本发明属于基因工程和合成生物学，具体涉及一种生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、黄酮类化合物是广泛存在于自然界植物中的次级代谢产物，目前已有超过10000种黄酮类化合物的结构被表征。其基本骨核为2-苯基色原酮，通常是由两个含有酚羟基的苯环(a环和b环)通过三碳结构连接在一起的c3-c3-c6单元。根据c3结构是否成环、取代以及氧化程度等可划分为查耳酮类(chalcones)、黄酮类(flavones)、花青素类(anthocyanidins)、黄酮醇类(flavonols)、异黄酮类(isoflavones)等多个亚类。黄酮类化合物作为植物次级代谢产物之一，不仅在植物的生长发育中起着重要作用，而且还具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化自由基等药理活性，其通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管、影响肿瘤细胞周期、联合用药克服肿瘤细胞耐药性以及抑制环氧合酶-2等机制达到抗肿瘤细胞的作用。
2、金圣草黄素(chrysoeriol)是一种天然黄酮类化合物，分子式为c16h12o6，分子量为300.26g/mol，广泛分布于菊科、罂粟科、玄参科等植物中。研究表明，金圣草黄素具有显著的抗肿瘤、抗氧化、抗炎及血管保护作用。在抗肿瘤方面，金圣草黄素可通过抑制nf-κb、erk1/2、stat3等信号通路，诱导乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、白血病及前列腺癌等多种肿瘤细胞的凋亡或周期阻滞。例如，金圣草黄素可抑制mda-mb-231乳腺癌细胞的g2/m期周期进程，并降低abcg2介导的耐药性；在肺癌中，金圣草黄素能阻断mapk/erk通路，抑制a549细胞的增殖和迁移。此外，金圣草黄素还可通过调节nrf2/are通路发挥抗氧化作用，保护细胞免受氧化损伤，并通过抑制pdgf-β受体及其下游信号通路(如erk1/2、akt)抑制血管平滑肌细胞迁移，从而预防血管再狭窄。在抗炎免疫调节方面，金圣草黄素能抑制nf-κb和jak2/stat3通路的激活，减少促炎因子(如il-6、tnf-α、cox-2等)的表达。
3、金圣草黄素(chrysoeriol)的获取方法包括植物提取、化学合成和生物合成。传统植物提取法通常采用乙醇渗漉或大孔树脂纯化，但存在原料含量低、成本高、效率低等问题。化学合成方面，现有方法如jung等人提出的查耳酮环化路线总收率仅4.9％，且需使用氢化钠和钯碳等高成本或高风险试剂；郭文华等人开发的dmso高温缩合法收率高达98％，但关键原料3-甲氧基-4-羟基苯甲酰乙酸乙酯难以获取；杜昱光等人的间苯三酚路线反应周期长达3天且未公开收率，均限制了工业化应用。生物合成途径以l-苯丙氨酸或l-酪氨酸为起始，经苯丙烷代谢生成柚皮素，再通过羟化、甲基化转化为金圣草黄素，zhang hj等发现的nrps-pks杂合酶fnsa可直接催化对香豆酸生成柚皮素，为高效生物制造提供了新思路。然而，传统的植物提取法不仅原料依赖性强、效率低下，还面临有机溶剂污染问题；而现有化学合成工艺普遍存在收率低、使用高危试剂以及关键中间体获取困难等缺陷，亟需开发更加绿色的合成工艺。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供了一种生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。
2、本发明采用的技术方案是：
3、一种生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株，包含柚皮素合成模块和金圣草黄素合成模块。
4、柚皮素合成模块步骤包括：
5、将来源于圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)的rttal基因构建至定点突变的prs316-c1082g-a3454t(prs316m)载体上，选择强启动子tdh3p和终止子tef1t，形成prs316m-rttal表达载体；将来源至欧芹(petroselinum crispum)的pc4cl基因构建至定点突变的prs315-a4585t(prs315m)载体上，选择强启动子pdc1p和终止子gpm1t，形成prs315m-pc4cl表达载体；将来自于紫苜蓿(medicago sativa)的mschs和mschi构建至由双向启动子gal1-gal10调控的pesc-his3载体上，形成pesc-mschs-mschi表达载体。将构建好的prs316m-rttal、prs315m-pc4cl、pesc-mschs-mschi载体共转化到ckx-01菌株中(基因型mata ade2-1 his3-11,15leu2-3,112trp1-1 ura3-1 can1-100 lys2δ::hph gal80δ::nat)表达并命名为wt-nar。
6、所述的rttal基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，pc4cl基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，mschs基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，mschi基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7、金圣草黄素合成模块步骤包括：
8、微生物异源合成金圣草黄素的途径从柚皮素起始，再在黄酮合酶fns、类黄酮3’-羟化酶f3’h、o-甲基转移酶omt以及细胞色素p450还原酶cpr的催化下生成金圣草黄素。以上述发明中所构建的产柚皮素的酿酒酵母菌株δ-nar为底盘细胞，导入来源于矮牵牛(petunia x hybrida)的phf3’h基因、金鱼草(antirrhinum majus)的amfns基因、拟南芥(arabidopsis thaliana)的atcpr基因以及粳稻(oryza sativa japonica group)的osromt9基因，构建生产金圣草黄素的酵母菌株。
9、所述的phf3’h基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，atcpr基因的核苷酸序列如seq id no.6所示，amfns基因的核苷酸序列为seq id no.7所示，osromt9基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。
10、所述序列不仅包含如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seqid no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8的核苷酸序列，还包含与seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seqid no.8 95％及以上同源性的核苷酸序列，或与seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示序列部分一致且编码具有相同功能的蛋白质。
11、所述部分一致是与原序列中部分连续的碱基序列段完全相同，例如可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致。
12、优选的，使用强启动子tdh3p和终止子tef1t表达编码酪氨酸解氨酶tal的基因序列；使用强启动子pdc1p和终止子gpm1t表达编码4-香豆酸辅酶a连接酶4cl的基因序列；使用双向启动子gal1-gal10表达编码查耳酮合成酶chs、查耳酮异构酶chi的基因序列；使用双向启动子gal1-gal10表达编码类黄酮3’-羟化酶f3’h、细胞色素p450还原酶cpr的基因序列；使用双向启动子gal1-gal10表达编码黄酮合酶fns、o-甲基转移酶omt的基因序列。
13、所述的强启动子tdh3p的核苷酸序列如seq id no.9所示，终止子tef1t的核苷酸序列如seq id no.10所示，强启动子pdc1p的核苷酸序列如seq id no.11所示，终止子gpm1t的核苷酸序列如seq id no.12所示，双向启动子gal1-gal10的核苷酸序列如seq idno.13所示。
14、其中，所述启动子可以是任何便于进行重组dna操作并表达核酸序列的启动子，在此不作进一步限定。
15、其中，所述终止子可以是任何便于进行重组dna操作并表达核酸序列的终止子，在此不作进一步限定。
16、生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株的出发菌株为野生型酿酒酵母菌株w303，所述生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：
17、1)采用同源重组技术，将野生型酿酒酵母菌株w303的lys2基因替换为潮霉素抗性标记片段；
18、2)采用同源重组技术，将gal80基因替换为nat抗性标记片段；
19、3)采用同源重组技术，将pdc5基因替换为kanmx抗性标记片段；
20、4)导入编码酪氨酸解氨酶tal、4-香豆酸辅酶a连接酶4cl、查耳酮合成酶chs、查耳酮异构酶chi、类黄酮3’-羟化酶f3’h、细胞色素p450还原酶cpr、黄酮合酶fns、o-甲基转移酶omt的基因序列，获得生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株chr-01。
21、其中，所述出发菌株可以是任何以酿酒酵母为底盘微生物构建的表达金圣草黄素的菌株，出发菌株包括但不限于酿酒酵母s288c、酿酒酵母w303-1a、酿酒酵母w303-1b、酿酒酵母yph499、酿酒酵母yph500、酿酒酵母cen.pk2-1d、酿酒酵母by4741、酿酒酵母by4742等单倍体酿酒酵母菌株中的任一种。
22、上述的一种生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株在生产柚皮素中的应用。
23、上述的一种生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株在生产木犀草素中的应用。
24、上述的一种生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株在生产金圣草黄素中的应用。
25、生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株在生产金圣草黄素中的应用方法如下：将生产金圣草黄素的重组酿酒酵母菌株接种于5ml ypd培养基中，于30℃、220rpm条件下振荡培养至对数生长期，得到一级种子；将一级种子转接至含25ml ypd培养基中，使发酵培养液的初始od600为0.2，于30℃、220rpm条件下振荡培养过夜，得到二级种子；将二级种子转接至含25ml相应缺陷培养基的250ml锥形瓶中，调整发酵培养液的初始od600为0.2，ph6.5，于30℃、220rpm条件下振荡培养72h。
26、所述ypd培养基：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，定容至1l，115℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
27、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
28、1、本发明通过将金圣草黄素异源合成体系构建至酿酒酵母中，实现了金圣草黄素在酿酒酵母中首次从头合成，通过对发酵条件的摸索，在ph＝6.5，碳源为葡萄糖的条件下，补加柚皮素，在摇瓶中发酵生产，首次实现金圣草黄素最高浓度为5.33mg/l。相较于传统的植物提取和化学合成方法，展现出显著的绿色制造优势和技术突破。本发明通过合成生物学手段，将酿酒酵母改造为高效细胞工厂：一方面利用同源重组技术敲除关键基因解除了半乳糖依赖性调控和副产物积累，使碳流定向导入黄酮合成途径；另一方面通过异源表达fnsa、omt9等关键酶，将l-酪氨酸到金圣草黄素的转化步骤压缩至单一发酵体系，实现了金圣草黄素的从头合成。本发明不仅解决了现有技术收率低、安全性差的核心痛点，更建立了首个可持续生产金圣草黄素的生物制造平台，为黄酮类化合物的绿色合成提供了普适性解决方案。
29、2、酿酒酵母作为安全的真核模式生物，相较于现有金圣草黄素的植物体取法(效率低、成本高)和化学合成法(步骤繁琐、收率低、安全性差)，本发明通过启动子改造、代谢流调控、关键酶筛选的协同策略，为金圣草黄素的生物合成提供了一种稳定且环境友好的绿色生产策略，具有显著的应用潜力，为金圣草黄素的绿色生物制造及工业化应用奠定坚实的研究基础。