本发明涉及通过多能干细胞制造cd4阳性t细胞、尤其是cd4单阳性（sp）t细胞的方法；通过该方法能够得到的cd4阳性t细胞；以及该t细胞的用途、尤其是作为细胞免疫治疗剂的用途。
背景技术：
1、使用t细胞的过继免疫细胞疗法已被证实其有效性，但由于原则上采用自体移植，因此存在可制备的细胞数量有限、制造耗时、t细胞耗竭等问题。据报道，当对抗原特异性t细胞诱导、克隆后进行初始化来制备诱导多能干细胞（ipsc）时，重编程的t细胞受体（tcr）基因的基因组结构得以遗传（专利文献1、专利文献2）。此前已报道了将由抗原特异性t细胞产生的ipscs再次分化诱导为表现出与来源细胞相同的抗原特异性的t细胞，从而能够制备大量恢复活力的抗原特异性t细胞的方法（专利文献1、专利文献2）。或者，报道了利用由没有抗原特异性的外周血来源的t细胞制备的ipsc，能够制备大量恢复活力的抗原特异性t细胞。但是，虽然这些方法能够始终诱导cd8阳性（cd8+）t细胞，但是即使在由外周血cd4阳性（cd4+）t细胞克隆建立ipsc（cd4t-ipsc）后进行了分化诱导，也无法稳定诱导cd4+t细胞，现状是如果不人工将cd4基因导入ipsc则无法实现诱导（专利文献3）。虽然直接攻击癌细胞的是cd8阳性细胞毒性t细胞（ctl），但cd4阳性辅助性t（th）细胞、尤其是th1细胞在t细胞免疫疗法中至关重要，cd4阳性辅助性t（th）细胞激活ctl，并以干扰素（ifn）-γ依存性的方式抑制作为癌细胞免疫逃逸机制之一的调节t细胞的增殖和积累。
2、另一方面，本发明人等尝试由成人t细胞白血病（atl）细胞建立ipsc（atl-ipsc），并由atl-ipsc再次进行t细胞的分化诱导，从而首次成功实现了cd4+cd25+foxp3+的调节t细胞的诱导（专利文献4）。但是，该t细胞是cd4+cd25+foxp3+，其为调节t细胞，因此应用受到限制。
3、现有技术文献
4、专利文献
5、专利文献1：国际公开第2011/096482号
6、专利文献2：日本专利6164746号公报
7、专利文献3：国际公开第2018/168829号
8、专利文献4：日本特开2021-69322号公报
技术实现思路
1、发明要解决的问题
2、本发明的技术问题在于提供一种通过多能干细胞高效制造非调节性cd4+t细胞的方法。另外，还在于提供一种使用该cd4+t细胞的新型有效的t细胞免疫疗法。
3、用于解决问题的方案
4、本发明人等采用单细胞rna测序（sequencing）分析将所述专利文献3中所述的atl-ipsc来源的cd4+t细胞的基因表达与cd4t-ipsc来源cd8+t细胞的基因表达进行比较发现，与atl-ipsc来源的cd4+t细胞相比，cd4t-ipsc来源cd8+t细胞在6种基因表达上存在差异。为此，本发明人等通过在t-ipsc中敲除作为其中的一种基因的runx3，成功诱导其分化为cd4+t细胞。此外，本发明人还确认到通过使atl-ipsc强制表达runx3，其可分化为cd8+t细胞，并证实了runx3的表达水平决定了向cd4/cd8的分化诱导。另外，本发明人还确认由t-ipsc诱导的cd4+t细胞并非调节t细胞。由cd8t-ipsc诱导的cd4+t细胞虽然cd8阴性，但是保持了mhc i类限制性抗原特异性，产生穿孔素、颗粒酶b，表现出抗原特异性细胞毒活性。与此相对，该cd4+t细胞大量分泌以ifnγ、il-2等th1细胞因子为代表的各种细胞因子，在转录因子、细胞表面分子的表达分析中也表现出th1细胞表型。通过将由t-ipsc诱导的cd4+t细胞与癌抗原特异性ctl、car-t细胞共培养，可在体外和体内两者中均增强其癌抗原特异性细胞毒活性（抑制肿瘤增殖的效果）。
5、本发明人等基于这些发现，进一步持续深入研究从而完成了本发明。
6、即，本发明涉及以下［1］~［18］。
7、［1］一种ipsc来源的cd4+t细胞的制造方法，其包含以下工序：在人ipsc中，敲除选自由runx3、zbtb7b、socs1、socs3和gimap5组成的组中的一种以上的基因，和/或，使runx1基因过表达。
8、［2］根据［1］所述的方法，其中，ipsc源自抗原特异性t细胞、外周血来源的t细胞、外周血单核细胞或成纤维细胞。
9、［3］根据［1］或［2］所述的方法，其中，敲除的基因包含runx3。
10、［4］根据［1］~［3］中任一项所述的方法，其中，cd4+t细胞为cd4单阳性。
11、［5］根据［2］~［4］中任一项所述的方法，其中，抗原特异性t细胞是癌细胞或病毒感染细胞上呈递的抗原肽特异性的，或者，外周血来源的t细胞或外周血单核细胞源自癌症患者或病毒感染者。
12、［6］根据［2］~［5］中任一项所述的方法，其中，抗原特异性t细胞或外周血来源的t细胞为cd8+t细胞。
13、［7］根据［2］~［5］中任一项所述的方法，其中，抗原特异性t细胞或外周血来源的t细胞为cd4+t细胞。
14、［8］一种人cd4+t细胞，其通过［1］~［7］中任一项所述的方法得到。
15、［9］一种人ipsc来源的t细胞，其具有以下性质：
16、（a）为cd4单阳性；
17、（b）具有癌细胞或病毒感染细胞上呈递的抗原肽特异性的tcr；
18、（c）表现出以下中的一种以上的th1细胞表型：
19、（c1）高水平分泌ifnγ和il-2
20、（c2）高水平表达选自由tbx21、stat1和stat4组成的组中的一种以上的基因
21、（c3）表达cd107a和cd366；
22、（d）独立地具有所述（b）的抗原肽特异性的细胞毒活性；以及
23、（e）增强癌抗原或病毒抗原特异性的ctl或car-t细胞的增殖和/或细胞毒活性。
24、［10］根据［9］所述的人ipsc来源的t细胞，其中，敲除了选自由runx3、zbtb7b、socs1、socs3和gimap5组成的组中的一种以上的基因，和/或，runx1基因过表达。
25、［11］一种药物组合物，其含有［8］~［10］中任一项所述的人ipsc来源的cd4+t细胞。
26、［12］根据［11］所述的药物组合物，其为免疫治疗剂。
27、［13］根据［12］所述的药物组合物，其用于癌症或病毒感染症的治疗。
28、［14］根据［13］所述的药物组合物，其中，组合有癌抗原或病毒抗原特异性的ctl或car-t细胞。
29、［15］根据［13］所述的药物组合物，其中，组合有抗原呈递细胞和/或癌细胞或病毒感染细胞上呈递的抗原肽。
30、［16］一种对象的癌症或病毒感染症的治疗方法，其包含以下工序：向该对象给予有效量的［8］~［10］中任一项所述的人ipsc来源的cd4+t细胞。
31、［17］根据［8］~［10］中任一项所述的人ipsc来源的cd4+t细胞，其用于想癌症或病毒感染症的治疗中使用。
32、［18］［8］~［10］中任一项所述的人ipsc来源的cd4+t细胞在制造癌症或病毒感染症的治疗剂中的应用。
33、发明的效果
34、根据本发明，无需导入cd4基因，即可通过ipsc由外周血t细胞稳定生产cd4+t细胞、尤其是cd4sp t细胞。由此，能够高效制造例如可用于癌症免疫疗法的cd4+t细胞。另外，根据本发明得到的cd4+t细胞同时具有th1细胞表型和抗原特异性细胞毒活性，既能独立杀伤靶细胞（例如癌细胞、病毒感染细胞），又能激活靶细胞特异性的ctl。因此，通过与靶细胞特异性的ctl、car-t细胞联合使用，可进一步提升治疗效果。