本发明属于生物，具体涉及利用细菌促生多巴胺的方法及多巴胺的在调控微生物生理特性中的应用。
背景技术：
1、微生物内分泌学领域三十年的研究表明，细菌与其宿主之间存在复杂的相互作用，cas(儿茶酚胺类物质)在其中扮演着关键的信使角色，促进细胞间的信息传递。研究表明，cas对细菌的生长、运动、粘附和毒力等有着显著影响。然而，这些影响主要取决于培养基组成和接种物密度，尤其在模拟营养不良和铁限制条件的最低盐培养基(即血清sapi)中最为显著。在人类微生物组中，微生物对一系列神经内分泌激素的反应越来越被认为在疾病发病机制和稳态维持中发挥着关键作用，但近些年在这方面的报道很少。
2、cas主要是在人体和动物中存在，其作为神经递质和激素来调节机体生理活动，在植物中被发现的同时，微生物与cas间的关联也被建立。cas可促进生物间感应与交流，在不同物种间及种内扮演信使角色。微生物中，其最先在肠道微生物中被发现，肠道含众多神经细胞，其数目与脊髓内神经元细胞相媲美，这种神经网络被称为肠道神经系统(entericnervous system，ens)，它在调控肠道环境中起着关键作用。人体内超半数的多巴胺(da)由ens产生，影响肠道内细菌，对维持肠道菌群平衡至关重要。
3、当前研究表明微生物也能合成da等cas，如一些肠球菌可以合成da，合成的da主要通过血液运输到宿主的脑部，供宿主调控中枢系统所用，也将这种脑肠之间的联系称之为脑肠轴。肠道微生物群是控制外周da水平的重要变量，就进化的角度来看，微生物先于脊椎动物，其早已进化出合成和识别激素的机制。目前关于微生物如何合成da、产生的da对微生物自身有何作用仍缺乏研究，以其为研究出发点探索da对微生物的生长繁殖及da作用方式的研究无疑具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明通过研究多巴胺的在调控微生物生理特性中的应用，首先对自然环境及实验室的常用细菌的da产生情况进行了检测，利用elisa法定量了五种菌株胞内的da水平，并选取e.coli atcc11303作为进一步研究对象，通过基因组分析，揭示了相关的da合成基因，初步阐明了e.coliatcc11303中da的合成路径。此外，通过一系列实验探究了da对e.coliatcc11303生理特性的影响，并利用cy3荧光标记与激光共聚焦显微技术研究了da在细菌中的运输途径。采用4d-dia蛋白质组学技术，进一步明确了da到底如何影响e.coliatcc11303菌株的生理与生化特性，具体操作如下：
2、首先，对自然环境及实验室的常用细菌的da产生情况进行了检测，采用上海晶抗生物科技提供的多巴胺(da)检测试剂盒，通过双抗夹心酶联免疫吸附法(elisa)进行da含量的测定，
3、表1产多巴胺细菌的菌种及其菌株胞内多巴胺浓度
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5、进一步地，在上述研究的基础上，通过向培养基中添加酪氨酸，分别研究向escherichia coli atcc11303的培养基中添加l-酪氨酸/d-酪氨酸，检测菌株胞内胞外多巴胺浓度变化，探究酪氨酸对e.coli atcc11303菌株胞内外多巴胺浓度的影响。
6、表2酪氨酸对e.coli atcc11303菌株胞内外多巴胺浓度的影响
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9、通过上述研究可知，通过向lb/mm培养基中添加+10mmol/l的-酪氨酸或d-酪氨酸，能够明显提高菌株胞内和胞外的da合成能力。
10、再通过研究多巴胺对e.coliatcc 11303生长的影响，从生物膜形成量、生物膜形态、运动性和趋化性四个指标分被进行生物膜定量分析、扫描电镜制片、菌株运动性实验以及趋化实验，深入探究da对e.coli atcc 11303菌株生理特性的影响。
11、进一步地，通过酰胺标记法，利用酰胺法将带有胺基的da与含有羧基的cy3进行结合，合成cy3标记的cy3-da，确定其激发光和发射光波长分别为546nm和564nm，分子量为627。将此化合物与e.coli atcc 11303孵育。
12、进一步地，借助4d-dia蛋白质组学技术深入分析了da对e.coli atcc 11303在蛋白表达水平的影响，鉴定出22,091个肽段，3,048种蛋白，其中138种蛋白在da处理组与对照组表现出显著变化，包括60种上调和78种下调蛋白。
13、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
14、(1)首次系统的研究da与细菌的相互作用，初步明确da在细菌中的运输途径；
15、(2)以da为研究靶点，对自然环境及实验室的常用细菌(来源于环境和人体)的da产生情况进行了检测，发现细菌生物合成da的能力存在菌属差异，采用酶联免疫法(elisa)筛选产da的菌株，不同菌株合成da的水平大小依次为：e.faecalis yn771>e.coliatcc11303>e.colibw25113>b.cereus myb41-22>s.marcescens kmr-3。并且da浓度受培养环境影响，特别在营养贫乏的mm培养基中，da产量普遍高于富营养的lb培养基。同时也和培养基中的l-酪氨酸水平相关，进一步证实了e.coli atcc11303中存在类似动植物的da合成路径，并观察到细菌能将内源合成的da释放至外环境。
16、(3)通过探究da对e.coli atcc 11303菌株生理特性的影响显示：da的促生长效果在添加30％血清的mm培养基中最明显，50μmol/l da效果最佳，且最大浊度值相比对照组提高了1.55倍，但da促生长作用可被10μmol/l的氯丙嗪这一受体拮抗剂所抵消，指示da的促进作用可能通过特定受体介导。200μmol/l的da处理后显著增加了生物膜厚度，达到原来的1.5倍，这一作用主要是通过促进细菌增殖和胞外分泌物的增加实现的，50μmol/l的da显著增强了菌株的运动性，运动区直径比对照组增大约2mm，均可被100μmol/l氯丙嗪中和。50μmol/l的da显著促进了细菌的趋化反应，使细菌数量增加至对照组的约2.75倍，而氯丙嗪未显著影响da诱导的趋化性。
17、(4)cy3标记的da能够渗透细菌细胞膜并进入胞内，能够用于探索外源性da的作用位点，确定其运输途径，最终明确是在胞内还是胞外发挥作用。
18、(5)借助4d-dia蛋白组学挖掘da影响e.coli atcc 11303生理特性作用的主要蛋白，对差异蛋白进行亚细胞定位，其中91.3％的的蛋白位于胞质内，质膜和胞外分别占7.25％和1.45％，揭示了da主要在细胞内部发挥作用。
1.多巴胺在调控微生物生理特性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多巴胺在促进细菌菌株生长中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多巴胺在促进细菌生物膜形成中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多巴胺在提高细菌运动性中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多巴胺在增强菌株的趋化性中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多巴胺在细菌蛋白质应答中的应用。
7.一种利用细菌促生多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤二中络氨酸包括l-络氨酸或d-络氨酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤二中络氨酸溶液浓度为10mmol/l，添加酸溶解络氨酸，调ph至7.2～7.4。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤二中滤膜为孔径为0.22μm的滤膜。