本发明涉及生物医学，具体涉及一种高亲和力识别hcv基因3型和基因6型核心蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
1、根据检测靶标不同，hcv检测试剂主要分为三类，即抗丙型肝炎病毒抗体（hcv-ab）检测试剂、丙型肝炎病毒核酸（hcv-rna）检测试剂以及丙型肝炎病毒核心抗原（hcv-cag）检测试剂。
2、hcv-ab检测试剂以抗丙型肝炎病毒抗体为检测靶标。抗丙型肝炎病毒抗体是hcv感染机体后感染者免疫系统产生的免疫球蛋白，但是hcv-ab出现时间晚，往往在感染丙型肝炎病毒70天以后才产生，窗口期长，而且产生的hcv-ab在患者体内长期存在，部分患者可能伴随终身，因此，检测hcv-ab虽然可以提示hcv感染，但是早期未产生抗体的感染者会被漏检，同时不能区分是现症感染，还是既往感染。除此之外，免疫抑制与血液透析患者丙肝抗体可能为持续阴性，增加漏检几率。
3、hcv-rna检测试剂以丙型肝炎病毒核酸为检测靶标。hcv感染后基因组复制出现较早，感染后数天即出现病毒血症，大约1~2周即可检测到hcv-rna。因此，hcv-rna检测是诊断hcv感染的“金标准”，同时也是判断病毒是否有活动性复制的有力证据和指导临床治疗的依据。与hcv-ab检测相比，hcv-rna检测可大大缩短窗口期，从8~11周缩短至2周，实现早期诊断。但是，hcv-rna检测技术对仪器、设备以及人员均有较高要求。
4、hcv-cag检测试剂以丙型肝炎病毒核心抗原为检测靶标。hcv基因组编码10种病毒蛋白，核心蛋白是3种结构蛋白之一，其氨基酸序列在不同hcv基因型间保守，成熟蛋白无糖基化位点，抗原性强，是免疫检测的良好标志物。hcv核心蛋白由信号肽酶从多蛋白中释放出来，是一个23 kda的前体蛋白，含有191个氨基酸，该前体核心蛋白随后被信号肽肽酶加工，切除羧基端的部分肽段，产生含177个氨基酸的成熟核心蛋白。hcv 核心抗原是hcv早期感染的重要标志，其几乎与hcv-rna同时出现，平均检出时间只比hcv-rna晚约1~2天。与hcv-rna检测一样，hcv-cag检测同样可以大大缩短窗口期，实现早期诊断。由于hcv-cag检测试剂既有快速、简便的特点，又具有媲美hcv-rna的早期诊断的优点，因此，在hcv-rna检测条件不可及的情况下，hcv-cag检测成为医疗机构的首选替代方法。但是，多项研究的荟萃分析显示，现有hcv-cag检测试剂虽然具有非常高的特异性99.4%，但是敏感性较低，为87.1%，与hcv rna检测阳性符合率约为87％(hsin-yun sun, wang-da liu, chih-wenwang, et al. performance of hepatitis c virus (hcv) core antigen assay in thediagnosis of recently acquired hcv infection among high-risk populations.microbiol spectr. 2022; 10(3): e00345-22. published online 2022 may 17. doi:10.1128/spectrum.00345-22)，分析其原因如下：
5、第一，hcv基因型分布发生明显变化，在我国基因3型和基因6型丙型肝炎病毒占比显著升高。已有研究证明(yu xiang, xiao-fei lai, pu chen, yang yang. thecorrelation of hcv rna and hcv core antigen in different genotypes of hcv. jclin lab anal. 2019 jan; 33(1): e22632. published online 2018 aug 1. doi:10.1002/jcla.22632.)，hcv核心抗原表达水平在不同基因型之间存在显著差异，1b基因型中的核心蛋白表达水平（~1710 fmol/l）显著高于3b（~60 fmol/l）、6a基因型（~780 fmol/l）和1b/3b混合基因型（~460 fmol/l），对于1b基因型hcv rna载量与hcv cag表达水平呈正相关，其他基因型hcv rna与hcv cag之间无相关性，从而造成hcv-cag的检出率低于hcvrna的检出率。因此，hcv cag检测试剂需要进一步提高灵敏度，以应对低hcv cag表达水平基因型占比显著增加的变化。
6、第二，hcv是一种极易发生突变的rna病毒，由于其基因突变率高，导致抗原变异性大。虽然核心蛋白是hcv中最为保守的蛋白，但是不同基因型核心蛋白氨基酸序列仍存在近10%的差异。hcv-cag检测试剂是基于双抗体夹心法进行检测，且均采用特异性单克隆抗体，关键表位氨基酸的突变有可能导致抗体对抗原的识别结合能力下降，如有文献报道hcv核心蛋白第49位氨基酸的突变降低了抗原测定的敏感性(李鹏. 丙型肝炎病毒核心抗原检测技术的现状. 临床输血与检验, 2011,13(2): 191-192. doi: 10.3969/j.issn.1671-2587.2011.02.0420，还有研究证明3种抗原试剂的最低检测限均受hcv基因3型（尤其是3b亚型）毒株核心区氨基酸多态性的影响（杨瑞锋, 刘宁, 卞成蓉等. 多种丙型肝炎病毒核心抗原试剂用于临床感染筛查的多中心性能评价. 中华检验医学杂志，2023,46(12)：1305-1312. doi: 10.3760/cma.j.cn114452-20230718-00014）。因此，为应对基因3型和基因6型丙型肝炎病毒占比显著升高的变化，有必要增加对基因3型和基因6型hcv核心蛋白具有高亲和力的抗体，进一步提高现有hcv cag抗原检测试剂的灵敏度。
7、因此，本发明旨在通过以基因3型和基因6型hcv核心蛋白共有优势表位序列作为免疫原，并结合快速反应筛选技术制备对基因3型和基因6型hcv核心蛋白具有高亲和力的单克隆抗体，以期能够进一步提高现有丙型肝炎病毒核心抗原（hcv cag）检测试剂的灵敏度。
技术实现思路
1、为此，本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的对hcv基因3型和基因6型核心蛋白均具有高亲和力的单克隆抗体，并且经过实验获得的单克隆抗体对hcv基因1型和基因2型核心蛋白同样具有高亲和力，在捕获传统hcv基因型核心蛋白的基础上，加强了对新流行hcv基因型核心蛋白的检出能力，因此可以用于丙型肝炎病毒核心抗原（hcv cag）的定性和定量检测。
2、因此，本发明一个方面涉及一种对hcv基因3型和基因6型核心蛋白均具有高亲和力的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3，轻链可变区包括轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3，其中，
3、所述重链cdr1的氨基酸序列为seq id no.2所示序列或与seq id no.2所示序列相比具有1个保守性氨基酸替换的氨基酸序列；
4、所述重链cdr2的氨基酸序列为seq id no.3所示序列或与seq id no.3所示序列相比具有1个保守性氨基酸替换的氨基酸序列；
5、所述重链cdr3的氨基酸序列为seq id no.4所示序列或与seq id no.4所示序列相比具有1个保守性氨基酸替换的氨基酸序列；
6、所述轻链cdr1的氨基酸序列为seq id no.6所示序列或与seq id no.6所示序列相比具有1个保守性氨基酸替换的氨基酸序列；
7、所述轻链cdr2的氨基酸序列为lvs或与其相比具有1个保守性氨基酸替换的氨基酸序列；
8、所述轻链cdr3的氨基酸序列为seq id no.7所示序列或与seq id no.7所示序列相比具有1个保守性氨基酸替换的氨基酸序列。
9、在进一步的方面中，本发明还涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区氨基酸序列为seq id no.1所示序列，所述轻链可变区氨基酸序列为seq id no.5所示序列。
10、本发明还涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体，这些抗体或抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区，或者仅保留了重链可变区，因此能够高亲和力识别hcv基因3型和基因6型核心蛋白，以及hcv基因1型和基因2型核心蛋白。
11、此外，本发明还涉及包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸的一种核酸分子，以及包含上述核酸分子的表达载体，所述表达载体能够表达上述的抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体，其可以产生上述抗体或其抗原结合片段。另一方面，本发明涉及一种高亲和力识别hcv基因3型和基因6型核心蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌上述的单克隆抗体。进一步地，本发明涉及对hcv基因3型和基因6型核心蛋白均具有高亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株1014，保藏号为cgmcc no.46562。
12、再一方面，本发明涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测丙型肝炎病毒核心抗原(hcv cag)的产品中的应用。进一步地，本发明涉及一种用于检测丙型肝炎病毒核心抗原（hcv cag）的试剂盒，所述试剂盒包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段，用于高亲和力结合hcv cag；优选地，所述的试剂盒为双抗体夹心检测试剂盒，所述单克隆抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体。
13、生物材料保藏说明
14、本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株已经提交保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏中心登记入册编号为cgmcc no. 46562，保藏日期为2025年7月16日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。