本发明涉及生物，具体的，本发明涉及一种基于唯一分子标记符和文库扩增定量控制的环状rna全长测序方法。
背景技术：
1、环状rna（circular rna，circrna）是由前体rna经由反向剪接形成的，具有共价闭合环状结构的一类特殊单链rna分子。circrna发挥其功能均直接或间接与其序列和结构相关。因此，无论是为了深入研究circrna的机制功能，还是为了探索其在临床诊断和治疗中的应用，都需要进行准确系统的circrna鉴定。然而，由于circrna和线性rna在序列上存在同源性，从大量线性rna背景中准确识别circrna信号具有一定困难。目前，circrna的系统鉴定主要有两种策略：一是基于二代测序（next generation sequencing，ngs）数据的算法识别；二是基于三代测序（third generation sequencing，tgs）的circrna全长识别。基于ngs的circrna识别主要利用其反向剪接的特殊序列特征实现，如通过分段比对法（如find_circ、circexplorer、ciri）或伪参考序列法（如knife）识别反向剪接位点（back splicingjunction，bsj），从而实现circrna鉴定。然而，由于与线性rna的序列同源性，这些方法在精细解析与多种功能相关的circrna的内部复杂剪接结构和异构体多样性上仍存在较大困难。尽管研究者已经开发了多种算法从ngs数据中预测circrna的全长结构，但受限于ngs读长较短的特点，其对circrna内部结构的预测能力仍十分有限。随着三代测序技术，即长读长测序技术（long read sequencing）的发展和普及，研究者已经成功实现了circrna全长测序方法（full-length circrna sequencing）。这类技术多采用非破坏性建库策略获得circrna信号（如isocirc的原位环化连接、ciri-long和circfl-seq的滚环逆转录等），并结合tgs平台的超长测序读长，实现了对circrna全长分子序列的直接观测，显著提升了circrna结构变异的检测能力。
2、然而，由于建库过程和分析方法的差异，这两种策略在circrna识别结果上的重叠性较差，为circrna识别的可靠性提出了挑战。在采用聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，pcr）作为信号放大的circrna全长测序方法研究中，研究者对tgs平台与ngs平台circrna识别结果的比较发现，在同一rna样本中，仅有约36.3%的ngs平台鉴定circrna能在tgs平台数据中检出，而tgs平台鉴定的circrna被ngs平台支持的占比更是低至22.7%。即便在同样使用了rnase r处理的ngs和tgs测序数据中，两平台的重叠率同样不足一半。tgs平台对circrna识别的高灵敏度可以部分解释这种差异，但仍存在其他因素导致了两平台间识别结果不一致，为circrna分析的准确性提出了挑战。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决现有环状rna全长测序方法中扩增偏倚大、假阳性率高、定量不准确以及tgs与ngs结果一致性差等问题。为此，本发明提供了一种基于唯一分子标记符（umi）和文库扩增定量控制的circrna全长测序方法ucircfl-seq。该方法通过在逆转录引物中引入umi，实现对原始分子的唯一标记，结合umi聚类与循环一致性序列生成，有效消除扩增和测序过程中的随机误差。同时，本发明在文库构建过程中引入实时荧光定量pcr监测，确定最佳扩增循环数，避免了过度扩增造成的偏倚。最终，通过rg和ucrg算法结合umi信息进行全长circrna结构识别与定量，提高了结果的准确性和特异性。
2、与现有方法相比，本发明具有以下优点：
3、高准确性：通过umi去重及一致性序列生成，降低了假阳性识别。
4、高定量性：与rt-qpcr结果具有更高的相关性，定量更可靠。
5、跨平台一致性好：显著提高tgs与ngs平台之间circrna识别结果的一致性。
6、适用性强：可广泛应用于环状rna的基础研究、疾病标志物发现及临床检测。
1.一种基于唯一分子标记符和文库扩增定量控制的环状rna全长测序方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 对待测rna样本进行rrna去除、poly(a)加尾及rnase r处理，富集环状rna；(2) 采用包含唯一分子标记符（umi）的第一链合成引物进行逆转录，获得第一链cdna；(3) 在第一链cdna 3’端加尾后进行第二链cdna合成，获得双链cdna；(4) 通过实时荧光定量pcr监测扩增曲线，确定文库扩增的最优循环数，进行文库扩增并纯化；(5) 使用三代测序平台对所述文库进行长读长测序，获得原始测序数据；(6) 从测序数据中识别并提取umi序列，进行umi聚类及循环一致性序列生成；(7) 将所述一致性序列通过rg和ucrg算法比对至参考基因组，识别反向剪接位点并确定环状rna的全长结构和定量信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述umi序列模式为“nnnyrnnnyrnnnyrnnn”。
3.根据权利要求1所述的方法，其中实时荧光定量pcr的扩增循环数为由扩增曲线一阶导数极值点确定的cpd1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中文库扩增包括两轮扩增，每轮扩增后均通过dna磁珠进行纯化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中比对采用minimap2软件，参数为“-ax splice -uf-k 15 -p 0.5”。
6.根据权利要求1所述的方法，其中circrna定量结果与rt-qpcr结果之间的spearman相关系数不低于0.6。
7.一种用于实施权利要求1所述方法的环状rna全长测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
8.一种用于实施权利要求1所述方法的环状rna测序文库，其特征在于，所述文库包括带有唯一分子标记符（umi）的双链cdna片段，且文库扩增循环数通过实时荧光定量pcr确定。
9.一种用于环状rna定量分析的用途，其特征在于，应用权利要求1所述方法建立的环状rna测序文库或权利要求7所述试剂盒，用于不同生物样品中环状rna表达水平的比较分析。
10.一种用于疾病分子标志物筛选的用途，其特征在于，应用权利要求1所述方法获得的环状rna全长测序数据，用于筛选和验证与疾病发生发展相关的环状rna分子标志物。