调节SIRPα-CD47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化合物的制作方法

专利名称:调节SIRPα-CD47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及调节SIRP α -⑶47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化 合物。在某些实施方式中，提供分离的SIRPa和⑶47多肽、片段及融合蛋白，用于增强造 血干细胞植入。此外，还提供通过给予上述多肽而增加造血干细胞植入的方法
背景技术：
从骨髓(BM)或G-CSF动员的外周血(PB)中移植人造血干细胞(HSC)已经成为干 细胞生物中最重要的临床应用之一。在患肿瘤性疾病的个体内进行HSC移植使得可能应 用高剂量化疗方案及随后的HSC复苏来克服由于化疗导致的造血失败，提高血液和非血液 肿瘤的治愈率。此外，遗传疾病如地中海贫血和某些免疫缺陷可通过基因修正HSC的自体 移植或通过同种异体HSC移植而治疗。一个使HSC移植成功的关键发现是将人白细胞抗 原(HLA)系统确定为人主要组织相容性复合物。尽管供者与宿主之间的HLA不匹配在移植 排斥中起主要作用，但移植失败甚至常常发生在接受未经处理但HLA—致的移植物的患者 身上(Thomas, Ε. D. et al. (1997)Blood 49，511-33 ；Storb, R. et al. (1977)N Engl J Med 296,61-6) 0该情形中，移植排斥部分与次要组织相容性抗原的不匹配相关(Gale，R. P. et al. (1981) Blood 57,9-12) 0除HLA单倍体之外，尚未表征其他调节HSC移植的基因。
HSC定位于由成纤维细胞间质、成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞和内皮细胞构成 的支持性微环境壁龛中(Suda，T. et al. (2005)Trends Immunol 26,426-33) 去除 HSC 与这种壁龛的相互作用，例如通过封闭特异性粘附蛋白或趋化因子受体，则阻止HSC植入 (Lapidot, T. et al. (2005)Blood 106，1901-10)。此夕卜，自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞， 为免疫系统的两种固有组分，已证实可分别在鼠类HSC移植(Murphy，W. J. et al. (1987) J Exp Med 165，1212-7)和人造血干细胞异种移植(McKenzie，J. L. et al. (2005)Blood 106， 1259-61)中发挥作用。对移植后造血干细胞植入机制的深入理解，包括控制调节性通路的 基因，可最终转化成较好的临床结局。
非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷NOD. Prdcksc7sc (NOD. SCID)小鼠中的异 种移植已经成为人HSC移植的“金标准”试验。该检测基于人HSC在静脉内注射后再 植这些动物的免疫系统的能力(Hematopoiesis-A Development Approach(ed. Zon, L. I.) 99-118(Oxford University Press, New York, USA,2001)中 W Wang, J. C. Y. et al. “Normal and leukemic human stem cells assayed inimmune-deficient mice，，)。 启动人异种移植的细胞可操作性定义为SCID小鼠再植细胞(SRC)，拥有属于HSC的属性，且 不同于体外分析的较成熟的祖细胞。该系统已使在人HSC区室内进行增殖、分化和自我更 新属性的分析成为可能。
信号调节蛋白(SIRP)包括细胞表面糖蛋白家族，其在骨髓(包括巨噬细胞、粒细 胞、髓系树突状细胞和肥大细胞)和神经细胞(在Barclay, Α. N. &Brown, Μ. H.，Nat Rev Immunol 6，457-64 (2006)总结了 ；另参见WO 97/48723)上表达。SIRP构成一个种类多样的多基因免疫受体家族，涵盖抑制性(SIRPa)、激动性(SIRPi3)、非信号性(SIRPy)和可 溶性(SIRPS)成员。⑶47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，作为SIRPa的细胞配体发挥作 用，结合SIRPa的胞外NH2末端。关于SIRP α在宿主细胞被巨噬细胞所吞噬过程中的抑 制性作用，已有清楚的记载。然而，较近期的研究结果还证实了通过SIRP α结合介导的其 他正向信号传导作用(Shultz, L. D. et al. (1995) J Immunol 154，180-91)。
为了达到生物学效果，人们已提出多种途径来破坏⑶47-SIRPa相互作用。这些 途径涵盖采用片段型/截短型SIRP α和/或CD47蛋白以及针对二者的抗体(见例如国 际专利申请公开号WO 99/40940 ；美国专利申请公开号2003/0026803和2006/0135749 ； 以及美国专利号6，913，894)，用于改善免疫功能(见例如，国际专利申请公开案号WO 99/40940 ；以及美国专利申请公开案号2003/0026803和2007/0113297)，以及用于异种移 植(见例如美国专利申请公开案号2005/0255550和2007/0157328)。
目前仍然需要鉴定能够支持HSC植入以及移植后造血作用的分子。

发明内容
根据一个方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a)SEQ ID NO 1的氨基酸序列；b) —种由SEQ ID NO 1的氨基酸序列的片段组成的多肽，其中该片段 包含 SEQ ID NO 1 的残基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、 126中的至少一个；以及c)a)和b)中多肽的一种，其中，在该多肽全长中，每7个氨基酸中 包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID而1的残基31、32、34、 37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 中的至少一个且结合人 CD47。
根据另一方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a) —种 由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的多肽；b) —种由SEQ ID NO 2的氨基酸序列的片段组 成的多肽；以及c)a)和b)中多肽的其中一种，在该多肽全长中，每7个氨基酸中包含至多 一个氨基酸插入、缺失或取代；其中:i)该多肽中SEQ ID NO :2位点31、32、34、37、74、77、 83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 处残基的至少一个被 SEQ ID NO 1 的对应 残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者 ii)该 多肽中，SEQ ID NO 2的残基129和130中的至少一个缺失。
根据另一方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a)由一 种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID N0:4-13组成的组；b)由一种氨 基酸序列的片段组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID而4-13组成的组；以及()幻 和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽的全长中，每7个氨基酸中有至多一个氨基酸插 入、缺失或取代，其中所述多肽结合人CD47。
根据另一方面，本发明提供一种能够结合人Sirp α的多肽以及针对人Sirp α的 抗体。优选地，该多肽是融合于IgG的Fc部分的人CD47的胞外区。
根据另一方面，本发明提供一种药物组合物，包含本文所述多肽以及一种药用载 体。
根据另一方面，本发明提供一种用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的方法， 包括给予该哺乳动物治疗有效量的本文所述多肽。
根据另一方面，本发明提供一种应用本文所述多肽来增加哺乳动物体内造血干细胞植入或者制备用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的药物的用途。
根据另一方面，本发明提供一种本文所述多肽，用于增加哺乳动物体内的造血干 细胞植入。
根据另一方面，本发明提供一种包含编码本文所述多肽的序列的分离核酸。
根据另一方面，本发明提供一种包含本文所述核酸的表达载体。
根据另一方面，本发明提供包含本文所述载体的培养细胞。
根据另一方面，本发明提供一种生成多肽的方法，包括在允许该多肽表达的条件 下培养本文所述细胞。
根据另一方面，本发明提供一种用于增加人体内造血干细胞植入的方法，包括调 节人Sirp α与人⑶4之间的相互作用。
根据另一方面，本发明提供一种鉴定可增加人体内造血干细胞植入的化合物的方 法，包括a)使人Sirp α胞外区和人CD47胞外区中至少一种与至少一种待测化合物相接 触；b)确定所述至少一种待测化合物可结合于该人Sirp α和人CD47中的至少一种；c)使 该待测化合物与间质环境中的人造血细胞相接触；以及d)确定在待测化合物存在的情况 下，造血干细胞植入是否增加。
根据另一方面，本发明提供一种测定人体内影响造血干细胞植入的遗传多态性的 方法，包括a)对来自多个进行造血细胞移植的患者的Sirp α基因进行测序；b)测定多个 患者Sirp α基因中的核苷酸差异；以及c)将该核苷酸差异与造血干细胞植入进行关联，以 确定相关多态性。
根据另一方面，本发明提供一种确定受体体内造血干细胞植入的可能性的方法， 包括a)对来自受体的Sirpa基因进行测序；以及b)确定该相关多态性是否存在。


在下列具体说明中，本发明优选实施方式的这些以及其他特征将变得更加明显， 其中参照了下列附图，其中
图1示出了 NOD品系背景中，体内及体外的人造血支持。(a)用人BM(上图；细胞 剂量:RAG-2敲除品系40xl06单核细胞，SCID和N0D/SCID小鼠20xl06个细胞)或CB (下 图，每个受体15xl06个细胞)细胞移植后4周，从小鼠BM提取的DNA的DNA印迹分析。通 过比较样品泳道与对照人/小鼠DNA混合物中2. 7kb α卫星条带(箭头)的强度，来测定 人细胞植入的水平。(b、c)人Lin-CB细胞在受照小鼠BM间质上的嵌合LTC中产生的CFC 数量。如所指明的，照射后，将来自N0D、N0R、B6、ICR、C3H和BALB/c雄性小鼠的BM细胞培 养5周，随后以1. 1x105 (b)或0.6-6. OxlO5 (c)个Lin-CB细胞进行接种。培养5周后，收 集细胞并在标准的克隆原细胞的甲基纤维素试验中测定CFC总数。数据以3-6次独立实验 的平均值示出。
图2示出了 Iddl3基因座的品系特异性差异对体外和体内人造血细胞移植的 支持的影响。(a)人 LirTCB 细胞在来自 NOD 同类系(NOR. N0D_Idd4、NOR. NOD-Idd5 NOR. N0D-Idd9、NOR. N0D_Iddl3、)N0R 同类系(NOR. N0D_Iddl3)和 Β6· N0D_Iddl3 小鼠的间质上 的嵌合LTC中CFC的生成情况。如图Ib中所述建立鼠BM间质层，并接种0. 36-2. OxlO5(C) 个人LirTCB细胞。培养5周后，收集细胞，并通过在甲基纤维素试验中铺种来测定CFC的
8数量。在每一个实验中，NOD间质均用做阳性对照，B6和NOR细胞均用做阴性对照。将数 据针对NOD培养中生成的CFC数量(=100% )进行标准化，并以至少3次独立培养的均 值而示出。BB、Iddl3纯合性B6的BM间质；NN，Iddl3基因纯合性NOD的BM间质。(b)用 350cGy 照射 8-9 周龄的 NOD. SCID (η = 11)或 NOD. N0R-Iddl3. SCID (η = 8)，并静脉内注射 0. 37-1. 5χ105个LinTD34+细胞。移植后6_7周，处死小鼠并通过流式细胞检测评估受体BM 中人⑶45+细胞的植入情况。
图3示出的是鉴定Iddl3中与支持人造血作用相关的关键区域。(a)图示了 NOD 和NOR背景上多种同类系品系中染色体2。候选间隔的基因定位用指向右侧染色体示意 图的条纹线表示。同类系品系的正式命名如下1. NOD. N0R-D2Jyh443-D2Mit452, 2. NOR. N0D-D2Jyh443-D2Jyhl493,3. NOR. BN-D2Jyh443-D2Jyhl493,4. NOR. N0D-DINgu146-Ramp1/ D2Jyh443-D2Jyhll92,5. NOD. N0R-D2Jyh443-D2Gul482,6. NOD. N0R-D2Jyh443-D2Jyh3941, 7. NOR. N0D-DlNgul46-Rampl/D2Gull88-D2Jyhl493,8. NOR. BN_D2Jyh767_Flizl。(b)人 Lin-CB细胞在a中所述NOD或NOR Iddl3亚同类系小鼠间质上的嵌合LTC中的CFC生成情 况。如图2a进行培养及表示数据。品系命名如a中所述。
图4示出了 SIRP α的蛋白序列比对。从BM源巨噬细胞制备的cDNA用做PCR扩 增NOD和NOR小鼠Sirp α转录本的模板。Β6小鼠序列来自EnsEMBL数据库。蛋白结构域 以开放的框表示。
图5示出了来自NOD、NOR和同类系NOR. N0D_Iddl3小鼠品系的BM源性巨噬细胞 中SIRPa的免疫印迹分析。(a)将制备自BM源性巨噬细胞(用或不用LPS(100ng/ml)和 IFN-gamma(10ng/ml)进行处理)的裂解物利用针对SIRP α胞浆结构域的多克隆抗体进行 免疫印迹分析，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为上样对照。(b)将BM源性巨噬细胞的裂 解物在N-糖苷酶F存在或不存在的情况下，于37°C孵育12小时，随后针对SIRP α胞浆结 构域的多克隆抗体进行免疫印迹分析。将N-糖苷酶F处理和未处理的样品进行共电泳。分 子量标准以千道尔顿表示(kD)。
图6示出了 Sirpa对鼠巨噬细胞介导的人造血作用抑制的调节。(a)巨噬细胞 在LTC中介导的人造血作用抑制。将MS-5细胞接种于96孔组织培养板中(2000个细胞/ 孔)。将从NOD、NOR和NOR. N0D_Iddl3杂合小鼠收集的腹腔巨噬细胞以200-20，000个细 胞/孔的量进行接种(每个量重复5次)，第二天每个孔均加入2000个人LirTCB细胞。培 养3-4周后，收集细胞并通过在甲基纤维素试验中铺种而测定人CFC数量。误差棒表示标 准差。(b)示出的是用对照病毒(CEP)或表达NOD源性Sirp α的病毒(SIRP)感染前后， Jurkat细胞和NOR BM源性巨噬细胞中SIRP α表达的蛋白印迹分析。蛋白裂解物用针对 SIRP α的多克隆抗体进行免疫印迹。泳道1 =Jurkat细胞；泳道2 感染CEP的Jurkat细 胞；泳道3 感染SIRP的Jurkat细胞；泳道4 =NOR巨噬细胞；泳道5 感染SIRP的NOR巨噬 细胞；泳道6 =NOD巨噬细胞。感染SIRP慢病毒引起NOD巨噬细胞中NOD SIRP α的高水平 表达(泳道5)。(C)Sirpa对巨噬细胞介导的人造血作用抑制的影响。NOR BM源性巨噬细 胞用对照(NOR-CEP)慢病毒或表达NOD源性Sirp α基因的慢病毒(N0R-N0D SIRP)感染，然 后以20-20，000个细胞/孔的量接种于已建立的MS-5间质培养基上(每个量重复5次)。 如上所述，第二天每个孔加入2000个Lin-CB细胞，3. 5周后，测定培养物中得到的人CFC。 N0R-N0D SIRP孔中人造血作用的支持显著优于NOR-CEP孔(20个细胞/孔时，P = 0. 032 ；2000-20, 000个细胞/孔时，P = O. 008)。误差棒表示标准差。
图7示出了 NOD SIRP α使与人⑶47的种属交叉反应性增加。(a_d)人 CD47(hCD47)与来自NOD和NOD. N0R_Iddl3同类系小鼠的BM源性巨噬细胞上的鼠SIRPa 结合的流式细胞分析。(a)⑶lib表达的直方图；水平棒表示⑶Ilb+门。图b至d中的图 均以⑶lib进行门控。(b) 二维等高线图，示出了 SIRPa和h⑶47-Fc染色。(c)相比于同 型对照(黑色)，SIRP α表达的直方图(灰色)。(d)h⑶47-Fc染色(灰色)与人IgG-Fc 对照(黑色)叠加的直方图。(e)鼠SIRP α与h⑶47_Fc的免疫沉淀。将来自N0D、N0R和 NOD. NOR-Iddl3同类系小鼠的BM源性巨噬细胞的蛋白提取物在SDS-PAGE上进行电泳，并用 多克隆抗SIRPa抗体进行免疫印迹。每一个图均展示了总裂解物、与对照人IgG-Fc蛋白 的免疫沉淀物(IP hFc)以及与h⑶47-Fc融合蛋白的免疫沉淀物(IP h⑶47_Fc)。上图比 较的是NOD和NOR提取物，下图比较的是NOD和NOD. N0R-Iddl3 (Iddl3cg)提取物。
图8示出了鼠和人SIRPa IgV结构域的蛋白序列比对。(a)从BM巨噬细胞制备的 cDNA 用做 PCR 扩增 NOD 和 NOR 小鼠 Sirp α 转录本的模板。C57BL/6 (Β6)、BALB/c 和 129/Sv 序列从EnsEMBL和NCBI数据库获得。开放框代表SIRP α的X线结晶结构中鉴定的b_折 叠片层，对应Ig重链可变区中的类似区域。小鼠品系之间不同的氨基酸以阴影表示。B6用 做母本序列。(b)包含IgV结构域的SIRP α的外显子3从人HapMap第一阶段发布的37个 个体基因组DNA扩增而来。开放框区域和阴影氨基酸表示与(a)中相同的特征，Vl用做母 本序列。种属之间正向同源位置标记*的残基在NOD与其他品系以及与人之间呈多态性。 标记+的残基在人类呈多态性，且定位于该蛋白“顶端”暴露于溶剂的表面上，预测CD47在 该位置结合。
图9示出了通过对从所示出人HapMap样品中每一个(表格的左侧)PCR扩增而来 的SIRP α IgV结构域进行独立测序来验证三种SNP分析的区分能力。
图10示出了⑶47蛋白，包含胞外IgV样环、5个跨膜区和较短的胞浆尾巴。
图11示出了(a) —个直方图，描绘通过用不同质粒骨架(paDNA和pIAP369)制备 的mCD47-Fc和两个h⑶47-Fc构建体转染的培养细胞上清中蛋白生成情况，以及(b) —个 SDS-PAGE免疫印迹，描绘的是从培养上清中纯化后的融合蛋白。
图12示出了(a)将Kozak序列引入包含mCD47_Fc的pIAP369质粒构建体中以及 (b)插入pIAP369质粒中的序列hCD47-Fc，展示了 Kozak共有序列、hCD47片段、连接段和 Fe。
图13示出了(a)用含Kozak的质粒转染的细胞上清中测定的小鼠和人⑶47_Fc 生成情况以及(b)展示抗人Fc抗体与蛋白G纯化的⑶47-Fc蛋白发生反应的免疫印迹。
图14示出了一个试验，设计用来量化h⑶47-Fc和mCD47_Fc (未示出)与NOD和 NOR小鼠SIRP α的亲和性。
图 15 示出 7 (a)mCD47 与 NOD 和 NOR SIRP α 结合的结果，以及(b)hCD47 与 NOD 和NOR SIRPa结合的结果。
图16是一个展示SIRP α -⑶47介导的信号传导的示意图。
图17示出了制备人HSC “容许”的截短型NOD SIRP a ( "NOD- Δ -cyto”)(左侧)。
图18示出了利用感染了“空”慢病毒的NOR巨噬细胞(N0R-CEP“菱形”)、未感染病 毒的NOD巨噬细胞(NOD uninf ；填充三角形)、感染“空”慢病毒的NOD巨噬细胞(N0D-CEP ；圆圈)、感染含全长NOD SIRP α的慢病毒的NOR巨噬细胞(N0R-SIRP ；方形)以及感染含截 短型NOD SIRP α的慢病毒的NOR巨噬细胞(NOD- Δ -cyto ；开放三角形)的人HSC存活情况。
图19示出了一个研究的示意图，用来评估体内CD47融合蛋白对HSC植入的影响。
具体实施方式
以下说明书中列出了许多具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，应该理 解，无需这些具体细节即可实施本发明。
如本文中使用的，“保守性氨基酸取代”指根据某些共同属性对氨基酸进行分 组。一种确定单个氨基酸之间共同属性的功能性途径是分析同源生物的对应蛋白之间氨 基酸变化的归一化频率(Schulz, G. Ε. and R. H. Schirmer.，Principles and Structure, Springer-Verlag)。根据这些分析，可确定氨基酸分组，其中同一组内氨基酸可彼此优先互 换，且因此在对整体蛋白结构的影响方面彼此最为相似(Schulz，G.E. and R. H. Schirmer.， Principles and Structure, Springer-Verlag)。以该方式进行氨基酸分组的实例包括
⑴带电组，由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成，
(ii)带正电组，由Lys、Arg和His组成，
(iii)带负电组，由Glu和Asp组成，
(iv)芳香组，由 Phe、Tyr 和 Trp 组成，
(ν)氮环组，由His和Trp组成，
(vi)较大的脂肪族非极性组，由Val、Leu和Ile组成。
(vii)轻微极性组，由Met和Cys组成，
(viii)小残基组，由 Ser、Thr、Asp、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 组成，
(ix)脂肪族组，由Val、Leu、lie、Met和Cys组成，以及
(χ)小羟基组，由Ser和Thr组成。
除了上面展示的组，每一种氨基酸残基还可形成其自己的组，由单个氨基酸形成 的组可简单地由该氨基酸在本领域中通常使用的一个和/或三个字母缩略词表示。
如本文中使用的，“培养细胞”表示一种已在体外维持和/或繁殖的细胞。培养细 胞包括原代培养细胞和细胞系。如本文中使用的，“培养所述细胞”表示提供有助于多肽表 达的培养条件。这些培养条件在本领域中为人熟知。
如本文中使用的，“植入”干细胞特别是已扩增的造血干细胞，表示将该干细胞置 入动物体内，例如通过注射，其中该干细胞在体内持续存在。这一点可通过造血干细胞如促 进正在进行的血细胞形成的能力而简单测定。
如本文中使用的，提到多肽或多核苷酸时，“片段”表示仅由该参照序列的完整多 肽序列和结构(或核苷酸序列和结构)的一部分构成的多肽或多核苷酸。多肽片段可包括 该天然多肽的C末端缺失和/或N末端缺失，或者可由该分子的一个内在部分衍生而来。类 似的，多核苷酸片段可包括该天然多核苷酸的3’和/或5’缺失，或者可由该分子的一个内 在部分衍生而来。
如本文中使用的，“融合蛋白”指一种复合多肽，即一种单一的连续性氨基酸序列， 由两个(或多个)独立的异源性多肽构成，而这两个多肽在平常情况下并非融合于一个单
11一的氨基酸序列内。因此，融合蛋白包括的单一氨基酸序列可包含两个完全不同的氨基酸 序列或两个相似或相同的多肽序列，只要这些序列并非存在于天然的单一氨基酸序列的同 一构象中。融合蛋白通常可利用重组核酸法即通过重组基因融合产物的转录和翻译而制 备，该融合包括一个编码本发明所述多肽的节段以及一个编码异源性多肽的节段，或者通 过本领域中熟知的化学合成法而制备。在融合蛋白的组成多肽之间，可包含一个连接多肽。 术语“融合构建体”或“融合蛋白构建体”通常表示编码融合蛋白的多核苷酸。在一个实施 方式中，融合蛋白是本文所述多肽融合于Ig分子的一部分。融合蛋白的Ig部分可包括免疫 球蛋白的恒定区，例如人C γ 1结构域或C γ 4结构域(例如人Ig C γ 1或Ig Cy4的铰链 区、CH2 和 CH3 区)(见例如，Capon et al.，U. S. Pat. No. 5，116，964 ；5，580，756 ；5，844，095 等)。在一个优选实施方式中，Ig融合蛋白包括本文所述与免疫球蛋白的恒定区(例如，Fc 部分)结合的多肽。
如本文中使用的，“造血干细胞”指骨髓、肝、脾或脐血来源能够发育成任何成熟骨 髓和/或淋巴细胞的细胞。
如本文中使用的，提到核酸分子、多肽或其他生物分子时，“分离的”表示该核酸 或多肽已从获得该多肽或核酸的遗传环境中分离出来，还可以表示与天然状态已经发生改 变。例如，天然存在于活体动物内的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存 物质中分离出来的相同多核苷酸或多肽则是“分离的”，如该术语在本文中所应用的。因此， 重组宿主细胞内生成和/或包含的多肽或多核苷酸可认为是分离的。还可认为“分离的多 肽”或“分离的核酸分子”是已从重组宿主细胞或天然来源部分或几乎全部纯化的多肽或核 酸分子。
还可认为本发明所述肽可表现出调节生物学如细胞内事件的能力。如本文中使用 的，“调节”指对感兴趣生物学过程的刺激性或抑制性效应，相对于本发明所述肽不存在时 该过程的水平或活性。
如本文中使用的，术语“巨噬细胞抑制”或“抑制巨噬细胞”指减小或阻止巨噬细 胞作用、活性和/或效应。
如本文中使用的，“核酸分子”表示DNA分子(例如，cDNA)和RNA分子(例如， mRNA)以及例如通过采用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物。核酸分子可以为寡核苷 酸或多核苷酸，可为单链或双链。
如本文中使用的，“可操作性连接”指元件的排布，其中如此描述的元件经配置可 发挥其通常功能。因此，可操作性连接于编码序列的控制元件能够实现该编码序列的表达。 该控制元件无需与编码序列相邻，只要其能够发挥作用指导其表达即可。因此，例如，可在 启动子和编码序列之间干扰未翻译但已转录的序列，启动子仍然可以认为是“可操作性连 接于”编码序列。类似地，“与患者体内表达相容的控制元件”是那些能够实现该患者体内 编码序列表达的元件。
如本文中使用的，“药用载体”表示任何以及所有溶剂、分散媒介、涂层、抗细菌和 抗真菌试剂、等张和吸收延缓试剂以及可生理性相容的试剂等。药用载体的实例包括水、 盐、磷酸缓冲盐、葡聚糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在多种情况下，优选该组 合物中包括等张试剂例如糖类、多醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药用载体可进一步包括辅 料如湿化或乳化剂、防腐剂或缓冲液，这将增强该药学试剂的保存期或有效性。
12[0068]如本文中使用的，“多肽”和“蛋白”可互换使用，表示蛋白、蛋白片段、修饰的蛋白、 氨基酸序列及合成的氨基酸序列。所述多肽可为糖基化或非糖基化。
如本文中使用的，“间质”指器官的支持组织或基质，可与该器官或实质的功能元 件区分开。
如本文中使用的，“治疗有效量”指在某些剂量和必需的特定时间段时对获得预期 治疗结局有效的量。药理学试剂的治疗有效量可随诸如疾病状态、年龄、性别和患者体重以 及该药理学试剂消除个体内预期反应的能力等因素而不同。治疗有效量还可指一个量，其 中该药理学试剂的治疗的有益效果超过任何毒性或有害效应。
根据一个方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a)SEQ ID NO 1的氨基酸序列；b) —种由SEQ ID NO 1的氨基酸序列的片段组成的多肽，其中该片段 包含 SEQ ID NO 1 的残基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、 126中的至少一个；以及c)a)和b)中多肽的其中一种，其中，在该多肽全长中，每7个氨基 酸中包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID N0:1的残基31、 32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 中的至少一个且结合人 CD47。
根据另一方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a) —种 由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的多肽；b) —种由SEQ ID NO :2的氨基酸序列的片段 组成的多肽；以及c)a)和b)中多肽的其中一种，其中，在该多肽全长中，每7个氨基酸中 包含至多一个氨基酸插入、缺失或取代；其中i)该多肽中SEQID NO 2的位点31、32、34、 37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 处残基的至少一个被 SEQ ID NO1 的对应残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 取代；或 者ii)该多肽中，SEQ ID NO 2的残基129和130中的至少一个缺失。
根据另一方面，本发明提供一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a)由一 种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID N0:4-13组成的组；b)由一种氨 基酸序列的片段组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID而4-13组成的组；以及()幻 和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽的全长中，每7个氨基酸中有至多一个氨基酸插 入、缺失或取代，其中所述多肽结合人CD47。
根据另一方面，本发明提供一种能够结合人Sirp α的多肽以及针对人Sirp α的 抗体。优选地，该多肽是融合于IgG的Fc部分的人CD47的胞外区。
在某些实施方式中，该多肽是所述片段，且在SEQ ID NO :1内的残基50-57、 63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-141 之间，SEQ ID NO 2 内的残基 50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-143之间，在 SEQ ID NO :4、7、 8、9 和 12 中任何一种的残基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116 之 间；或者 SEQ ID NO :5、6、10、11 和 13 中的残基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77_83、 88-99或102-115之间的区域内包含至少3个连续的氨基酸。
在某些实施方式中，所述氨基酸插入、缺失或取代是保守性氨基酸取代。
在一个优选实施方式中，该多肽结合人⑶47。
在一个优选实施方式中，该多肽结合人Sirp α。
在某些实施方式中，该多肽是所述片段，且按照优先度逐渐增加的顺序，长度在6-30个氨基酸之间、在8-28个氨基酸之间、在10-26个氨基酸之间、在12-24个氨基酸之间 以及在14-22个氨基酸之间。
本文所述多肽可融合于第二种多肽，其优选为IgG的Fc部分。
根据一个优选实施方式，本发明提供一种多肽，其包含的CD47胞外区融合于IgG 的Fc部分，优选用于增加人体内的造血干细胞植入。
根据另一方面，本发明提供一种药学组合物，包含本文所述多肽以及一种药学可 接受的载体。
根据另一方面，本发明提供一种用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的方法， 包括给予该哺乳动物治疗有效量的本文所述多肽。优选地，造血干细胞植入的增加是由于 巨噬细胞的抑制。
根据另一方面，本发明提供本文所述多肽在用于增加哺乳动物体内造血干细胞植 入或用于制备用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的药物中的应用。
根据另一方面，本发明提供一种本文所述多肽，用于增加哺乳动物体内的造血干 细胞植入。
根据另一方面，本发明提供一种分离的核酸，包含一个编码本文所述多肽的序列。
根据另一方面，本发明提供一种包含本文所述核酸优选包含Kozak共有序列的表 达载体。
根据另一方面，本发明提供一种包含本文所述载体的培养细胞。
根据另一方面，本发明提供一种生成多肽的方法，包括在适于该多肽表达的条件 下培养本文所述细胞。
根据另一方面，本发明提供一种用于增加人体内造血干细胞植入的方法，包括调 节人Sirp α与人⑶47之间的相互作用。优选地，其中人Sirpa与人⑶47之间的相互作 用通过给予至少一种治疗有效量的下列物质加以调节a) —种能够结合于人Sirp α胞外 区的多肽；b)针对人Sirp α的抗体c) 一种能够结合于人CD47胞外区的多肽；以及d)针 对人⑶47的抗体。
因此，本发明还提供了前述多肽或方法用于增加人体内造血干细胞植入或用于制 备增加人体内造血干细胞植入的药物的应用。优选地，造血干细胞植入的增加是由于巨噬 细胞的抑制。
在一个实施方式中，能够结合于人Sirp α胞外区的多肽包括可溶性人⑶47或其 片段，优选CD47的胞外区。优选地，该可溶性人CD47或其片段融合于第二种蛋白。在另 一个实施方式中，能够结合于人CD47胞外区的多肽包括可溶性人Sirp α或其片段，优选 Sirpa的胞外区。优选地，该可溶性人Sirp α或其片段融合于第二种蛋白。在优选实施方 式中，所述第二种蛋白是IgG的Fc部分。
根据另一方面，本发明提供一种鉴定可增加人体内造血干细胞植入的化合物的方 法，包括a)使人Sirp α和人CD47胞外区中至少一种与至少一种待测化合物接触；b)确定 所述至少一种待测化合物可结合于人Sirp α和人CD47中至少一种；c)使该待测化合物与 间质环境中的人造血细胞相接触；以及d)确定在待测化合物存在的情况下，造血干细胞植 入是否增加。
根据另一方面，本发明提供一种测定人体内影响造血干细胞植入的遗传多态性的方法，包括a)对来自多个进行造血细胞移植的患者的Sirp α基因进行测序；b)测定来自 多个患者的Sirpa基因中的核苷酸差异；以及c)将该核苷酸差异与造血干细胞植入进行 关联，以确定相关多态性。优选地，该核苷酸差异引起氨基酸差异。
根据另一方面，本发明提供一种确定受体体内造血干细胞植入的可能性的方法， 包括a)对来自受体的Sirpa基因进行测序；以及b)确定该相关多态性是否存在。
优选地，该相关多态性引起的氨基酸差异优选为下列其中至少一个(a) SEQ ID NO :2 位点 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 处残基的至 少一种被 SEQ ID NO 1 的对应残基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、 114、118、126取代；或者ii)SEQ ID NO :2的残基129禾口 130中的至少一个缺失。
本发明的优势将进一步通过下列实施例加以阐述。本文中列出的这些实施例以及 其特殊细节仅为了说明而不应理解为对本发明权利要求
的限制。
实施例
材料&方法
小鼠
将CB17-scid/scid (SCID)、N0D/LtSz-Prdkcsc/sc (NOD. SCID) (Shultz, L. D. et al. (1995) J Immunol 154，180-91)、C57BL/6 (B6)、C3H、ICR 和 BALB/C 小鼠在无菌条件下饲 养并保管于Ontario肿瘤中心(多伦多，加拿大)。Rag—2+(RAG-2)、RAG_2. Prf^和RAG-2. β 小鼠，均为 B6 背景，从 GenPharm International (Mountain View, CA)获得。NOD、 NOD. SCID,NOD. N0R_Iddl3、N0D. N0R_Idd4、N0D. N0R_Idd5、N0D. N0R_Idd9、N0R. N0D_Iddl3 和 B6.N0D-Iddl3小鼠在病童医院(多伦多，加拿大)于无特异性病原体或屏障条件下供养。
所有的同类系小鼠均通过育种者的标记物指导性选择从NOD/Jsd与N0R/Lt祖先 原始杂交而生成。按照家系，NOD与NOR基因组约88% —致，其基因组中的差异位点分布在 染色体1、2、4、5、7、10、11、12、14和18上。育种者用微卫星标志物筛查所有可区分NOD与 NOR的遗传基因座，因此所有同类系的亲本的背景等位基因均是纯合性的。本研究中用来定 义同类系小鼠的微卫星标志物列于表1中。
表1.用来定位同类系小鼠的微卫星标志物。
15[0104]
权利要求
一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a)由SEQ ID NO1的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQ ID NO1的氨基酸序列的片段组成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个；以及c)a)和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽全长中，每7个氨基酸中有至多一个氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID NO1的残基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一个且结合人CD47。
2.一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a)由SEQID NO2的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQID NO 2的氨基酸序列的片段组成的多肽；以及c)a)和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽全长中，每7个氨基酸包含至多一个氨 基酸插入、缺失或取代；其中i.所述多肽中SEQ ID NO :2 的位点 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、 102、114、118、126 处残基的至少一个被 SEQ ID NO 1 的对应残基 31、32、34、37、74、77、83、 84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 取代；或者ii.所述多肽中，SEQID NO 2的残基129和130中的至少一个缺失。
3.一种分离的多肽，选自由下列多肽组成的组a)由一种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQID N0:4-13组成的组；b)由一种氨基酸序列的片段组成的多肽，所述氨基酸序列选自由SEQID N0:4-13组 成的组；以及c)a)和b)中所述多肽的一种，其中，在所述多肽的全长中，每7个氨基酸中有至多一个 氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽结合人CD47。
4.根据权利要求
1所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQID N0:1内的 残基 50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-141 之间区域的至少一 个内包含至少3个连续的氨基酸。
5.根据权利要求
2所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQID N0:2内的 残基 50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-143 之间区域的至少一 个内包含至少3个连续的氨基酸。
6.根据权利要求
3所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQID N0:4、7、8、 9 和 12 的任何一个内的残基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116 之间区域或者在 SEQ ID NO :5、6、10、11 和 13 内的残基 24-31、37-45、48-54、62-66、69_74、 77-83、88-99或102-115之间区域中至少一个内包含至少3个连续的氨基酸。。
7.根据权利要求
1至6中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸插入、缺失或取代是保守 性氨基酸取代。
8.根据权利要求
1至6中任一项所述的多肽，没有氨基酸的插入、缺失或取代。
9.根据权利要求
1至6中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合人CD47。
10.根据权利要求
1至9中任一项所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且长度在6到30个氨基酸之间。
11.根据权利要求
10所述的多肽，其中所述片段的长度在8到28个氨基酸之间。
12.根据权利要求
11所述的多肽，其中所述片段的长度在10到26个氨基酸之间。
13.根据权利要求
12所述的多肽，其中所述片段的长度在12到24个氨基酸之间。
14.根据权利要求
13所述的多肽，其中所述片段的长度在14到22个氨基酸之间。
15.一种多肽，包含权利要求
1-14中任一项所述的多肽融合于第二种多肽。
16.根据权利要求
15所述的多肽，其中所述第二种蛋白是IgG的Fc部分。
17.一种药物组合物，包含权利要求
1-16中任一项所述的多肽以及一种药用载体。
18.一种用于增加哺乳动物体内造血干细胞植入的方法，包括给予所述哺乳动物治疗 有效量的权利要求
1-16中任一项所述的多肽。
19.根据权利要求
18所述的方法，其中，造血干细胞植入的增加是由于巨噬细胞的抑制。
20.权利要求
1-16中任一项所述的多肽在增加哺乳动物体内的造血干细胞植入中的应用。
21.权利要求
1-16中任一项所述的多肽在制备用于增加哺乳动物体内造血干细胞植 入的药物中的应用。
22.根据权利要求
1-16中任一项所述的多肽，用于增加哺乳动物体内的造血干细胞植入。
23.一种分离的核酸，包含编码权利要求
1-16中任一项所述多肽的序列。
24.一种表达载体，包含可操作性地连接于表达控制序列的权利要求
23所述的核酸。
25.一种培养细胞，包含权利要求
24所述的载体。
26.—种生产多肽的方法，包括在适于所述多肽表达的条件下培养权利要求
25所述的 细胞。
27.一种用于增加人体内造血干细胞植入的方法，包括调节人Sirp α与人⑶47之间的相互作用。
28.根据权利要求
27所述的方法，其中人Sirpα与人CD47之间的相互作用通过给予 至少一种治疗有效量的下列物质进行调节a)能够结合于所述人CD47胞外区的多肽；以及b)针对人⑶47的抗体。
29.根据权利要求
28所述的方法，其中所述能够结合于所述人CD47胞外区的多肽包括 可溶性人Sirp α或其片段。
30.根据权利要求
28所述的方法，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。
31.根据权利要求
29和30中任一项所述的方法，其中所述多肽融合于第二种蛋白。
32.根据权利要求
31所述的方法，其中所述第二种蛋白是IgG的Fc部分。
33.根据权利要求
27所述的方法，其中人Sirpα与人CD47之间的相互作用通过给予 至少一种治疗有效量的下列物质进行调节a)一种能够结合于所述人Sirp α胞外区的多肽；以及b)针对人Sirpα的抗体。
34.根据权利要求
33所述的方法，其中所述能够结合于所述Sirpα胞外区的多肽包括可溶性人CD47或其片段。
35.根据权利要求
34所述的方法，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。
36.根据权利要求
34和35中任一项所述的方法，其中所述多肽融合于第二种蛋白。
37.根据权利要求
36所述的方法，其中所述第二种蛋白是所述IgG的Fc部分。
38.根据权利要求
27-37中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞植入的增加是由 于巨噬细胞的抑制。
39.一种化合物在增加人体内的造血干细胞植入中的应用，所述化合物包括a)一种能够结合所述人CD47胞外区的多肽；以及b)针对人⑶47的抗体。
40.一种化合物在制备用于增加人体内造血干细胞植入的药物中的应用，所述化合物 包括a)一种能够结合所述人CD47胞外区的多肽；以及b)针对人⑶47的抗体。
41.根据权利要求
39和40中任一项所述的应用，其中所述能够结合所述人CD47胞外 区的多肽包括可溶性人Sirp α或其片段。
42.根据权利要求
41所述的应用，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。
43.根据权利要求
41和42中任一项所述的应用，其中所述多肽融合于第二种蛋白。
44.根据权利要求
43所述的应用，其中所述第二种蛋白是所述IgG的Fc部分。
45.一种化合物在增加人体内的造血干细胞植入中的应用，所述化合物包括a)一种能够结合于所述人Sirp α胞外区的多肽；以及b)针对人Sirpα的抗体。
46.一种化合物在制备用于增加人体内造血干细胞植入的药物中的应用，所述化合物 包括a)一种能够结合于所述人Sirp α胞外区的多肽；以及b)针对人Sirpα的抗体。
47.根据权利要求
45和46中任一项所述的应用，其中所述能够结合于所述Sirpα胞 外区的多肽包括可溶性人CD47或其片段。
48.根据权利要求
47所述的应用，其中所述多肽是所述人Sirpα的胞外区。
49.根据权利要求
47和48中任一项所述的应用，其中所述多肽融合于第二种蛋白。
50.根据权利要求
49所述的应用，其中所述第二种蛋白是所述IgG的Fc部分。
51.根据权利要求
39-50中任一项所述的应用，还用于巨噬细胞的抑制。
52.一种多肽，包含融合于所述IgG的Fc部分的所述⑶47的胞外区。
53.根据权利要求
52所述的多肽，其中所述多肽由SEQIDNO :124、125和126连续编码。
54.一种药物组合物，包括权利要求
52和53中任一项所述的多肽以及一种药用载体。
55.根据权利要求
52和53中任一项所述的多肽，用于增加人体内的造血干细胞植入。
56.一种分离的核酸，包含编码权利要求
52和53中任一项所述多肽的序列。
57.一种表达载体，包含可操作性地连接于表达控制序列的权利要求
56所述的核酸。
58.根据权利要求
57所述的表达载体，进一步包括核酸的Kozak共有序列。
59.一种培养细胞，包含权利要求
57和58中任一项所述的载体。
60.一种生产多肽的方法，包括在适于所述多肽表达的条件下培养权利要求
59所述的 细胞。
61.一种鉴定增加人体内造血干细胞植入的化合物的方法，包括a)使人Sirpα胞外区和人⑶47胞外区中的至少一种与至少一种待测化合物接触；b)确定至少一种结合于人Sirpα和人CD47中的至少一种的所述待测化合物；c)使所述待测化合物与间质环境中的人造血细胞接触；以及d)确定在所述待测化合物存在的情况下，造血干细胞植入是否增加。
62.一种测定人体内影响造血干细胞植入的遗传多态性的方法，包括a)对来自多个进行造血细胞移植的人的Sirpα基因进行测序；b)测定所述多个人中所述Sirpα基因中的核苷酸差异；以及c)将所述核苷酸差异与造血干细胞植入进行关联，以确定相关多态性。
63.根据权利要求
62所述的方法，其中所述核苷酸差异引起氨基酸差异。
64.一种确定受体内造血干细胞植入的可能性的方法，包括a)对来自所述受体的Sirpa基因进行测序；以及b)确定权利要求
62所述的相关多态性是否存在。
65.根据权利要求
64所述的方法，其中所述核苷酸差异引起氨基酸差异。
66.根据权利要求
65所述的方法，其中所述氨基酸差异是下列中的至少一种a)SEQ ID NO 2 的位点 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、 118、126 处残基的至少一个被 SEQ ID NO :1 的对应残基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、 90、91、96、100、102、114、118、126 取代；或者b)SEQID NO 2的残基129和130中的至少一个缺失。
专利摘要
本发明涉及调节SIRPα-CD47相互作用以增加造血干细胞植入以及用于此的化合物。在某些实施方式中，提供分离的SIRPα和CD47多肽、片段及融合蛋白，用于增强造血干细胞植入。此外，还提供通过给予上述多肽而增加造血干细胞植入的方法。
文档编号C12Q1/68GKCN101970478SQ200880119787
公开日2011年2月9日 申请日期2008年10月10日
发明者塔蒂亚娜·普拉索拉瓦, 杰恩·丹斯卡, 竹中克人, 约翰·E·迪克 申请人:大学健康网络;多伦多儿童医院