本申请属于多肽制备领域，具体地，涉及一种肉苁蓉多肽的制备方法及应用。
背景技术：
1、肉苁蓉作为传统滋补药材，其富含的多糖、苯乙醇苷及蛋白质等活性成分已被证实具有抗氧化与抗疲劳功效，但现有提取技术存在明显局限。
2、常规物理破壁或单一酶解法难以充分释放细胞壁内的活性蛋白，导致多肽得率不足；高温或强酸碱处理易破坏热敏性功能肽段，造成抗氧化活性与抗疲劳效果大幅衰减。有研究人员尝试复合酶解或微生物发酵，但因酶系组合不当或菌种功能单一，仍无法协同释放并修饰活性肽，致使产品表现不佳。
3、综上，如何通过工艺创新实现活性肽的高效制备与功效提升，成为产业亟待突破的瓶颈。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种结合多重复合酶制剂分步酶解以及结合复合菌联合发酵的制备工艺，实现肉苁蓉多肽中活性物质高效制备和功效提升。
2、为了实现上述目的，本发明公开了以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种肉苁蓉多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
4、步骤1.将干燥肉苁蓉进行粉碎过筛，得到肉苁蓉粉末，将所述粉末与饮用水混合，然后进行破壁处理，得到肉苁蓉匀浆；
5、步骤2.在肉苁蓉匀浆中加入胰凝乳蛋白酶，酶解5-7h，得到酶解液1，将酶解液1进行灭酶处理，在灭酶后的酶解液1中加入复合酶制剂，酶解3-4h，得到酶解液2，将酶解液2进行灭菌处理；
6、步骤3.取青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的复合菌液接种至灭菌后的酶解液2中，按酶解液2体积计，接种量为10-13v/v％，在35-37℃、转速100-150r/min的培养条件下发酵培养48-60h，得到发酵液；
7、步骤4.将发酵液在5000-8000r/min下离心去渣，取上清液先用1000da的超滤膜超滤，收集滤液再用800da的纳滤膜纳滤，得到截留液并浓缩，将浓缩液进行喷雾干燥，得所述肉苁蓉多肽；
8、优选地，所述复合酶制剂由猕猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶和风味蛋白酶组成；
9、优选地，所述酶解液1加热至80-90℃保温15-20min进行灭酶处理；
10、优选地，所述酶解液2的灭菌条件为121℃，20-30min；
11、优选地，所述复合菌液中青春双歧杆菌活菌数≥1×108cfu/ml，嗜酸乳杆菌活菌数≥1×106cfu/ml；
12、优选地，所述步骤4中将截留液置于旋转蒸发器中在60-70℃、50-60r/min的条件下进行浓缩3-4h。
13、优选地，所述步骤1中肉苁蓉和饮用水按质量体积比1:20-30g/ml进行混合。
14、优选地，所述步骤1的破壁在25000-30000r/min下破壁粉碎10-15min。
15、优选地，所述胰凝乳蛋白酶酶活为1500-2000u/g。
16、优选地，所述猕猴桃蛋白酶酶活为1000-1500u/g，生姜蛋白酶酶活为800-1000u/g，风味蛋白酶酶活为2000-2500u/g。
17、进一步优选地，所述胰凝乳蛋白酶的添加量为肉苁蓉匀浆质量的8-10％，在35-37℃下进行酶解，酶解过程中每隔半小时搅拌一次。
18、进一步优选地，所述复合酶制剂的添加量为酶解液1质量的5-7％，在45-55℃、转速10-20r/min下进行酶解。
19、第二方面，本发明提供了一种肉苁蓉多肽，所述肉苁蓉多肽由第一方面所述的制备方法制备得到。
20、第三方面，本发明提供了第二方面所述的肉苁蓉多肽在制备具有抗氧化、抗疲劳功效的产品上的应用。
21、第四方面，本发明提供了第二方面所述的肉苁蓉多肽在制备具有抗氧化、抗疲劳功效的保健食品上的应用。
22、本发明中：
23、申请人依据不同蛋白酶对特定氨基酸序列或肽键具有选择性，将现有技术中的诸多蛋白酶进行组合并从中筛选出适用于生产肉苁蓉多肽的组合。本发明的肉苁蓉多肽的制备方法中采用分步酶解的方式，两步酶解中胰凝乳蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶和风味蛋白酶所构成的蛋白酶体系具有不同的切割位点和特异性，联合使用覆盖了更广泛的切割位点，并且实现协同作用，提高了蛋白质的酶解效率，确保蛋白质被充分酶解；且本发明中还通过调整不同蛋白酶的种类、比例和酶解条件，有效控制生成多肽的长度分布和种类，增强了制备获得的肉苁蓉多肽的生物活性，并同时提高了目标多肽的回收率，减少副产物；还改善了酶解液的不良气味。
24、青春双歧杆菌是严格厌氧菌，嗜酸乳杆菌是兼性厌氧菌，它们在厌氧条件下形成共生体系，青春双歧杆菌代谢产生短链脂肪酸，降低ph值激活嗜酸乳杆菌的蛋白酶，这种级联反应产生了能够有效清除自由基的谷胱甘肽类似物支链氨基酸肽段，进而提高肉苁蓉目标多肽的功效性能。
25、本发明的有益效果：
26、1.本发明通过采用胰凝乳蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶与风味蛋白酶的特异性组合进行分步酶解，并进一步利用青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的双菌协同发酵工艺，有效克服了传统单酶法或单一菌种发酵效率低下的局限，这种酶解与发酵的协同作用能够更充分地获取肉苁蓉中的活性肽段，从而显著增强最终产品的抗氧化能力和抗疲劳效果；
27、2.本发明提供的分步酶解法与复合发酵法协同搭配，有效提高了800-1000da的小分子肽收率；
28、3.本发明创造性地整合了高转速破壁、特异性复合酶解及双菌协同发酵等关键步骤，形成了一套高效、稳定的制备体系，该工艺简单，有利于后续功能产品的开发应用。
1.一种肉苁蓉多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中肉苁蓉和饮用水按质量体积比1:20-30g/ml进行混合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1的破壁在25000-30000r/min下破壁粉碎10-15min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胰凝乳蛋白酶的添加量为肉苁蓉匀浆质量的8-10％，在35-37℃下进行酶解，酶解过程中每隔半小时搅拌一次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述复合酶制剂的添加量为酶解液1质量的5-7％，在45-55℃、搅拌转速10-20r/min下进行酶解。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述灭酶处理是将酶解液1加热至80-90℃保温15-20min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中将截留液置于旋转蒸发器中在60-70℃、50-60r/min的条件下进行浓缩3-4h。
8.一种肉苁蓉多肽，其特征在于，所述肉苁蓉多肽由权利要求1-7任意一项所述的制备方法制备得到。
9.权利要求8所述的肉苁蓉多肽在制备具有抗氧化、抗疲劳功效的产品上的应用。
10.权利要求8所述的肉苁蓉多肽在制备具有抗氧化、抗疲劳功效的保健食品上的应用。