检测到扩增子。mb@sa通常用于富集、捕获和检测各种扩增技术产生的生物素化核酸扩增子。
5、有鉴于此，急需提供一种操作简单的方法，用于食品中马肉的检测。
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了检测食品中马肉成分的引物对、试剂盒及检测方法。
2、为达到上述技术效果，本发明采用以下技术方案进行。
3、本发明提供了用于检测食品中马肉成分的引物对，所述引物对的序列如seq idno.1和seq id no.2所示。
4、本发明一些技术方案中，如seq id no.1所示的引物的5′端标记有6-fam荧光基团；如seq id no.2所示的引物5′端上标记有生物素。
5、本发明中，所述引物对是根据马线粒体dna的atp6-8基因设计得到的。
6、本发明还提供一种检测食品中马肉成分的试剂盒，包括所述的引物对。
7、本发明还提供了一种检测食品中马肉成分的方法，包括：使用所述引物对或所述的试剂盒进行。
8、本发明一些技术方案中，所述方法包括：
9、s1，提取待测样品中的dna，得到样品基因组dna；
10、s2，使用所述的引物对，对所述样品基因组dna进行rpa扩增，得到扩增产物；
11、s3，使用链霉亲和素修饰的磁珠分离和纯化扩增产物，之后使用高通量荧光检测系统对扩增产物进行鉴定和定量；荧光信号值超过阈值则表示阳性，即扩增产物中含有马肉成分。
12、本发明一些技术方案中，s1中，将待测样品经裂解缓冲液裂解后，将提取装置放入含样品的裂解缓冲液中，之后进行洗涤提取装置，去除附着的蛋白质和其他物质；洗涤后将提取装置放入洗脱缓冲液中，释放提取到的所述样品基因组dna；
13、所述提取装置包括：多聚甲醛板，其上配置有若干uio-66spme装置，每两个所述uio-66spme装置相平行；
14、所述uio-66spme装置包括提取棒，所述提取棒上粘连有涂覆有uio-66-nh2的硝酸纤维素膜。
15、本发明一些技术方案中，s1中，利用96孔高通量dna提取系统，该系统由96个uio-66spme装置和多聚甲醛板组成，通过三个步骤分离dna：裂解、洗涤和洗脱，每个样品的提取时间少于7.2秒。
16、本发明一些技术方案中，所述裂解液包括：ph为7.5-8.5、浓度为95-105mm tris-hcl，4.5-5.5mm edta，195-205mm nacl，质量分数为0.8％-1.2％sds。
17、本发明一些技术方案中，所述洗脱液为8-12mm tris。
18、本发明一些技术方案中，s2中，rpa扩增包括：将向预混有重组酶及聚合酶冻干粉的反应管中加入primer-free rehydrationbuffer、正向引物和反向引物、样品基因组dna、ddh2o混合均匀后加入醋酸镁，混匀后于37℃-41℃温度下，扩增15min-20min；
19、所述正向引物和反向引物的添加量分别为2.8μl-3.2μl、醋酸镁的添加量为2.0μl-2.6μl。
20、本发明一些技术方案中，s3中，所述阈值为834，当荧光信号值大于834则表示阳性，即扩增产物中含有马肉成分。
21、本发明一些技术方案中，s3，所述链霉亲和素修饰的磁珠与所述扩增产物的体积比为2-3:1-2。
22、s3中，磁分离和荧光检测的检测步骤包括：
23、首先，取100μl mb@sa溶液，用1×tbs缓冲液洗涤三次。经过磁性分离(ms)并仔细倾倒上清液后，将清洗过的珠子分散在200μl 2×binding&washing(b&w)缓冲液(10mmtris-hcl(ph 7.5)，1mm edta，2m nacl，0.01％tween-20)中，在-4℃下保存备用。
24、然后，将15μl扩增产物和10μl分散的mb@sa混合液放入离心管中，将混合物涡旋并在室温下孵育5min。离心管在磁力架上分离，除去上清液，然后用1×b&w缓冲液洗涤三次。最后，将洗净的磁珠复合物重悬于200μl超纯水中；
25、将混合液直接转移到聚苯乙烯黑色96孔酶标板中。通过多功能酶标仪(tecaninfinite200 pro)检测荧光信号进行终点荧光检测(fd)。
26、本发明中，分别购买了牛肉制品、驴肉制品、鹿肉制品和羊肉制品，采用上述rpa-ms-fd系统对21种加工肉制品进行了定性和定量分析。然后使用中国行业标准《食品和饲料中家畜成分的鉴定第5部分：马肉成分的检测-实时pcr法》(sn/t3730.5-2013)验证结果的准确性。
27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
28、(1)本发明只需要一对标记引物在反应体系中进行rpa扩增就可以检测荧光，与rpa实时荧光检测相比，免去了专用荧光探针的设计与筛选过程。
29、(2)本发明采用了96孔高通量dna提取方法进行dna分离和纯化。然后利用rpa技术对分离出的dna进行扩增，并利用磁分离(ms)策略对扩增子进行分离。这种检测方法只需要一对标记有6-fam荧光基团和生物素的引物。最后，通过酶标仪测量荧光强度，对dna扩增子进行定性和定量分析，为检测马肉掺假提供了一种高通量、快速、准确的方法。本发明所提供的dna分离方法，可纯化dna以用于后续的多重pcr分析。此外，还提供了一种基于磁性离子液体的高通量dna分离方法，然后进行实时pcr分析。这些方法省去了耗时耗力的样品制备步骤，从而节省了分析人员的时间，提高了研究人员的整体分析效率。
30、(3)目前，高通量样品制备策略已广泛应用于临床、制药、食品和环境科学领域。这些策略提高了样品通量和制备效率，有助于对复杂样品进行快速分析。本发明中基于新开发的96-spme提取装置，使用该提取装置，每个样品的提取时间少于7.2秒。
31、(4)效率高。本发明与96高通量dna分离系统相结合，可在31.5min内分析96个肉类样品。其中包括11.5min的dna快速提取、15min的rpa扩增和5min的荧光检测。省去了耗时耗力的样品制备步骤，从而节省了分析人员的时间，提高了研究人员的整体分析效率。
32、(5)灵敏度高。本发明可检测出掺假肉类样品中低至0.1％的马肉。
33、(6)特异性高。本发明能高度特异性识别马肉，在其他11种肉类的dna中未观察到阳性扩增。
34、(7)良好的实际应用。本发明成功地用于分析21种商业肉制品。