本发明是关于一种具有抑制新冠刺突蛋白结合活性的蟾皮硫酸类肝素的制备及其应用，属于天然产物制备纯化领域。
背景技术：
0、技术背景
1、蟾皮是传统的动物中药，蟾皮提取物已被广泛应用于病毒性肝炎、肝硬化的治疗，也可用于原发性肝癌、肺癌及十二指肠癌、胰腺癌、结肠癌等多种消化道肿瘤的治疗。此外，蟾皮提取物还具有减轻疼痛和增强免疫力的显著作用。然而，这些生物活性与蟾皮的化学成分之间的关系尚不明了。已知蟾皮中的生物活性成分包括蛋白质、多肽和小分子，如吲哚烷基胺、核苷和类固醇。糖胺聚糖是动物器官的重要组成部分，但其在蟾皮中的结构和功能的报道甚少。
2、硫酸类肝素是高度复杂的硫酸化多糖，是由重复的二糖单元构成的。它的二糖单元是由己糖醛酸(glca/idoa)与葡萄糖胺(glcn)以1-4糖苷键连接而成，其中硫酸化位点在己糖醛酸c-2-氧位、葡萄糖胺的c-6-氧位和c-3-氧位以及葡萄糖胺的n-位。硫酸类肝素与体内700多种蛋白质相互作用，在免疫应答、炎症调节、病毒感染、血栓形成和血管生成等方面具有重要的调控机能。许多病毒，如单纯疱疹病毒、登革热病毒、hiv和各种冠状病毒，包括近年流行的新冠病毒(sars-cov-2)，都是以硫酸类肝素为受体或辅助受体，通过其特定序列结构与各种病毒蛋白质结合并控制多种病毒感染入侵。sars-cov-2基因组编码29种蛋白，其中刺突蛋白(spikeprotein,s蛋白)是sars-cov-2最大的结构蛋白，负责使病毒进入宿主细胞，也可介导机体免疫反应。具有特定结构的硫酸类肝素/肝素衍生物可作为竞争抑制剂阻断或干扰新冠刺突蛋白与辅助受体的结合，从而抑制sars-cov-2的感染。
技术实现思路
1、本发明的目的在于建立一种具有抑制新冠刺突蛋白结合活性的蟾皮硫酸类肝素的制备法，并发现蟾皮硫酸类肝素在新冠病毒领域的崭新功能，为开发蟾皮新的临床用途奠定基础。
2、为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种具有抑制新冠刺突蛋白结合活性的蟾皮硫酸类肝素，所述蟾皮硫酸类肝素为异质混合物，平均分子量为11kda，由己糖醛酸与葡萄糖胺以1-4糖苷键连接的二糖单元租成，其中己糖醛酸c-2-氧位、葡萄糖胺的c-6-氧位和n-位点的总硫酸化程度分别为11.45％、33.68％和46.46％。
4、上述一种蟾皮硫酸类肝素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
5、(1)干蟾皮破碎成粉末后水浴加热溶胀，用碱性蛋白酶进行酶解，灭酶，离心后收集上清液；将收集的上清液进行醇沉，离心后收集沉淀；将收集的沉淀利用阴离子交换柱分离纯化，经过透析、冷冻干燥得到蟾皮糖胺聚糖粗提物；
6、(2)将步骤(1)的蟾皮糖胺聚糖粗提物用硫酸软骨素abc酶进行酶解，灭酶，离心后收集上清液；将收集的上清液利用凝胶色谱柱分离纯化，经过除盐、冷冻干燥得到蟾皮硫酸类肝素。
7、上述步骤(1)具体为：取0.2～0.6g干蟾皮粉末溶于10～30ml超纯水，50～70℃水浴加热溶胀12～36h，冷却后将ph值调至7～9，再加入10～20mg/g干蟾皮粉末的碱性蛋白酶，36～60℃水浴加热酶解24～48h，灭酶，以10000rpm离心10～20min后收集上清液；向收集的上清液中加入预冷乙醇，静沉，以10000rpm离心10～20min后收集沉淀；将收集的沉淀溶解于20mm磷酸钠缓冲液中，然后加入已用含0.1m nacl的10～50mm磷酸钠缓冲液平衡过的deae阴离子交换柱，用平衡液充分洗脱之后，用含2.0m nacl的10～50mm磷酸钠缓冲液分离洗脱，以3ml/管收集洗脱馏分，并进行紫外检测，检测波长212nm；deae收集到的馏分装入截留分子量为1000～5000da的透析膜，于2～5℃在去离子水中透析2～4天，冷冻干燥，得到蟾皮糖胺聚糖粗提物。
8、上述步骤(2)具体为：用300～600mu硫酸软骨素abc酶酶解步骤(1)得到的蟾皮糖胺聚糖粗提物，酶解条件：36～40℃、24～48h，酶解结束灭酶，以10000rpm离心10～20min后收集上清液；将收集的上清液利用凝胶色谱superdextm75柱进行分离纯化，流动相为0.1～0.3m的nh4hco3水溶液，洗脱速度0.2～0.5ml/min，检测波长232nm；收集18～30min的出峰洗脱液，55～65℃水浴以除去其中所含的nh4hco3，冷冻干燥，得到蟾皮硫酸类肝素。
9、上述一种蟾皮硫酸类肝素在抑制新冠刺突蛋白与辅助受体结合活性中的应用；
10、进一步的，所述应用具体为：以蟾皮硫酸类肝素为竞争抑制剂，利用spr的肝素-sa-芯片体系模拟体内新冠刺突蛋白受体结合区域与其辅助共受体肝素/硫酸类肝素的相互作用，表征不同浓度蟾皮硫酸类肝素对新冠刺突蛋白受体结合区域与肝素芯片的抑制响应曲线，计算抑制活性ic50；所用芯片：肝素-sa芯片，样品流速：10～30μl/min，结合时间：120～200s，解离时间：300～500s；分析结束后使用2mol/l的nacl溶液再生芯片表面，时间：3～5min。
11、上述一种蟾皮硫酸类肝素在作为新冠刺突蛋白结合活性抑制剂中的应用。
12、上述一种蟾皮硫酸类肝素在制备抑制新冠病毒药物中的应用。
13、本发明的显著优点在于：
14、本发明通过建立蟾皮硫酸类肝素制备提纯的新方法，发现其具有抑制新冠刺突蛋白结合活性的新功能。由于国内外未见有关蟾皮硫酸类肝素抑制新冠刺突蛋白结合活性的报道，因此本发明具有原创性，为开发蟾皮新的临床用途奠定重要基础。
1.一种具有抑制新冠刺突蛋白结合活性的蟾皮硫酸类肝素，其特征在于：所述蟾皮硫酸类肝素为异质混合物，平均分子量为11kda，由己糖醛酸与葡萄糖胺以1-4糖苷键连接的二糖单元租成，其中己糖醛酸c-2-氧位、葡萄糖胺的c-6-氧位和n-位点的总硫酸化程度分别为11.45%、33.68%和46.46%。
2.一种如权利要求1所述的蟾皮硫酸类肝素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）具体为：取0.2~0.6g干蟾皮粉末溶于10~30ml超纯水，50~70℃水浴加热溶胀12~36h，冷却后将ph值调至7~9，再加入10~20mg/g干蟾皮粉末的碱性蛋白酶，36~60℃水浴加热酶解24~48h，灭酶，以10000rpm离心10~20min后收集上清液；向收集的上清液中加入预冷乙醇，静沉，以10000rpm离心10~20min后收集沉淀；将收集的沉淀溶解于20mm磷酸钠缓冲液中，然后加入已用含0.1m nacl的10~50mm磷酸钠缓冲液平衡过的deae阴离子交换柱，用平衡液充分洗脱之后，用含2.0m nacl的10~50mm磷酸钠缓冲液分离洗脱，以3ml/管收集洗脱馏分，并进行紫外检测，检测波长212nm；deae收集到的馏分装入截留分子量为1000~5000da的透析膜，于2~5℃在去离子水中透析2~4天，冷冻干燥，得到蟾皮糖胺聚糖粗提物。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）具体为：用300~600mu硫酸软骨素abc酶酶解步骤（1）得到的蟾皮糖胺聚糖粗提物，酶解条件：36~40℃、24~48h，酶解结束灭酶，以10000rpm离心10~20min后收集上清液；将收集的上清液利用凝胶色谱superdex™75柱进行分离纯化，流动相为0.1~0.3m的nh4hco3水溶液，洗脱速度0.2~0.5ml/min，检测波长232nm；收集18~30min的出峰洗脱液，55~65℃水浴以除去其中所含的nh4hco3，冷冻干燥，得到蟾皮硫酸类肝素。
5.如权利要求1所述的蟾皮硫酸类肝素在抑制新冠刺突蛋白与辅助受体结合活性中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：以蟾皮硫酸类肝素为竞争抑制剂，利用spr的肝素-sa-芯片体系模拟体内新冠刺突蛋白受体结合区域与其辅助共受体肝素/硫酸类肝素的相互作用，表征不同浓度蟾皮硫酸类肝素对新冠刺突蛋白受体结合区域与肝素芯片的抑制响应曲线，计算抑制活性ic50；所用芯片：肝素-sa芯片，样品流速：10~30μl/min，结合时间：120~200s，解离时间：300~500s；分析结束后使用2mol/l的nacl溶液再生芯片表面，时间：3~5min。
7.如权利要求1所述的蟾皮硫酸类肝素在作为新冠刺突蛋白结合活性抑制剂中的应用。
8.如权利要求1所述的蟾皮硫酸类肝素在制备抑制新冠病毒药物中的应用。