一种通过结晶过程制备5’-肌苷酸二钠的方法

专利名称:一种通过结晶过程制备5’-肌苷酸二钠的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过结晶过程制备5’ -肌苷酸二钠(IMP2Na)的方法，更详细地 说，涉及一种在从肌苷酸(IMP)生产菌株发酵液中纯化5’-肌苷酸二钠过程中，通过结晶过 程代替已有的离子交换树脂方法，以制备5’ -肌苷酸二钠的方法。
S卩，本发明涉及一种在保持相同的5’_肌苷酸二钠晶体产量的情况下，增加5’_肌 苷酸二钠晶体纯度的方法，同时，通过改进现有技术所用有机溶剂的结晶过程，按照性能特 有的温度、产生晶体的时间点和生长点，来控制溶解度，大幅度减少了有机溶剂的消耗量。
背景技术：
嘌呤衍生核苷酸，如5’-肌苷酸二钠(IMP2Na)，用作代谢紊乱的预防和治疗药物、 生长促进剂和抗癌药物的原材料，也用作食品添加剂，如食品工业中调味品的重要材料。
5’ -肌苷酸二钠，一种调味品的成份，是从天然存在于肉和鱼等中的肌苷酸(IMP) 中，通过多种方法(如鱼和肉提取法、RNA酶降解法、微生物发酵法、发酵和合成联合法、或 RNA化学降解和合成联合法)制备的。
在一种作为制备5’ _肌苷酸二钠的原材料的肌苷酸的制备方法中，我们进行了通 过微生物发酵法制备5’ _肌苷酸二钠的大量研究，并已被授予多项专利。
但是，由于上述方法的产品含有以下种类的物质有色物质、糖、氨基酸、有机酸、 无机盐等，因此，必须对其进行纯化并去除其中的杂质，以获得具有能用于食品添加剂的质 量的5’ -肌苷酸二钠。
之前，通过离子交换树脂纯化5’ _肌苷酸二钠的方法为，通过多个阶段，使用阳离 子交换树脂和阴离子交换树脂分离有机物质和无机物质，以得到高纯度的肌苷酸溶液；然 后浓缩并结晶肌苷酸溶液，以得到5’-肌苷酸二钠晶体(日本专利申请公开号40-39715)。 但是，使用离子交换树脂的纯化方法存在产生大量废水的缺陷。
克服了上述废水相关缺陷的另一项在前方法中，公开了用真菌菌体分离微生物发 酵液，而不用离子交换树脂，然后浓缩上清液，继而使用亲水性有机溶剂进行多次结晶的方 法，得到高纯度的5’ -肌苷酸二钠。
作为对使用上述方法的专利技术的考虑，公开了纯化5’ -肌苷酸二钠和5’ _鸟苷 酸钠混合物的方法(韩国专利申请公开号1987-0007197)、制备5’ -肌苷酸二钠和5’ -鸟 苷酸钠混合晶体的方法(韩国专利申请公开号1988-0010694)、形成5’ -鸟苷酸钠晶体的 方法(韩国专利申请公开号1993-0009984)和制备5，-鸟苷酸钠和5，-肌苷酸二钠混合 晶体的方法(韩国专利申请公开号2004-0018435)。
但是，问题在于当微生物发酵液用真菌菌体分离并浓缩，然后使用亲水性有机溶 剂从浓缩液中得到5’ -肌苷酸二钠时，亲水性有机溶剂的用量大，而且由于亲水性有机溶 剂的加入，杂质也同时被萃取出来了。还有，因为杂质的同时萃取而减少的肌苷酸的含量会 影响随后的结晶过程，所以有必要对加入到由真菌菌体分离的发酵液中的有机溶剂的量进 行优化。[0011]因此，我们通过关注使用亲水性有机溶剂的结晶过程，研究了从微生物发酵液中 纯化肌苷酸的方法。特别是，为了解决上述问题，我们重复进行了实验来提高晶体的产量和 纯度，并最小化有机溶剂的量，因此，我们实现了工业上可用的发明，与现有技术相比，提高 了 5’ -肌苷酸二钠的纯度，并且在减少有机溶剂的用量的情况下能够保持其产量不变。

发明内容
本发明的目的是提供生产5’ _肌苷酸二钠的方法，该方法使用能够改善现有技术 中存在的问题的微生物发酵方法，其中，大幅度减少了有机溶剂的量并且提高了晶体的纯度。
通过结晶过程来实现本发明的目的，通过使用基于温度和加入的有机溶剂的溶解 度来建立优化的条件，然后决定了得到的5’肌苷酸二钠的纯度。
本发明提供的制备5’_肌苷酸二钠的方法，包括第一步，从肌苷酸生产菌株的发 酵液中分离并去除真菌菌体；第二步，浓缩所述发酵液；第三步，将浓缩的发酵液的PH值调 节到6-10;第四步，加热调节pH后的发酵液体，以使预结晶的5’-肌苷酸二钠完全溶解；第 五步，冷却含有溶解的5’ -肌苷酸二钠晶体的发酵液；第六步，向冷却后的发酵液中加入亲 水性有机溶剂，以使5’ -肌苷酸二钠结晶。
本发明中所用的微生物发酵液，是通过接种肌苷酸生产菌株培养的，培养用的菌 株可以使用能够生产肌苷酸的任何菌株，优选为棒状杆菌(Corynebacterium sp)。棒状杆 菌优选培养用于生产在发酵液中约5% -10%的肌苷酸。
本发明的第一步可以通过选自由过滤、离心和热处理组成的组中的任意一种方法 来进行，优选用膜过滤方法来进行。本领域技术人员可以容易控制分离真菌菌体的膜过滤 方法的条件。例如，发酵液可以预热到约40-50°C，而且1. 2-1. 5atm的膜间(TMP)压力可用 于该方法。
优选地，第二步的浓缩使发酵液中肌苷酸浓度为200_300g/L，最优选地，为 230-260g/L。
优选地，第三步的调节使发酵液的pH值为7. 5-9. 5。
优选地，第四步的加热使发酵液的温度为55-75°C。
第五步的冷却是在以下条件进行的以均勻的速率冷却，以诱导加热后晶体的 自然析出，在此，优选在3-6小时内使温度冷却到10-30°C。基于此，优选的冷却速率为 5-10°C / 小时。
优选地，第六步是通过以下方式进行的在浓缩的发酵液为20°C时，加入亲水性 有机溶剂。以发酵液总量的30-60 (ν/ν) %的量，加入亲水性有机溶剂。
此外，所述亲水性有机溶剂可以为低级醇，优选甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或它们的 混合物中的一种或多种，最优选为甲醇，甲醇中得到的晶体形状最适于固-液分离。
亲水性有机溶剂可以通过用水稀释来使用，但是当稀释率增加时，有机溶剂的加 入量也增加，工业上优选70-95 (ν/ν) %的溶剂浓度。
本发明涉及通过结晶过程来制备5’ _肌苷酸二钠的方法，与离子交换树脂法相 比，该方法减少了废水的产生量，并且仅通过控制温度并使用少量的有机溶剂就可产生高 纯的5’ -肌苷酸二钠，从而使本发明在食品工业中表现出色。
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图1为显示了浓缩发酵液中基于甲醇加入量％的肌苷酸的溶解度的曲线图。
图2为显示了基于加入的有机溶剂甲醇的晶体的过饱和曲线的曲线图。
具体实施方式
在下文中，参照实施例对本发明的实施方式及其构建方法进行更加详细的说明， 但是，本发明的范围并不限于这些实施例。
实施例1:5’-肌苷酸二钠结晶条件的建立
为了建立优化的5’ -肌苷酸二钠的结晶条件，5’ -肌苷酸二钠的溶解度通过温度 和有机溶剂决定。5’ -肌苷酸二钠的溶解度用HPLC测定，在温度为20°C、30°C、40°C、50°C 和60°C时，将总溶液中有机溶剂的浓度(％ ν/ν)调节至为0-60% (图1)。
过饱和曲线通过以下方法获得使用在线颗粒尺寸分析仪，测定5’肌苷酸二钠溶 液在实际发酵液中的溶解度；记录基于温度的、在每个有机溶剂浓度(％ ν/ν)下的核形成 突然增加的点，以及当温度增加时核形成突然消失的点；每分钟对颗粒的个数和颗粒的平 均尺寸及浓度等进行分析。通过实验，通过温度和加入的有机溶剂，得到了 5’-肌苷酸二钠 在发酵浓缩液中的溶解度；通过冷却温度计算结晶率，以寻找合适的冷却温度；并与从早 期阶段通过加入亲水性有机溶剂得到的冷却温度进行比较。
结果如图1和2所示。结果中，晶体的析出是基于肌苷酸在培养浓缩液中的过饱 和。作为过饱和曲线的比较，与强制加入的有机溶剂不同，冷却时基于实际浓缩液中晶体形 成的时间和条件的肌苷酸的浓度曲线，稳定地出现在位于肌苷酸的溶解度曲线和过饱和曲 线之间的半稳定区中，因此，可以发现，晶体的尺寸由于无定形形成的抑制而提高。
实施例2 通过有机溶剂的结晶实现培养浓缩液的结晶过程
基于实施例1的结果，按照如下所述的方法从发酵液中制备5’ -肌苷酸二钠
步骤1 菌株的培养和菌体的分离
生产肌苷酸的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriun glutamicum) CJM107 (KCCM-10227)菌株，用于本发明。
菌株接种于在IL中含有46g葡萄糖、30g果糖、IOg酵母抽提物、18gKH2P04、42g K2HP04、6g尿素、IOg MgSO4 ·7Η20、30μ g生物素和5mg盐酸硫胺素的发酵液中，在暴露于pH 6-8，温度30-32°C的18L培养基中培养140小时，直到发酵液中肌苷酸浓度达到5-10%。培 养的发酵液中肌苷酸的浓度用HPLC测量。棒状杆菌以外的其它任意的用于生产肌苷酸的 菌株，也可以用于实现同样的目的。
发酵液用膜过滤器过滤，以分离并去除真菌菌体沉淀物，得到滤过夜。过滤优选在 将发酵液加热到50°C时进行，以增加真菌菌体的分离效率，可以预见到过滤时间可以缩短， 因为过滤的分离速率在50°C时较低温时更高，因而产率也可以增加。
但是，需要注意的是，当温度增加到高于50°C时，会发生热分解。从本领域普通技 术人员的角度，作为过滤步骤，过滤方法以外的离心或者热处理方法也可以使用。
步骤2 过滤的发酵液的浓缩
过滤的发酵液以680mmHg的真空度和55°C容器温度的减压干燥方法浓缩，以使肌
5苷酸的浓度变为230-260g/L。通过将肌苷酸浓度浓缩至200-300g/L，也可以达到同样的结
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步骤3:pH值调节
35%的HCl溶液以IL中加入60mL的量加入到浓缩发酵液中，以调节pH值到7. 5。 因为通过晶体的析出的产量是最高的，因此5’ -肌苷酸二钠的溶解度在中性pH区域最小， 优选在中性和碱性之间调节PH，以便于从发酵液中结晶5’ -肌苷酸二钠。因此，可以以调 节pH为6-10，以进行该实施例，以本领域技术人员的观点优选调节pH为7. 5-9. 5。将调节 PH值后的250mL浓缩液加入到析出管中。
步骤4:加热
为了阻止浓缩液预先产生晶体，将含有浓缩液的析出管加热到60°C，以保持液体 处于所有的晶体均被熔解的状态。以本领域技术人员的观点，加热到55-75°C也可以获得同 样的效果。
步骤5 有机溶剂的加入
将发酵液加热到60°C，并将350mL的95% (ν/ν)甲醇水溶液以均勻流动速率在5 小时内加入到发酵液中，并保持60°C的温度。除了甲醇，可以使用其它亲水性有机溶剂，如 低级醇，优选为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或多种，最优选为甲醇，甲醇中得到的晶 体形状最适于固-液分离。
亲水性有机溶剂可以通过用水稀释来使用，但是当稀释率增加时，有机溶剂的加 入量也增加，并且工业上优选70-100 (ν/ν) %的溶剂浓度。
步骤6 冷却和晶体的分离
在完成甲醇的加入后，温度经2小时降至40°C，以介导晶体的自然析出，然后使用 篮筐分离器通过离心分离晶体。
分离到的晶体的分析
分离到的晶体中5’-肌苷酸二钠的纯度用HPLC定量法确定，在干燥炉105°C下干 燥3小时后，测定含水量，将晶体溶解到5% (w/v)浓度下后，用光密度仪测定430nm处的透 过率(T%)，得到的晶体的总重量用电子天平测定。结果是，分离到的5’-肌苷酸二钠纯度 为79%，含水量为29%, 72. 5，总重量为67. 5g。
实施例3 通过冷却结晶进行浓缩发酵液的结晶
本实施例3按照与实施例2中的步骤1到3中同样的方法进行。以下解释第4步 及以后的步骤。
步骤4 加热
与实施例1相似，将结晶析出管的温度加热到60°C，以保持液体处于所有的晶体 均被熔解的状态。
步骤5 冷却
作为加热步骤的结果，液体以不产生结晶的状态冷却。液体在5小时内下降至 20°C的均勻速率冷却，并且晶体的产生率处于上清浓度的70%的水平。
步骤6 加入有机溶剂并分离晶体
为了提取处于上清中的结晶形式的5’-肌苷酸二钠，将150mL的95% (ν/ν)甲醇 水溶液在2小时内加入。在甲醇的加入中，析出管的温度保持在20°C，并在加完甲醇后熟化30分钟再分离晶体。
结果是，分离的到的5’ -肌苷酸二钠纯度为92.5%，含水量为31%，1~%为92. 2， 总重量为66. 3g。通过此结果，在提高晶体纯度方面，确定在冷却后加入有机溶剂要比加入 有机溶剂后冷却有效的多。
实施例4通过冷却结晶(80%甲醇)进行浓缩发酵液的结晶
本实施例4以与实施例3步骤1到5相同的方法进行，区别在于通过改变步骤6 中加入的有机溶剂的浓度来比较结果。下文解释了步骤6以后的内容。
步骤6有机溶剂的加入和晶体的分离
为了提取处于上清中的结晶形式的5’-肌苷酸二钠，将150mL的80% (ν/ν)甲醇 水溶液在3小时内加入。在甲醇的加入中，析出管的温度保持在20°C，然后在加完甲醇后熟 化30分钟再分离晶体。
结果是，分离的到的5’ -肌苷酸二钠纯度为94. 5%，含水量为30%，1~%为92. 5， 总重量为72. 4g。
通过此结果，确定通过实施例4的方法能够得到具有最高纯度的5’肌苷酸二钠。
肌苷酸晶体的纯度可以取决于有机溶剂的浓度范围，并且因此产量也不相同。众 所周知，在晶体产量方面，在晶体析出环境中，均勻地保持以总液体体积30-40(v/v) %的亲 水性有机溶剂加入率是有利的。也可以看到，在超过上述范围的情况下，杂质也析出了，因 此成为降低晶体纯度的一个原因。
实施例1-3中得到的5’ -肌苷酸二钠的含量为85-95%，含水量低于28. 5%。通 过这些实施例的结果，与早期晶体形成方法(韩国专利申请号10-2006-67035)中加入有机 溶剂的方法相比，本发明得到的5’ -肌苷酸二钠的纯度提高10-20%。
作为与韩国专利申请号10-2006-67035的比较，本发明具有如下效果结晶过程 从3次缩短到1次，加入的有机溶剂的量通过冷却结晶而减少，并且5’-肌苷酸二钠的含量 增加到85-95%的水平。这些总结在如下的表1中。
表 1
有机溶剂 的加入量 (ν/ν, % )#15，-肌苷酸二钠的 含量(%)晶体形成 的起始温 度(V)冷却温度 (°C )有机溶剂 的加入温 度(V)现有方法6170604060本方法3785602020
在现有方法中，有机溶剂在60°C加入，然后冷却到40°C，而在本发明改进了的冷 却结晶过程中，在从60°C冷却到20°C后，少量的有机溶剂在20°C时加入以获得晶体，使 5，-肌苷酸二钠的含量高于现有技术，从而使本发明具有明显效果。
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权利要求
一种制备5’ 肌苷酸二钠的方法，其中，该方法包括第一步，从肌苷酸生产菌株的发酵液中分离并去除真菌菌体；第二步，浓缩所述发酵液；第三步，将浓缩的发酵液的pH值调节到6 10；第四步，加热调节pH后的发酵液，以使预结晶的5’ 肌苷酸二钠完全溶解；第五步，冷却含有溶解的5’ 肌苷酸二钠晶体的发酵液；以及第六步，向冷却后的发酵液中加入亲水性有机溶剂，以使5’ 肌苷酸二钠结晶。
2.根据权利要求
1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第二步的浓缩在肌 苷酸的浓度为200-300g/L时停止。
3.根据权利要求
1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第四步的加热是在 55-75 °C下进行的。
4.根据权利要求
1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第五步的冷却是在 以下条件下进行的以5-10°C /小时的速率，冷却到20-30°C。
5.根据权利要求
1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第六步的加入是通 过以下方式进行的在所述发酵液为20°C时，加入所述有机溶剂。
6.根据权利要求
1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第六步的加入是通 过以下方式进行的以发酵液总量的30-40 (ν/ν) %的量，加入所述亲水性有机溶剂。
7.根据权利要求
1所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述第六步的亲水性有 机溶剂为低级醇。
8.根据权利要求
7所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述低级醇为甲醇。
9.根据权利要求
8所述的制备5’-肌苷酸二钠的方法，其中，所述甲醇的浓度为 70-95(ν/ν)%。
专利摘要
本发明涉及一种从以微生物发酵产生的5’-肌苷酸(IMP)发酵液中制备5’-肌苷酸二钠(IMP2Na)的方法。与离子交换树脂法相比，本发明具有减少废水的效果，并且仅通过控制温度和使用少量的有机溶剂就可产生高纯度的5’-肌苷酸二钠。
文档编号C12P19/26GKCN101918576SQ200880122759
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月18日
发明者俞裁宪, 尹太相, 朴南燮, 李允宰, 李种勋, 洪淳源, 金日出 申请人:Cj第一制糖株式会社