本发明属于微生物应用，具体涉及一种产l-丙氨酸的基因工程菌及其在两段式发酵l-丙氨酸中的应用。
背景技术：
1、l-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸，广泛应用于医药、食品、饲料等领域。由于l-丙氨酸具有甜味，也被用作食品添加剂。在传统工业生产上，l-丙氨酸通过固定化细胞催化底物天冬氨酸脱羧生成，产率大于90％。而这种酶催化生产方式的底物l-天冬氨酸通常由富马酸通过天冬氨酸解氨酶催化获得。富马酸主要由不可再生原料石油生产，因此l-丙氨酸的使用在一定程度上受到高成本的限制。微生物发酵法反应条件温和，能够使用可再生原料葡萄糖等。目前研究较多的l-丙氨酸生产菌株包括：重组大肠杆菌、重组谷氨酸棒杆菌、重组乳酸乳球菌、梭状芽孢杆菌、氧化节杆菌等。由于大肠杆菌具有遗传背景清晰，易于基因工程操作等优点，已成为生产l-丙氨酸的主要菌株。然而，目前大肠杆菌发酵法仍存在发酵周期长，产量低，副产物多等问题。
2、需钠弧菌(vibrio natriegens)是已知生长最快的微生物，它的倍增时间小于10分钟，是大肠杆菌的一半。因此，改造需钠弧菌为l-丙氨酸的细胞工厂，可以大大节约发酵时间和生产成本。其次，需钠弧菌中不含有丙氨酸消旋酶，因此利用需钠弧菌生产的丙氨酸光学纯度高，不会自发外消旋。最后，需钠弧菌基因组中天然带有催化丙酮酸转化为l-丙氨酸的丙氨酸脱氢酶alad基因。需钠弧菌作为一种新型微生物底盘，尚不知其l-丙氨酸的生产能力。
技术实现思路
1、针对现有技术中使用需钠弧菌作为底盘菌生产l-丙氨酸的能力未知的缺陷，本发明提供了一种产l-丙氨酸的基因工程菌及其在两段式发酵l-丙氨酸中的应用，具体技术方案如下：
2、第一方面，本发明提供了一种产l-丙氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌以需钠弧菌为底盘菌，所述基因工程菌共表达丙氨酸脱氢酶基因、丙氨酸转运蛋白基因；
3、所述丙氨酸脱氢酶基因为ncbi库中登录号ef154460.1或pn9607945中的一种。
4、在本技术中，将丙氨酸脱氢酶基因、丙氨酸转运蛋白基因导入到需钠弧菌中，丙氨酸脱氢酶可以将丙酮酸转化为l-丙氨酸，在需钠弧菌胞内发生的糖酵解过程会将葡萄糖转化为丙酮酸，使得重组后的需钠弧菌获得生产l-丙氨酸的能力。由于l-丙氨酸在胞内的大量积累会引起细胞毒性并影响细胞正常的生长代谢，因此利用丙氨酸转运蛋白将l-丙氨酸将l-丙氨酸及时转运到胞外，保证l-丙氨酸生产过程的正常进行。
5、进一步地，所述丙氨酸脱氢酶基因与丙氨酸转运蛋白基因在底盘菌中表达的方式为下列之一：
6、(1)以重组质粒的形式在底盘菌内表达；
7、(2)以表达盒的形式插入至底盘菌基因组内表达。
8、进一步地，所述丙氨酸脱氢酶基因以表达盒的形式插入至底盘菌基因组内表达，拷贝数为1～5。
9、更进一步地，所述拷贝数为5。
10、进一步地，所述基因工程菌中，底盘菌基因组上的影响l-乳酸、d-乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醇、甲酸合成的基因中的一种或多种基因功能缺失。
11、更进一步地，所述基因工程菌中，底盘菌基因组上的合成l-乳酸、d-乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醇、甲酸所需的基因中的一种或多种基因功能缺失；底盘菌基因组上编码核酸酶的基因功能缺失；
12、所述合成l-乳酸所需的基因包括pn96_04755、pn96_19735、pn96_16800；所述合成d-乳酸所需的基因包括pn96_16785；所述影响琥珀酸合成或合成琥珀酸所需的基因包括pn96_09285；所述合成乙酸所需的基因包括pn96_03365、pn96_21510、pn96_20020；所述合成乙醇所需的基因包括pn96_03185、pn96_04715；所述合成甲酸所需的基因包括pn96_08455；
13、所述编码核酸酶的基因为dns基因。
14、本技术中，丙氨酸脱氢酶利用丙酮酸合成l-丙氨酸，丙酮酸是需钠弧菌利用葡萄糖进行糖酵解以及三羧酸循环过程中重要的底物以及中间产物，但是在需钠弧菌体内，糖酵解以及三羧酸循环过程中的中间产物种类很多，有多种酶可以利用这些中间产物，会与丙氨酸脱氢酶催化的反应产生竞争，使得一部分葡萄糖没有最终转化为l-丙氨酸，影响了本技术中葡萄糖到l-丙氨酸这一过程的产率，因此，本技术将需钠弧菌基因组中会产生上述影响的基因进行功能缺失，以保证本技术中生产过程的效率与产量。
15、本技术中，所述合成l-乳酸所需的基因，是指在需钠弧菌中利用由葡萄糖出发转化得到的糖酵解中间产物或三羧酸循环过程中的中间产物，合成l-乳酸的蛋白的编码基因。上述生成l-乳酸的蛋白包括methylglyoxal synthase(甲基乙二醛合酶)pn96_04755、甲基乙二醛合酶pn96_19735以及malate dehydrogenase(苹果酸脱氢酶)pn96_16800。所述甲基乙二醛合酶可以将二羟基丙酮磷酸(dhap)转化为甲基乙二醛，在胞内进一步合成l-乳酸；所述苹果酸脱氢酶可将l-苹果酸转化为草酰乙酸，在胞内进一步合成l-乳酸。
16、本技术中，所述合成d-乳酸所需的基因，是指在需钠弧菌中利用由葡萄糖出发转化得到的糖酵解中间产物生成d-乳酸的蛋白的编码基因，所述生成l-乳酸的蛋白包括lactate dehydrogenase(乳酸脱氢酶)pn96_16785，所述乳酸脱氢酶可将丙酮酸转化为d-乳酸。
17、本技术中，所述影响琥珀酸合成的基因或合成琥珀酸所需的基因，是指succinatedehydrogenase(琥珀酸脱氢酶)的编码基因，所述琥珀酸脱氢酶可以催化琥珀酸脱氢与延胡索酸的相互转化，所述琥珀酸脱氢酶包括pn96_09285。
18、本技术中，所述影响乙酸合成的基因或合成乙酸所需的基因，包括acetatekinase(乙酸激酶)pn96_03365、pn96_21510以及3-oxoacid coa-transferase(3-氧代酸辅酶a转移酶)pn96_20020的编码基因；所述乙酸激酶可以催化乙酸与乙酰磷酸的相互转化；所述3-氧代酸辅酶a转移酶可以催化乙酰乙酸与琥珀酸的相互转化，进而影响乙酸的合成。
19、本技术中，所述影响乙醇合成的基因或合成乙醇所需的基因，包括acetaldehydedehydrogenase(乙醛脱氢酶)pn96_03185、pn96_04715的编码基因；所述乙醛脱氢酶可以将乙醛转化为乙酸，也可催化乙酰辅酶a到乙醛到乙醇的路径，在需钠弧菌体内会影响乙醇的合成。
20、本技术中，所述影响甲酸合成的基因或合成甲酸所需的基因，包括pyruvateformate-lyase(丙酮酸甲酸裂解酶)pn96_08455的编码基因；所述丙酮酸甲酸裂解酶可以催化丙酮酸产生甲酸。
21、进一步地，所述丙氨酸转运蛋白基因以表达盒的形式插入至底盘菌基因组内表达。
22、更进一步地，所述丙氨酸转运蛋白基因插入到在底盘菌基因组内dns基因之间。
23、进一步地，所述底盘菌基因组上的合成l-乳酸、d-乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醇、甲酸所需的基因中的7～9个基因功能缺失。
24、更进一步地，所述底盘菌基因组中pn96_04755、pn96_19735、pn96_16800、pn96_16785、pn96_09285、pn96_03365、pn96_21510、pn96_20020、pn96_03185、pn96_04715、pn96_08455中的7～9个基因功能缺失。
25、进一步地，基因工程菌中，启动丙氨酸脱氢酶基因表达的启动子为诱导型启动子；所述诱导型启动子为乳糖诱导型启动子plac、ptac以及温敏型λpr-pl启动子中的一种。
26、进一步地，所述丙氨酸转运蛋白基因为alae基因。
27、更进一步地，所述alae基因在ncbi库中登录号为np_417156。
28、更进一步地，所述诱导型启动子为温敏型λpr-pl启动子。
29、更进一步地，所述温敏型λpr-pl启动子在37℃～42℃时启动下游丙氨酸脱氢酶基因(alad基因)表达。
30、第二方面，本发明提供了上述的基因工程菌在生产l-丙氨酸中的应用。
31、第三方面，本发明提供了一种两段式生产l-丙氨酸的方法，包括：
32、s1：对上述基因工程菌进行发酵培养，发酵培养过程在26-35℃条件下进行；
33、s2：以葡萄糖为底物，使用s1中培养好的基因工程菌菌体作为催化剂组成反应体系，催化生产l-丙氨酸，生产过程在37～42℃、限氧条件下进行；
34、基因工程菌中，启动丙氨酸脱氢酶基因表达的启动子为温敏型λpr-pl启动子。
35、进一步地，所述温敏型λpr-pl启动子在37℃～42℃时启动下游alad基因表达。
36、进一步地，s2中，生产过程在37℃、限氧条件下进行。
37、更进一步地，所述限氧条件为：溶氧低于20％。
38、进一步地，s1中，发酵培养时间为4～8h。
39、更进一步地，所述发酵培养时间为5h。
40、进一步地，s1中，生产过程在有氧条件下进行。
41、进一步地，s2中，葡萄糖浓度为20～30g/l，反应时间为6～10h。
42、更进一步地，s2中，葡萄糖浓度为25g/l，反应时间为8h。
43、进一步地，s1中，发酵培养的培养基组成为：硫酸铵5～15g/l、氯化钠15～25g/l、mops20～25g/l、磷酸二氢钾0.5～2g/l、磷酸氢二钾0.5～2g/l、硫酸镁0.2～0.5g/l、氯化钙0.01～0.03g/l、七水合硫酸亚铁15～18mg/l、一水合硫酸锰5～15mg/l、五水合硫酸酮0.2～0.6mg/l、七水合硫酸锌0.5～1.5mg/l、六水合氯化镍0.01～0.05mg/l、葡萄糖5～10g/l。
44、进一步地，s1中，发酵培养基中，基因工程菌的接种量为1～2％。
45、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
46、本发明在需钠弧菌基因组中异源引入丙氨酸脱氢酶基因，并且通过随机失活副产物产生途径中的关键酶，找出对l-丙氨酸产量最优的失活基因组合，构建获得能通过发酵法高效生产l-丙氨酸的需钠弧菌基因工程菌。本发明通过温敏型控制策略，使用基因工程菌进行两阶段发酵生产l-丙氨酸，以降低l-丙氨酸的积累对细胞生长的影响，具有较高的生产效率。本发明的基因工程菌生长周期短，能高效利用葡萄糖将其转化为l-丙氨酸，并将其转运至胞外，分离纯化简单，无需细胞破碎，l-丙氨酸的产量、转化率均可达到较高的水平。