本技术涉及白介素-15(il-15)突变体，还涉及包含所述il-15突变体的融合蛋白、包含所述il-15突变体的融合蛋白复合物、编码il-15突变体、融合蛋白或融合蛋白复合物的核酸分子、包含核酸分子的载体和宿主细胞，以及包含其的药物组合物和治疗用途，还进一步提供了il-15突变体、融合蛋白及融合蛋白复合物的制备方法。
背景技术：
1、白介素-15(il-15)由大量细胞类型，包括巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和成纤维细胞等组成性表达(grabstein等人，science264(5161):965-68(1994年5月))。il-15可以通过例如细胞因子(例如，gm-csf)、双链mrna、非甲基化cpg寡核苷酸、经由toll样受体的脂多糖，以及干扰素(例如ifn-γ)，或者在例如单核细胞被疱疹病毒、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)和白色念珠菌(candida albicans)的感染后刺激(bamford等人，j immunol 160(9):4418-26(1998年5月))表达。
2、il-15是参与刺激nk细胞、cd8+记忆t细胞和幼稚cd8+细胞的细胞溶解活性、细胞因子分泌、增殖和存活的细胞因子(参见fehniger等人，j immunol 162:4511-20,1999)。作为多效细胞因子，其在先天性和适应性免疫中起重要作用(参见lodolce等人，cytokinegrowth factor rev 13(6):429-39(2002年12月))和alves等人，blood102:2541-46(2003))。已证实，il15-/-转基因小鼠与il-15rα-/-转基因小鼠均表现出缺失周边nk细胞与毒杀性t细胞族群、某些iei亚群，以及大部分记忆表型cd8+t细胞，表明il-15在这些细胞类型的发展、增生及/或存活上发挥功能。
3、il-15受体(il-15r)属于造血因子超家族，由三种亚基组成，α、β(又称为cd122)和γ(又称为cd132，common gamma chain，γc)。其中il-2和il-15共用β链受体。il-2、il-4、il-7、il-9、il-15以及il-21共用γ链受体。il-2和il-15共用β和γc链，但il-2和il-15均有各自特异性α受体链。人il-15rα属于i型跨膜蛋白，il-12rα和il-15rα均有一个保守的蛋白结合基序sushi domain。il-15与il-15rα亲和力比较高(kd～10-11m)，但不传递信号。il-15与il-15rβγ异源二聚体的亲和力中等(kd～10-9m)，可传递信号。il-15与il-15rαβγ异源三聚体的亲和力与前者相似(kd～10-9m)，可传递信号(waldmann,t.a.,2006,nat revimmunol 6:595-601.)。
4、il-15可通过il-15rα、il-2rβ以及γc异三聚体复合物传递信号。新的il-15的作用机制为转呈递作用(trans-presentation)机制。其中，il-15以及il-15rα由抗原呈递细胞(单核球细胞以及树突细胞)协同表达(bergamaschi等人，j biol chem283:4189-99(2008))。结合至il-15α的il-15作为异二聚体转呈递至邻近的仅表达il-2rβ和γc受体的nk细胞或cd8+ t细胞中。就发生于免疫突触的协同刺激事件(co-stimulatory event)而言，il-15转呈递作用目前显示为活体内il-15作用的主要机制，且其显示出在肿瘤免疫监控中扮演主要的角色(waldmann,ta,2006,nature rev.immunol.6:595601，giri等人，emboj.13:2822-30(1994)和giri等人，embo j.14:3654-3663(1995))。
5、与il-2/il-15βγc受体复合物的共享一致，已经显示il-15在体外介导与il-2的功能相似的许多功能。它们共享许多生物活性，并且对t淋巴细胞的存活表现出相似的贡献(参见waldmann等人，annu rev immunol 17:19-49(1999))。il-2和il-15之间的生物学差异可能是由于例如其不同的产生位点、其与膜受体蛋白(分别称为il-2α和il-15rα)的结合强度，以及这些额外的受体分子的调节。il-2和il-15在调节cd8+记忆细胞数目方面发挥作用。
6、有研究表明，降低il-15对t细胞、nk细胞增殖的活性，可以增加il-15的特异性，提高il-15在肿瘤微环境中的浓度，并降低il-15的毒性。因此，开发具有降低活性的il-15突变体，有望提高il-15治疗肿瘤的能力。因此，本领域仍然存在着开发具有改善性质的新il-15分子的需求。
7、本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请所披露的内容，全部以引用方式并入本文。
8、申请概述
9、本技术一方面涉及一种il-15突变体，其包含相对于人野生型il-15氨基酸序列第3位的缬氨酸残基(v3)和第28位的谷氨酸残基(e28)的突变。在一些实施例中，所述人野生型il-15的氨基酸序列如seq id no:1所示。
10、在一些实施例中，本技术所述的il-15突变体，其中e28的突变为e28y。在一些实施例中，其中v3的突变为v3d、v3q、v3n或v3s。
11、在一些实施例中，本技术所述的il-15突变体包含seq id nos:6-8、12中任一所示的氨基酸序列。
12、本技术另一方面涉及另一种il-15突变体，其包含相对于人野生型il-15氨基酸序列的第28位的谷氨酸残基(e28)的突变。在一些实施例中，所述人野生型il-15的氨基酸序列如seq id no:1所示。
13、在一些实施例中，本技术所述的il-15突变体，其中e28的突变为e28i或e28r。
14、在一些实施例中，本技术所述的il-15突变体包含seq id nos:3-4中任一所示的氨基酸序列。
15、本技术另一方面涉及另一种il-15突变体，其包含相对于人野生型il-15氨基酸序列的第105位的组氨酸残基(h105)的突变。在一些实施例中，所述人野生型il-15的氨基酸序列如seq id no:1所示。
16、在一些实施例中，本技术所述的il-15突变体，其中h105的突变为h105d。
17、在一些实施例中，本技术所述的il-15突变体包含如seq id no:5所示的氨基酸序列。
18、本技术另一方面涉及包含il-15突变体的融合蛋白。在一些实施例中，所述融合蛋白还包含fc或和il-15rα或其功能片段。在一些实施例中，所述fc包含能够改变效应功能的突变，和/或能够延长半衰期的突变，和/或能够促进异源多肽形成二聚体的突变。在一些实施例中，所述fc来源于人igg1或人igg4。在一些实施例中，所述il-15rα或其功能片段选自il-15rα胞外区、il-15rαsushi或其功能类似物，优选的为il-15rαsushi。
19、在一些实施例中，如本技术所述的融合蛋白，其中il-15突变体与fc连接。在一些实施例中，其中il-15突变体与fc通过连接肽连接。在一些实施例中，所述连接肽包含seqid nos:23-55中任一所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述连接肽包含氨基酸序列gsggggs(seq id no:55)。
20、在一些实施例中，本技术所述的il-15突变体与fc的融合蛋白，其中il-15突变体位于fc的n端和/或c端。
21、在一些实施例中，本技术所述的融合蛋白，其包含seq id nos:57-62、66中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id nos:57-62、66中任一所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性。
22、另一方面，本技术涉及一种包含il-15突变体的融合蛋白复合物。在一些实施例中，所述融合蛋白复合物包含两个单体，其中：(i)第一个单体包含如本技术所述的包含il-15突变体的融合蛋白，以及(ii)第二个单体包含il-15rα或其功能片段。在一些实施例中，其中所述il-15rα或其功能片段选自il-15rα胞外区、il-15rαsushi或其功能类似物，优选的为il-15rαsushi。其中所述第一个单体的融合蛋白中的il-15突变体部分和第二个单体中的il-15rα或其功能片段非共价结合，形成il-15/il-15rα复合物。
23、在一些实施例中，本技术所述的融合蛋白复合物，其中所述第二个单体还包含fc，优选地，所述fc包含能够改变效应功能的突变，和/或能够延长半衰期的突变，和/或能够促进异源多肽形成二聚体的突变；更优选地，所述fc来源于人igg1或人igg4。
24、在一些实施例中，本技术所述的融合蛋白复合物，其中：第一个单体的融合蛋白中的fc为fc knob，其具有t366w突变；第二个单体中的fc为fc hole，其具有t366s、l368a和y407v突变。其中所述突变位点根据eu编号系统编号。
25、在另一些实施例中，本技术所述的融合蛋白复合物，其中：第一个单体的融合蛋白中的fc为fc hole，其具有t366s、l368a和y407v突变；第二个单体中的fc为fc knob，其具有t366w突变。其中所述突变位点根据eu编号系统编号。
26、在一些实施例中，本技术所述的融合蛋白复合物，其中：
27、(i)第一个单体包含如seq id no:57中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:57中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；以及第二个单体包含如seq id no:67中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:67中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；
28、(ii)第一个单体包含如seq id no:58中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:58中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；以及第二个单体包含如seq id no:67中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:67中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；
29、(iii)第一个单体包含如seq id no:59中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:59中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；以及第二个单体包含如seq id no:67中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:67中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；
30、(iv)第一个单体包含如seq id no:60中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:60中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；以及第二个单体包含如seq id no:67中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:67中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；
31、(v)第一个单体包含如seq id no:61中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:61中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；以及第二个单体包含如seq id no:67中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:67中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；
32、(vi)第一个单体包含如seq id no:62中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:62中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；以及第二个单体包含如seq id no:67中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:67中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；或者
33、(vii)第一个单体包含如seq id no:66中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:66中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性；以及第二个单体包含如seq id no:67中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与seq id no:67中所示的氨基酸序列具有至少约80％序列同源性。
34、同时，本技术还涉及编码本文所述任何il-15突变体、包含il-15突变体的融合蛋白或包含il-15突变体的融合蛋白复合物的分离的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或载体的宿主细胞(例如，cho细胞、hek 293细胞、hela细胞或cos细胞)、组合物(例如，药物组合物)、试剂盒以及包含本文所述任何il-15突变体、包含il-15突变体的融合蛋白或包含il-15突变体的融合蛋白复合物的制品。还涉及使用本文所述任何il-15突变体、其融合蛋白或其融合蛋白复合物、或包含其的药物组合物用于在有需要的个体中(例如，人类)治疗前列腺癌、结肠癌、肾癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、胃和食管癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、头颈癌、神经母细胞瘤、软组织癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤的方法。
技术实现思路