本发明涉及dna检测，尤其涉及一种基于滚环扩增技术的流式核酸单分子计数方法。
背景技术：
1、随着分子生物学和基因工程的飞速发展，对低含量dna的准确定量已成为多个关键领域的重要需求，包括临床诊断、环境监测、食品安全、法医学以及基因组研究等。准确检测低含量dna对于早期疾病诊断、微量病原体检测以及罕见遗传标记分析具有重要意义。
2、现有的dna定量技术，如实时荧光定量pcr(qpcr)和数字pcr。实时荧光定量pcr的基本步骤如下1.构建标准曲线：qpcr通过将已知浓度的靶标dna或rna样本(标准品)进行一系列稀释，构建标准曲线。标准曲线的横坐标为标准样本的初始浓度，纵坐标为相应的ct值。通常，标准曲线呈现出线性关系，其斜率反映了扩增效率。2.反向推算样本浓度：在对未知样本进行qpcr反应时，记录其ct值，并将其与标准曲线进行比较。根据标准曲线，可以通过ct值与已知浓度的关系推算出未知样本中靶标dna或rna的初始浓度。
3、数字pcr是一种潜在的核酸定量基准方法，可实现对目标核酸的直接绝对定量。它将低浓度的核酸样本平均分配到大量的独立反应单元中，每个反应室内含有单个或少量目标dna分子。在pcr扩增过程中，只有目标dna分子存在的反应室会产生荧光信号，其他反应室则无信号。通过计算阳性反应室的数量及其比例，根据泊松分布和阳性信号比例来定量特定核酸片段的拷贝数。相比qrt-pcr，数字pcr不依赖标准曲线，具有更高的灵敏度和准确性，特别适用于低拷贝数dna的定量。该方法还可避免传统qpcr中的效率问题。
4、但是，虽然荧光定量pcr(qpcr)广泛应用，但在检测低拷贝数dna时存在一些技术瓶颈。具体问题包括：1.操作复杂：qpcr依赖温度循环设备，且对扩增效率要求较高，操作复杂且易受实验条件影响。2.对低浓度、杂质较多的样本定量不准确，灵敏度不高；qpcr的定量准确性依赖于标准品的准确性及其浓度梯度的设计。通常，标准曲线的可靠性越高，定量结果的准确性和灵敏度也越好。虽然广泛应用，但在检测低拷贝数dna时存在一些技术瓶颈。具体问题包括：1.定量严重依赖标准曲线。标准曲线的构建需要使用已知浓度的标准品，标准品的质量、制备过程中的误差以及保存条件的变化都会显著影响曲线的线性和准确性，进而导致样本定量结果的偏差。此外，标准曲线在不同实验批次间难以保持一致性，可能造成跨实验的结果不一致，这对需要高精度、跨批次比较的实验带来了困难。2.荧光定量pcr的扩增效率容易受到pcr抑制物的影响。样本中常含有盐、蛋白、酚或其他化学物质，这些物质可能抑制dna聚合酶的活性或干扰引物的退火效率，导致扩增不完全或扩增效率降低。这种现象在复杂样本(如血液、组织提取物)中尤为显著，可能直接导致定量结果偏差甚至假阴性。此外，抑制物的影响具有不可预测性，增加了实验结果的不确定性。
5、数字pcr尽管用于dna绝对定量具有高灵敏度和准确性，但其应用也存在一定的局限性。首先，所需的设备昂贵，且实验操作复杂，需要专用的高端仪器，这大大增加了实验成本。其次，实验过程相对繁琐，尤其是在样品处理和数据分析方面，增加了操作人员的劳动强度。并且检测通量相对较低，上述原因限制了其在大规模样本中的应用。
6、流式单分子计数仪是一种强大的单分子分析装置，用于对细胞和单分子蛋白及核酸进行高通量、精确、定量的分析。相应的流式核酸单分子计数方法的基本原理是：通过液流聚焦的方式将核酸样本流聚焦到很小的范围(＜10μm)，当被荧光标记的核酸分子逐一经过激光检测区时，经过激光照射产生荧光信号。通过测量这些信号的强度和特性，能够准确的识别每个阳性峰信号，并通过计数的方式精确测量核酸分子拷贝数含量。该方法作为一种潜在的核酸计量基准方法，是对数字pcr计数的重要补充。但是该方法对每个核酸分子发出的荧光信号强度有较高的要求，否则仪器无法识别单分子产生的荧光吸信号。
7、基于此，提供一种不依赖标准曲线的高精确度流式核酸单分子计数方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于滚环扩增技术的流式核酸单分子计数方法，旨在解决现有技术中对低含量的核酸检测精度低，不易操作等技术问题。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种基于滚环扩增技术的流式核酸单分子计数方法，包括以下步骤：
4、dna样本制备，得到待测dna样本；
5、引物探针设计：基于所述dna样本，设计引物探针，所述引物探针包括锁环探针、扩增引物和荧光探针；
6、滚环扩增反应：基于所述引物探针进行滚环扩增反应即rca反应，得到滚环扩增产物；
7、流式单分子计数：将所述滚环扩增产物导入流式单分子计数仪中进行流式计数，得到所述dna样本的原始浓度。
8、进一步的，待测dna样本的拷贝数浓度为102-106copies/μl。
9、进一步的，所述锁环探针为环状的长度为60～110个碱基的单链寡核苷酸；所述扩增引物为针对锁环探针设计的引物；所述荧光探为针对所述锁环探针设计的。
10、进一步的，所述滚环扩增反应的温度为25～42℃，时间为2～4小时。
11、进一步的，所述滚环扩增反应采用的酶为equiphi29聚合酶。
12、进一步的，所述流式单分子计数包括测定所述滚环扩增产物单分子的拷贝数含量、采用质量法测定所述滚环扩增产物的流速和单分子计数。
13、进一步的，所述质量法具体为采用精密分析天平称量样品管质量，记为m1；使用单分子计数仪对滚环扩增产物进行计数，每次计数时间持续n分钟后，使用精密分析天平再次称量样本管的质量m2，根据公式1计算滚环扩增产物的流速，计算3次，求平均数作为滚环扩增产物的流速；所述公式1为v＝(m1-m2)/n。
14、进一步的，所述单分子计数包括荧光计数和计算并修正原始计数结果。
15、本发明还提供了上述技术方案所述的基于滚环扩增技术的流式核酸单分子计数方法在dna检测中的应用。
16、与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下的有益效果：
17、(1)本发明巧妙地将滚环扩增即rca等温扩增与单分子计数技术相结合，不仅突破了传统扩增技术对热循环仪的依赖，还实现了对核酸单分子特定序列的高精度检测和定量，这一组合大大提升了核酸检测的敏感性、特异性和准确性；
18、(2)灵敏度高，特异性强，适用于低浓度特定核酸样本的定量；本发明通过rca技术对特异目标核酸片段进行滚换复制，显著提高了检测的灵敏度，适合对102-106copies/μl范围的低浓度核酸样本进行高灵敏度检测，同时采用锁环探针对目标序列进行特异性识别，通过核酸杂交，增强了检测的特异性；
19、(3)本发明基于rca技术，通过激光和液流聚焦、流速控制、峰宽峰高修正等技术，建立了针对低浓度核酸dna分子的“序列特异性的流式核酸单分子计数”方法。无需标准曲线，可实现对低浓度核酸样本的精确定量，是对数字pcr技术的重要补充。同时相比数字pcr，检测成本更低；
20、(4)本发明不仅适用于核酸拷贝数的绝对定量，还可扩展至基因突变检测、微量病原体检测及分子诊断领域，在医学诊断、食品安全检测和环境监测等多领域的广泛应用前景。综上所述，本发明提供了一种灵敏度高、精确性强且操作简便的核酸定量检测方法，为低浓度核酸样本的高效检测提供了全新解决方案，具有显著的技术进步性和广阔的应用前景。