本发明属于分析，具体涉及一种双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管及其制备方法和应用。
背景技术：
1、由于单细胞内天冬酰胺内肽酶含量低且处于动态变化，在单细胞尺度上实现高灵敏、高特异的定量分析，以及获得空间信息存在很大的难度。近年来，纳米毛细管在单细胞分析中引起了极大的关注。纳米毛细管可以精确定位在单个细胞内，步进分辨率小于100nm，可以实现单个细胞亚细胞水平的分析物检测。纳米毛细管电化学技术具有对细胞活性干扰小、灵敏度高、无需对目标物标记、易于功能化等优点，已广泛应用于单个细胞内各种酶的原位分析。例如，徐静娟等人(wang b,weng j,zhang t y,et al.single-cellcaspase-3measurement using a biomimetic nanochannel[j].analytical chemistry,2024,96(5):2094-9.)在纳米毛细管内壁上修饰靶向caspase-3的有机分子luc-devd，caspase-3对luc-devd的特异性切割可引起其内表面化学基团和电荷性质的变化，从而改变了仿生纳米通道的离子电流响应，实现了caspase-3的单细胞采样与检测。尽管方法实现了单细胞内酶的原位灵敏检测，但是无法获得目标分子的空间信息。
2、目前，单细胞内酶活的空间成像主要依赖于荧光成像，其具有非电离辐射、快速反馈、高灵敏度和高时空分辨率等优点，被认为是最有前途的方法。聚集诱导发光(aie)是指一类分子在分散的溶液态不发光，而在分子聚集的状态下荧光显著增强的现象。和传统荧光成像相比，聚集诱导发光荧光成像具有优异的抗光漂白性，并且信噪比高，已被广泛用于细胞和组织的高分辨率、高对比度成像，为疾病的早期诊断和治疗提供重要依据。例如，梁高林等人(xu l,gao h,zhan w,et al.dual aggregations of a near-infraredaggregation-induced emission luminogen for enhanced imaging of alzheimer’sdisease[j].journal of the american chemical society,2023,145(50):27748-56.)设计了一种近红外聚集诱导发光材料，在阿尔茨海默病标志物caspase1的作用下经历cbt-cys点击反应形成环状二聚体实现第一次聚集，进而组装成纳米颗粒完成第二次聚集，用于增强阿尔茨海默病的成像。但该方法需要将探针与细胞孵育使其进入细胞内部，耗时长、反应效率低，并且无法实现单细胞内酶的准确定量。因此，如何在实现单细胞内酶的原位动态分析的同时快速获得空间成像信息是极具挑战的。
技术实现思路
1、发明目的：为了解决上述技术问题，本发明旨在制备功能化纳米毛细管，将纳米毛细管电化学技术与双重聚集增强发光成像相结合，来实现单细胞内天冬酰胺内肽酶(legumain)活的原位动态分析及快速空间成像。功能化纳米毛细管插入单细胞后，毛细管尖端电荷密度的变化将引起离子电流的改变，从而实现了单细胞内酶的原位无损检测，而两次聚集诱导发光发出强烈的荧光信号，实现了单细胞内酶的空间成像。同时在较短时间内获得了整个单细胞的酶活性分布信息，显著推进了单细胞异质性分析，有助于理解legumain在疾病的生理和病理过程中的作用，为疾病的早期诊断、精准治疗及药物评估提供了新的策略。
2、本发明还提供了一种双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管及其制备方法和应用。
3、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种荧光团化合物pytpe-cbt，其结构式如下：
4、
5、本
技术实现要素：
还包括所述的荧光团化合物pytpe-cbt的制备方法，包括以下步骤：
6、1)采用固相多肽合成法制备化合物a，所述化合物a的结构为ac-lys-ala-ala-asn-cys(stbu)-arg-arg；
7、2)氯甲酸异丁酯加入到化合物fmoc-pra-oh、4-甲基吗啉和四氢呋喃的混合物中，在氩气气氛下合成，反应后，加入2-氰-6-氨基苯并噻唑纯化后得到化合物b；
8、3)用哌啶在n,n-二甲基甲酰胺中裂解化合物b的fmoc保护基团，再加入tfa中和碱纯化后得到化合物c；
9、4)化合物a和化合物c溶于dmf，加入催化剂1-羟基苯并三唑、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和n,n-二异丙基乙胺后室温反应，纯化得到化合物d；
10、5)采用tfa、二氯甲烷和三异丙基硅烷，在氩气气氛下过夜去除化合物d的保护基团，纯化得到化合物e；
11、6)在氩气气氛下，将化合物e和pytpe溶解在圆底烧瓶中的二甲基亚砜中得到溶液，将硫酸铜和抗坏血酸钠分散于去离子水中注射到溶液中，室温搅拌纯化得到终产物f即为荧光团化合物pytpe-cbt。
12、本发明内容还包括所述的荧光团化合物pytpe-cbt在制备双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管中的应用。
13、本发明内容还包括一种双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管，所述功能化纳米毛细管包括所述的荧光团化合物pytpe-cbt。
14、本发明所述的双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管管包括纳米毛细管和荧光团化合物ac-lys-ala-ala-asn-cys(stbu)-arg-arg-pra(pytpe)-cbt(pytpe-cbt)。
15、其中，所述功能化纳米毛细管是将荧光团化合物pytpe-cbt与纳米毛细管通过共孵育得到。
16、其中，所述纳米毛细管的小孔端尺寸为300～500nm，优选为400nm。
17、其中，所述荧光团化合物pytpe-cbt的浓度是20μm。
18、本发明内容还包括所述的双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管的制备方法，包括以下步骤：
19、(1)制备荧光团化合物pytpe-cbt；
20、(2)将步骤(1)制备的荧光团化合物pytpe-cbt与纳米毛细管通过共孵育得到功能化纳米毛细管。
21、其中，步骤(2)中所述功能化纳米毛细管的具体制备步骤如下：使用微电极拉制仪拉制纳米毛细管，并使纳米毛细管内壁羟基化，将丁二酸苷和4-二甲氨基吡啶回填于纳米毛细管，在纳米毛细管尖端内表面引入羧基，随后在纳米毛细管内填充1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，最后加入pytpe-cbt，得到pytpe-cbt修饰的纳米毛细管。
22、进一步的，所述步骤(2)中的纳米毛细管使用p-2000微电极拉制仪拉制，并采用倒吸法吸取食人鱼溶液使纳米毛细管内壁羟基化。
23、本发明内容还包括所述的荧光团化合物pytpe-cbt、所述的双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管在空间成像方面的应用。
24、其中，所述应用具体包括在细胞内酶活性的定性和定量方面的检测，作为优选，所述细胞包括乳腺癌单细胞。
25、本发明的设计原理和检测原理：如图1所示，本发明制备的荧光团化合物pytpe-cbt(ac-lys-ala-ala-asn-cys(stbu)-arg-arg-pra(pytpe)-cbt)包含三个部分：(1)legumain的识别模块ala-ala-asn用于legumain特异性识别与切割；(2)一个受stbu保护的cys结构和一个cbt基序，分别连接到arg的羧基端和pra的氨基端用于cbt-cys点击缩合反应；(3)和氨基酸侧链相连的疏水pytpe用于荧光成像。随后将pytpe-cbt修饰在纳米毛细管内部，功能化纳米毛细管通过微操系统插入单细胞中，毛细管的限域效应提高了酶的催化活性，细胞内的legumain将快速切断修饰在毛细管内壁的pytpe-cbt，毛细管尖端电荷密度的变化将引起离子电流的改变，从而实现单细胞内酶的原位无损检测。同时，疏水的pytpe-cbt-cleaved分子释放到细胞内部，经历cbt-cys点击反应形成环状二聚体实现第一次聚集，随后进一步组装成纳米颗粒完成第二次聚集以发出强烈的荧光信号，从而实现单细胞内酶的空间成像。另外，利用纳米毛细管的直接对单细胞进行pytpe-cbt输送，在较短时间内可以获得整个单细胞的酶活性分布信息。
26、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明中首次采用双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管用于单细胞内酶的原位无损分析和空间分布成像。相比较目前的单细胞内酶分析，提供了单细胞内酶的空间分布信息，显著推进单细胞异质性分析，有助于理解legumain在疾病的生理和病理过程中的作用，为疾病的早期诊断、精准治疗及药物评估提供了新的策略。具体包括以下几个方面：
27、1、本发明的双重聚集诱导发光荧光团修饰的功能化纳米毛细管管包括纳米毛细管和荧光团ac-lys-ala-ala-asn-cys(stbu)-arg-arg-pra(pytpe)-cbt(pytpe-cbt)，通过微操系统插入单细胞中，毛细管的限域效应提高了酶的催化活性，细胞内的legumain将快速切断修饰在毛细管内壁的pytpe-cbt，毛细管尖端电荷密度的变化将引起离子电流的改变，实现了单细胞内酶的原位无损检测。
28、2、本发明制备的功能化纳米毛细管与单细胞作用后，疏水的pytpe-cbt-cleaved分子释放到细胞内部，经历cbt-cys点击反应形成环状二聚体实现第一次聚集，随后进一步组装成纳米颗粒完成第二次聚集以发出强烈的荧光信号，从而实现单细胞内酶的空间成像。
29、3、本发明制备的功能化纳米毛细管直接对单细胞进行pytpe-cbt输送，在较短时间内可以获得整个单细胞的酶活性分布信息，能够实现酶活性的定性和定量检测。