用于产生三磷酸腺苷的系统的制作方法

专利名称:用于产生三磷酸腺苷的系统的制作方法
用于产生三磷酸腺苷的系统
本申请要求2007年10月17日提交的美国临时专利申请序列号60/980，636的权 益，其通过引用以其整体在此并入。
本发明在政府支持下由国立卫生研究院给予的奖助金编号K01-RR00188和 HD-33052产生。政府具有本发明中的某些权利。
发明领域
本发明涉及用于产生三磷酸腺苷(〃 ATP")的系统。
发明背景
生物技术的一个最引人注目的前景用途是产生可以执行生物学功能的杂合有 机-无机装置。对于这样的装置的应用是众多的。例如，它们可以被植入并执行诊断或治 疗的功能，例如提供需要的酶活性或释放药物至特定组织。这些装置可以在血液内循环并 在通过暴露至特定分子、病原体、患病细胞或组织类型的刺激时释放药物或催化反应。它们 甚至可以进入其中它们可以补偿有缺陷的或缺乏的生物反应的单个细胞。可选择地，它们 可以以"纳米机器人(nanobot)"的方式执行机械功能。
纳米颗粒递送载体的实例存在于现有技术中(Franzen等的美国专利号 7，332，586和美国专利申请公开号2008/0199529)。然而，可以执行生物学功能的自供动力 的有机_无机装置的应用更加广泛。例如，执行生物学功能的杂合有机_无机装置可以携 带酶以替代失去的功能，例如患者出生而没有特定酶的先天性缺陷。这将提出其中患者的 DNA必须被改变的"基因治疗"的一种替代方案。可选择地，人们潜在地可以使用这样的装 置以携带能够降解毒素或识别并消灭病原体的酶。另一种潜在的功能将是产生可以与病原 体或癌细胞结合，然后直接在那些细胞特异性泵出药物或代谢物的装置。类似地，人们可以 产生外科医生可以将其包装进感染性创口以在缺乏血管供应的区域中泵出抗生素的装置。 两种方法都将增加药物的局部浓度并减少全身毒性。然而，如何为这样的装置一特别是在 非常小的，纳米尺度上一提供动力的问题仍然是这样的装置的发展和实际使用的关键性 障碍。
杂合有机-无机纳米装置的实例已经被报道了。例如，重组体Fl-ATP酶已经产 生，其一端拴(tether)到固体表面而另一端支持小的镍杆(Soong et al. , “ Powering an Inorganic Nanodevice with a BiomolecularMotor, " Science, 290 :1555-8(2000))。 Soong证明依靠水解ATP (对于生物反应最常见的细胞能量形式)，该分子进行旋转运动并 且该杆可以被看出移动。可逆结合位点形式的"开关(on-off switch)“已经被设计进该 相同的分子马达(Liu et al. , “ Control of a BiomolecularMotor-powered Nanodevice with an Engineered Chemical Switch, " Nat. Mater.，1 :173-7 (2002))，显示这样的装置 可以被调控。类似地，其它纳米马达基于RNA螺旋酶、驱动蛋白、动力蛋白或肌球蛋白。然 而，为了有功能，ATP必须外源提供或者在该装置本身局部地产生。
已经报道了产生ATP的系统，使用细菌视紫红质和F0F1-ATP合酶(Luo et al. , “ Photo-Induced Proton Gradients and ATP BiosynthesisProduced byVesicles Encapsulated in a Silica Matrix, " Nat. Mater. , 4 :220_4(2005) ；Choi et al. , " Advances in Nano Biotic/Abiotic HybridSystems Protein-Based Engineered Devices, “ Nanobiotechnol 3:66-75(2007))。然而，该系统需要外源光，其对于体内的 医学应用是不实际的。
纳米生物机器的第二个实例从微管和具有丙酮酸激酶的异_双功能聚合物粒子 产生，其通过利用自给的ATP在涂有驱动蛋白的玻璃表面上驱动(Du et al, “ Motor Protein Nano-biomachine Powered bySe If-supplying ATP, " Chem Commun., 2080-82(2005))。然而，该纳米机器涉及与越过玻璃表面的微管一起体外用于运动性测定。 它不需要葡萄糖或果糖作为起始物料，而需要外源二磷酸腺苷(“ADP")和磷酸烯醇丙酮 酸盐(“PEP")以产生ATP。
把蛋白质附着或连接到固体支持物在本领域是众所周知的。然而，维持偶联到固 体支持物的蛋白质的活性挑战了本领域的科学家，而只有少数连接单个蛋白质到固体支持 物并且维持该蛋白质活性的情况已经被显示。
本发明涉及克服本领域的这些和其它缺陷。
发明概述
本发明的一个方面涉及用于产生ATP的系统。该系统包括支持物和偶联到该支持 物的能够共同从葡萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶。
本发明的另一个方面涉及用于进行包括ATP到ADP转化的反应的装置。该装置包 括用于产生ATP的系统，其包括支持物和偶联到该支持物的能够共同从葡萄糖或果糖代谢 产生ATP的一种或更多种酶。该装置另外包括与该系统相关并且能够把ATP转变为ADP和 进行该反应的部件。
本发明还涉及用于进行包括ATP到ADP转化的反应的方法。该方法包括提供用于 从葡萄糖或果糖代谢产生ATP的系统。该系统包括支持物和偶联到该支持物的能够共同从 葡萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶。该系统在从葡萄糖或果糖代谢有效产生 ATP的条件下与葡萄糖或果糖接触。ATP被转变成ADP，并且该反应进行。
本发明的一个进一步的实施方案还涉及用于产生ATP的方法。这包括提供用于从 葡萄糖或果糖代谢产生ATP的系统。该装置包括支持物和偶联到该支持物的能够共同从葡 萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶。该系统在从葡萄糖或果糖代谢有效产生ATP 的条件下与葡萄糖或果糖接触。
本发明涉及改进的用于体内医学应用的产生ATP的机制。这构成了在把一个途径 中的酶顺序拴到固体支持物并且让那些酶连续地执行它们的功能中的重要进步。这构成了 用于从存在于血清的葡萄糖或果糖体内产生ATP的新方法。
附图简述

图1显示潜在的医学纳米装置设计的示意图。在该图像中，把支持物包封在脂质 体内，葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)进入，并且拴住的糖酵解途径加工葡萄糖成为 ATP，其可以1)催化共拴到该支持物的需要的酶促反应，或2)为膜"泵"(例如ABC转运蛋 白)提供动力，其将释放负荷(cargo)(例如包含在该脂质体内的化学疗法药物或抗生素)。 丙酮酸盐形式的"废物"将通过添加另外的酶(LDH)被转变为乳酸盐，然后将通过另一种 转运蛋白(MCT)去除。添加该能力将允许补充糖酵解需要的中间产物以继续发挥功能。还将把启动数量的ATP、和ADP、无机磷酸盐、以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)共包封入该 装置中以支持需要的反应。
图2显示使用芯片亚组装件代替在单个芯片上具有全部10种(或11种，如果包 括LDH)酶。
图3显示在整个糖酵解途径中代谢葡萄糖或果糖的酶的位置。丙酮酸盐通过乳酸 脱氢酶转变为乳酸盐显示为另外的步骤，因为如在此讨论的其潜在的应用重要性。
图4显示利用本发明产生的用于生产设计的分子产品(例如特定形式的蛋白质、 纳米颗粒、或更复杂的"分子机器"一可以共同发挥功能的蛋白质的组)的ATP。这可以 是大规模或小规模的。
图5显示一种从前面的图片中显示的应用中除去产生ATP的纳米装置的方法。如 果该装置是磁性的，它们潜在地可以应用磁体分离。
图6显示潜在地可以与〃生物电池〃或使用ATP发电的其它技术，无论单个装置 或多个亚组装件，连接的本发明的技术。应用可以包括在身体中发电以为泵、起搏器、去纤 颤器或其它需要电的装置提供动力。可选择地，该动力可用于对这样的装置的电池再充电。
图7A-C显示重组体蛋白质的设计和纯化的His-HK以及His-GPI的证实。在图7A 中，把六组氨酸标签引入HK和GPI的N末端。直接用His标签替代HKl-sc的已知的生殖 细胞特异性靶向结构域。实施His-HK(图7B)和His-GPI (图7C)的SDS-PAGE和免疫印迹 分析作为纯化过程的质量控制以及检验产品的身份。实施考马斯亮蓝(CBB)染色以显现到 纯化最后存在的总蛋白质。针对His标签(His)的抗体指示包含该标签的蛋白质的表观分 子量，而针对HK(HK)和GPI(GPI)的抗体用于证实酶的身份。
图8A-B显示当分别拴住时结合的His-HK和His-GPI的活性。把重组体蛋白质 拴到具有M-NTA表面的金芯片并充分洗涤以除去任何松弛结合或未结合的蛋白质。偶 联的酶促反应用于测定与支持物结合的蛋白质的活性，按照描述利用用分光光度法测定在 340nm的吸收度的改变。活性代表来自η = 9个样品的平均值，来自3种蛋白质制剂各3个 样品。条形图指示标准差。
图9Α-Β显示氨基末端His标签/Ni-NTA连接化学作用的使用相对于随机吸附到 表面的GPI改进了 GPI的结合和比活性。利用表达载体提供的肠激酶位点将His标签从 His-GPI裂开。在图9A中，与没有His标签的对照GPI相比大约两倍的His-GPI与Ni-NTA 支持物结合(ρ = 0.012，成对student T检验；η = 9个样品，来自3种蛋白质制剂各3个 样品。条形图指示标准差。)。图9Β显示把结合的蛋白质的量标准化允许定量吸附的蛋白 质的比活性。His-GPI的比活性为随机吸附的GPI的大约9倍，虽然溶液中的酶活性是相 对相当的(P = 0.006，成对student T检验；η = 9个样品，来自3种蛋白质制剂各3个样 品。条形图指示标准差。)。
图10显示His-HK和His-GPI被拴到一起，允许顺序催化葡萄糖为葡萄糖_6_磷 酸然后是果糖-6-磷酸。通过描述的偶联反应途径检测该反应的完成。“HK-GPI “表示 与0. 5nM His-HK和0.5nM His-GPI—起孵育的支持物。用InM浓度的蛋白质溶液获取与 His-HK单独(HK)或His-GPI单独(GPI) —起孵育的支持物的读数。利用在MOPS缓冲液 (缓冲液)中孵育的M-NTA表面进行空白试验。该图显示来自一组蛋白质制剂的有代表性 的结果，使用重复三次的样品(条形图表示标准差)。因为可以预见对于各组制剂的各种蛋白质结合略微地不同，对于该实验集中数据不会是有效的；然而，实验使用三个单独组的制 剂进行，每次具有非常相似结果。
发明详述
本发明的一个方面涉及用于产生ATP的系统。该系统包括支持物和偶联到支持物 的能够共同从葡萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶。
本发明的另一个方面涉及用于进行包括ATP到二磷酸腺苷(“ADP")转变的反 应的装置。该装置包括用于产生ATP的系统，其包括支持物和偶联到该支持物的能够共同 从葡萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶。该装置另外包括与该系统相关并且能够 把ATP转变为ADP和进行该反应的部件。
图1提供了根据本发明具有其中葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白(“GLUT")进入的 包封的支持物的装置的示意图。拴住的糖酵解途径，包括复数的酶，加工葡萄糖成为丙酮酸 盐，产生ATP (2个净分子的ATP来源于每个葡萄糖分子)。该途径的示意图显示于图3。在 该途径中，通过己糖激酶把葡萄糖转变为葡萄糖6-P，而以葡萄糖6-异构酶把葡萄糖6-P转 变为果糖6-P。6-磷酸果糖激酶把果糖6-P转变为果糖l，6-bisP。醛缩酶把果糖l，6-bisP 转变为GAP和DHAP。以甘油醛-3-P脱氢酶把GAP转变为1，3_bisPG。以磷酸甘油酸激酶 把该反应的产物转变为3-PG。以磷酸甘油酸变位酶把3-PG转变为2-PG。烯醇化酶把2-PG 转变为磷酸烯醇丙酮酸盐。丙酮酸激酶把磷酸烯醇丙酮酸盐转变为丙酮酸盐。在有些情况 下，以乳酸脱氢酶把丙酮酸盐转变为乳酸盐。
糖酵解中涉及的酶或蛋白质可以与一种或更多种支持物连接。在该情况中，每组 拴着的酶执行在ATP生产中它们的连续步骤，然后该反应的产物给由拴到相同或不同支持 物的另一种酶执行的反应的后续部分提供燃料。后者的实施方案显示于图2，其证明糖酵解 的酶可以分开并拴到分离的支持物而仍然执行整个糖酵解途径。这是有益的，因为可以把 要拴的每种酶以不同的连接化学作用偶联到表面以便于它们的精确模式化。通过使较少的 酶附着于特定表面，对偶联不同酶的不同连接化学作用的需要将减少。这是因为不同酶可 以以相同的连接化学作用偶联到不同的表面。
图1的装置中产生的ATP可以1)催化其中必需的酶共拴到该支持物的需要的酶 促反应或者2)为膜"泵"提供动力。在执行前者的应用中，底物χ进入该装置，在其中它 和偶联到固体支持物的酶接触，在该固体支持物上该酶把底物χ转变为产物1。然后产物y 从该装置输出。在为膜泵提供动力中，ATP驱动ATP结合盒(“ABC")转运蛋白或多药转 运蛋白(“MDR")，引起包含在脂质体中的负荷(例如化学疗法药物或抗生素)的释放。 丙酮酸盐形式的废物通过乳酸脱氢酶转变为乳酸盐。为了除去乳酸盐，把单羧酸盐转运蛋 白(“MCT")定位于包封试剂中。这允许该反应进行而不被终末产物或pH的改变抑制。 可以把溶质载体家族2转运蛋白或葡萄糖转运蛋白(“GLUT")定位于包封试剂中以把葡 萄糖或果糖运送至偶联到该支持物的酶。包封试剂也可以包括底物的进口和反应产物的出 口。进口和出口是，例如通道、转运蛋白和/或孔。
在本发明的一个实施方案中，己糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、6-磷酸果糖激酶、 醛缩酶、丙糖_磷酸_异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位 酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶附着于固体支持物。
可以把酶以选择的位置连续排列在支持物上以连续地进行从葡萄糖或果糖代谢生产ATP。此外，可以把乳酸脱氢酶偶联到该支持物以进行丙酮酸盐到乳酸盐的转变。用这 种方法，NAD+可以被补充以进行随后的糖酵解反应。
虽然存在许多不同的潜在连接化学作用，一种偶联机制用把偶联的连接剂结合到 纳米粒子支持物的酶替代糖酵解酶的靶向或支架结构域。一种偶联机制用多聚组氨酸标签 (“His-tag")替代糖酵解酶的靶向或支架结构域。另一种偶联机制用谷胱甘肽S-转移 酶(“GST融合标签")融合标签替代糖酵解酶的靶向结构域。His标签和GST融合标签 允许重组体蛋白质与附着到固体表面的连接剂结合。
适当的连接剂包括，但不限于次氮基三乙酸镍或谷胱甘肽。
任选地，支持物首先被涂布。适当的涂层包括，但不限于聚乙二醇或金。
对于本发明的装置适当的包封试剂包括，但不限于脂质体、硅橡胶植入物和特氟 隆(Teflon)植入物。包封试剂的使用在本领域为大家所熟知。
该装置的另一个实施方案还可以包括定位于或偶联到支持物的酶以使底物磷酸 化。
在本发明的另一个实施方案中，与该系统相关的部件执行生物或生物化学反应。
本发明还涉及用于进行包括ATP到ADP转变的反应的方法。该方法包括提供用于 从葡萄糖或果糖代谢产生ATP的系统。该系统包括支持物和偶联到支持物的能够共同从葡 萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶。该系统在从葡萄糖或果糖代谢有效产生ATP 的条件下与葡萄糖或果糖接触。ATP被转变为ADP并且该反应进行。
在执行该方法中，该系统可以是与上面描述的那样基本上相同的。
本发明的方法还可以包括用试剂，例如ATP、NAD+或Pi启动该系统的步骤。这通 过图4大略地显示，其中葡萄糖和底物的重复添加另外描述。通过用糖酵解期间使用的系 统的中间产物、起始材料和/或辅因子启动该装置，ATP连续地产生并能驱动该反应无限期 地向前(直至该装置上蛋白质的寿命)。糖酵解的ATP生产的量还可以控制反应速率(与 包封试剂中的ATP相反，其可以允许酶以其完全的动力学速度运转)。因此，仔细设计的装 置通过包封试剂膜中的组分以限定的速率泵出其给定量的产物，只要血糖被限制在特定范 围内。ATP的生产还可以与葡萄糖的摄取相联系以便该装置不会执行其功能直到葡萄糖进 入该装置。如果该装置被包封在保护膜或基质的第二外层中，这提供了一种另外的水平的 控制，可以经过给定时期降解然后允许葡萄糖激活该装置。用这种方法，人们可以容易地产 生为了它们内容物的延迟释放设计的多种亚组的装置，并且亚型的混合物可以测定释放的 速率和持续时间。
在本发明的另一个实施方案中，通过纳米颗粒系统产生的ATP用于给生物电池 (bio-cell)(参见图6)或其它产生电的技术提供燃料。
在一个实施方案中，ATP用于进行反应，例如ATP到ADP的转变，借此产生氢。然后 该氢跨膜移动产生电。氢还可以用于包封试剂的部件以便于室间(intercellular)运输。
本发明的一个进一步的实施方案还涉及用于产生ATP的方法。这包括提供用于从 葡萄糖或果糖代谢产生ATP的系统。该装置包括支持物和偶联到该支持物的能够共同从葡 萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶。该系统在从葡萄糖或果糖代谢有效产生ATP 的条件下与葡萄糖或果糖接触。
如图5中大略所示，在本发明的另一个实施方案中，本发明的ATP生成系统可以
9为偶联至能或不能一起发挥功能的一种或更多种酶或蛋白质的其它次级纳米颗粒支持物 或亚组装件提供动力。这些次级亚组装件可以包括特定形式的酶或蛋白质、纳米颗粒、和/ 或更复杂的分子机器，其中偶联至单个或复数个支持物的酶或蛋白质协力地起作用，如图5 中所示。
例如，可以把数组酶在来自本发明的系统的单独的支持物上偶联在一起，该系统 需要ATP以发挥功能或执行反应。该次级结构也可以携带在与ATP或底物接触时被功能化 的单个酶或蛋白质。该二级结构也可以通过释放酶促反应的产物并由此在另一个次级亚 组装件上触发反应或事件一起起作用。此外，由本发明的装置产生的ATP可以给更复杂的 分子工厂提供燃料，借此底物通过该分子工厂内的一系列或级联反应转变为设计的分子产 物。
在该实施方案中，可以通过对该装置使用磁体除去不需要的亚组装件或支持 物。在一个实施方案中，当磁体被用于该装置时，可能如图5中所示纯化其它次级组件或 结构的产品。更具体地说，磁化的纳米颗粒可以被功能化以便需要的底物或反应产物可 以与磁化的结构分离。这在本领域为大家所熟知(Barry et al.，“ Applications of MagneticNanopartic1es in Biomedicine,“ J. Phys. D :Appl. Phys. 36 :R198-R206(2003)， 其通过引用全文在此并入)。
实施例
下列实施例提供来说明本发明的实施方案但绝非打算限制其范围。
实施例1——重组体己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸异构酶的产生
所有的试剂都从Sigma(St.L0UiS，M0)购买，除非另有指示。使用下列引物通 过 RT-PCR 从小鼠睾丸克隆全长 HKl-sc 和体细胞 GPI, 5' -ATGGGACAGAACTGCCAGCGAGGAC-3 ，(SEQ ID NO :1)(正向，HKl-sc)，5，-TTAGGCGTTCGTAGGGTCTCCTCTGAGCC-3，(SEQ ID NO: 2)(反向，HKl-sc) ,5' -ATGGCTGCGCTCACCCGGAACC-3，(SEQ ID NO :3)(正向，GPI)，以及 5，-TTATTCTAGTTTGGTGTCCCGCTGTTGC-3，(SEQ ID NO :4)(反向，GPI)。使用另一种正向 引物，5，-GAAAAGATTGATAAGTATCTGTATGCCATGCGGC-3，(SEQ ID NO 5)通过巢式 PCR 去除 HKl-sc的生殖细胞特异性靶向结构域。把HK和GPI cDNA克隆进表达载体pcDNA4/HisMax Τ0Ρ0 TAdnvitrogen)，其在氨基端添加了 6组氨酸重复，后面是肠激酶切割位点然后是 糖酵解酶序列。构建体通过测序验证然后使用293feCtinTM转染试剂(Invitrogen)转染 进 HEK293-F-FreeStyle 细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)。48h 以后使用 Ni-NTA 纯化系 统(Invitrogen)从细胞裂解物中纯化蛋白质。纯化的蛋白质使用IL的50mM MOPS透析 3 次,然后使用 Amicon filtrationcentritubes (Mi 11 ipore, Billerica, ΜΑ)浓缩。使用 Micro-BCA试验(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度，并且通过SDS-PAGE和免疫印迹 法分析样品的纯度。使用的初级抗体如下小鼠抗His标签(1 5000稀释，Invitrogen)， 小鼠抗1型己糖激酶(1 1000稀释，Chemicon，Temecula，CA)，和兔抗GPI(1 500稀释， Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。使用的二级抗体为 ECL 抗小鼠 IgG 和 ECL 抗兔 IgG，两者都缀合辣根过氧化酶(Amersham，GE Healthcare, Piscataway, NJ)。
实施例2——重组体HKl和GPI的产生
通过RT-PCR从小鼠睾丸RNA获得HKl (HKl-sc)和GPI的生殖细胞特异性同种型的cDNA，并且通过巢式PCR去除HK的生殖细胞特异性靶向结构域(Travis AJ, et. al，J. Biol. Chem. 274,34467-34475(1990)，其通过引用在此全文并入)。把该构建体插入在氨基端设置 六组氨酸标签的载体，由此替代HKl-sc生殖细胞特异性靶向结构域。在哺乳动物表达系统 中表达His-HK和His-GPI然后使用Ni-NTA系统纯化。使用SDS-PAGE分离产物并且通过 考马斯染色以及使用针对蛋白质和针对His标签的抗体的免疫印迹法分别检验它们的纯 度和身份。发现两种重组体酶都是非常纯的(80-90%，在样品制剂之间只有轻微的变动)， 具有与适当的抗体的免疫反应性，并且以预期的分子量迁移(图7)。
实施例3——His-HK和His-GPI酶活性的定量
利用偶联反应途径分别检查溶液中的重组体蛋白质活性，最终通过340nm处吸光 度的变化测定NADP+的还原。如上所述，对于两种反应，都添加外源葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH)。通过在没有外源G6PDH或底物的情况下进行对照反应，并且比较来自实验蛋白质 与市场上可买到的纯化的HKl和GPI的值，证实吸光度的变化特异地衡量了目标酶活性。
His-HK证明无生殖细胞靶向区域的活性，具有等于11. 67U/mg的Vmax，以及等于 0. 274mM (葡萄糖)的&(表1)。
V maxKfflHis-HK11. 67 士 5. 820. 274 士 0. 12His-GPI48. 89 士 8. 890. 226 士 0. 086
该结果与溶液中的商品化HK酶获得的值非常相似(Vmax= 12. 33U/mg, Kffl = 0. 245mM葡萄糖)。这些结果证明用六组氨酸标签替换生殖细胞特异性结构域的重组体HK 仍然是有功能的。接下来测试了当吸附至具有Ni-NTA表面的金薄片(图8A)时His-HK的 活性。该重组体在表面上显示活性，阴性对照是在缺少外源反应部件的芯片上的重组体，以 及有该反应部件的空白Ni-NTA芯片。为了鉴定占有(co-opt)生殖细胞特异性靶向结构域 的价值，进行了若干产生缺少天然靶向结构域或His标签的重组体HK(利用载体提供的肠 激酶位点)的尝试。这些蛋白质是非常不稳定的，并且它们的降解防碍获得可解释的比较 数据。
把类似方法用于His-GPI，当在溶液中测试时其具有等于48. 89U/mg的Vmax，以及 等于0. 226mM(果糖6-磷酸)的&(表1)。与HK不同，有可能利用肠激酶(Novagen,EMD/ Merck, Madison, WI)去除His标签。用肠激酶树脂和Ni-NTA琼脂糖来从裂开的His标签 去除残余的肠激酶和蛋白质。然后利用SDS-PAGE和使用针对His标签的抗体的免疫印迹 法证实没有His-GPI残存。裂解后，检验了 GPI蛋白质的动力学活性具有相似的结果。不 带His标签的GPI构建体具有等于51. 28U/mg的Vmax，以及等于0. 308mM(果糖6-磷酸)的 Km。如同HK的情况一样，这些值与商品化的酶获得的那些(Vmax 54. 054U/mg,Km 0. 476mM果 糖6-磷酸)非常相似。当于4°C存储时实验和对照GPI重组体蛋白质两者都稳定超过2个 月。
接下来测试了当拴至Ni-NTA金芯片时His-GPI的活性(图8B)。当吸附至表面 时重组体显示了活性，表明甚至当拴住时重组体也是有功能的。芯片上的吸附和比活性在
11His-GPI和对照GPI之间显著不同，其中对照GPI的His标签使用肠激酶去除(图9)。因 此，氨基端连接物不仅提供更高的与芯片结合的量，而且提供显著更高的结合的每单位蛋 白质的活性。
实施例4——Ni-NTA表面的制备和蛋白质固定
为了测定与芯片结合的蛋白质的量，在吸附前后定量溶液的浓度。使用椭圆率测 量术通过测定吸附至表面的蛋白质层的相对厚度证实该发现。
实施例5——His-HK和His-GPI活性的分光光度分析
利用导致NADP+到NADPH的还原的偶联酶反应途径测定HK和GPI活性。该还原的 速率使用分光光度计(SAFIRE microplate reader, Tecan,Medford,ΜΑ)测量为 340nm处的 吸光度变化。对于HK的偶联反应如下葡萄糖+ATP —葡萄糖-6-磷酸+ADP和葡萄糖-6-磷 酸+NADP+ — NADPH+6-磷酸-葡萄糖酸-δ -内酯，其中第一个反应由His-HK催化，而第二 个由外源葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH)催化。对于GPI的偶联反应如下果糖_6_磷酸 —葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸+NADP+ — NADPH+6-磷酸-葡萄糖酸-δ -内酯，其中 第一个反应由His-GPI催化，而第二个由外源G6PDH催化。在紧接着各试验前制备新鲜的 NADP+和ATP的储存液。基础反应混合物包含50mMM0PS缓冲液(pH 7.4)中的ImM NADP+、 IOmM MgCl2、和3U/mlG6PDH。为了定量HK活性，添加了 ImM ATP和5mM葡萄糖。为了定量 GPI活性，添加了 5mM果糖6-磷酸。从线性范围内获取的斜率确定活性测量结果。各种酶 的K1^nvmax通过在它们的各自底物的多种浓度定量酶活性并拟合该数据为双曲线函数来计 算。一个酶活性单位定义为每分钟催化lymol NADPH形成的酶的量。
实施例6——把酶拴至无机支持物以及结合时活性的定量
通过室温下在黑暗中把60 μ 1包含已知的量蛋白质的50mMM0PS(pH 7. 4)置于单 个金Ni-NTA表面(IX Icm正方形)吸附蛋白质。15min后，通过移液移去50 μ 1溶液，然后 把90μ1 MOPS缓冲液温和地加到该表面。然后收集该体积并与已经移去的50 μ 1组合以 便定量不结合的蛋白质的量。再进行使用90 μ 1体积MOPS缓冲液的两次洗涤，并且这些也 分别收集以定量移去的蛋白质。使用Micro-BCA蛋白质试验确定这三个体积中的蛋白质的 浓度并且通过减去计算保留在芯片上的蛋白质的量。应当注意到通过第二次和第三次洗涤 移去的蛋白质的量一致在检测水平以下。为了保证去除所有未结合或松弛结合的蛋白质， 然后使用5ml MOPS缓冲液温和地洗涤该表面3次。因此，应当注意到为了定量比活性的目 的，结合的蛋白质的量等于或少于定量的量，产生保守的误差。
在带有Iml体积反应混合物中的芯片的孔中酶反应自己进行。通过移去300 μ 1反 应混合物并转移至该平板内的另一个孔在多个时间点测定340nm处吸光度的变化。如上使 用分光光度计获得读数。一个酶活性单位定义为每分钟催化lymol NADPH形成的酶的量。 所有试验进行至少3次，每次使用至少三次重复的芯片组。阴性对照包括单独的Ni-NTA表 面以及带有吸附的蛋白质，但是失去外源底物的表面。使用吸附His标记的重组体对比不 带His标签产生的重组体，或者对比通过肠激酶裂解去除His标签的重组体的芯片获得比 较测量。
为了确定Hi s-HK和Hi s-GPI是否可以顺序地起作用，通过室温下在黑暗中把 60 μ 1 混合蛋白质溶液(50mM MOPS 缓冲液，pH 7. 4 中的 0. 5nM Hi s-HK, 0. 5nM Hi s-GP I)置 于单个金Ni-NTA表面(IXlcm正方形)上固定蛋白质。Ih后，使用5ml MOPS缓冲液温和地洗涤表面3次。通过在340nm测定由于外源甘油3-磷酸脱氢酶的NADH的氧化在室温下 进行HK-GPI顺序反应测定。以与HK和GPI分别相似的方式进行反应，使用在pH 7. 4包含 50mM M0PS、5mM 葡萄糖、ImM ATP、0. 5mM NADH、2mM MgCl2、0. 5U/ml 磷酸果糖激酶、0. 5U/ml 醛缩酶、7U/ml丙糖磷酸异构酶、和2U/ml甘油3-磷酸脱氢酶的反应混合物。在紧接着各试 验前制备新鲜的NADH和ATP的储存液。一个偶联反应活性单位定义为每分钟催化1 μ mol NAD+形成的酶的量。所有试验进行至少3次，每次使用至少三次重复的芯片组。阴性对照 包括单独的Ni-NTA表面、带有两种吸附的蛋白质但是失去外源底物、或者His-HK和途径试 剂、或者His-GPI和途径试剂的表面。使用吸附His标记的重组体对比通过肠激酶裂解去 除His标签的重组体的芯片获得比较测量。
实施例7——在单一装置中His-HK和His-GPI的顺序反应
接下来以若干不同的摩尔比混合重组体His-HK和His-GPI并把它们附着到单个 M-NTA涂布的表面。这两种酶是糖酵解的最初两个步骤。彻底漂洗后，测试了拴住的重组 体蛋白质的连续的酶活性，而且人们发现这两种酶实际上顺序地起作用，把葡萄糖代谢成 为果糖6-磷酸(图10)。对照包括利用偶联反应途径的全部试剂吸附单独的His-HK，以及 利用偶联反应途径的全部试剂，和利用单独的缓冲液吸附单独的His-GPI。所有的对照产生 相等的基准读数(图10)，证实吸光度的变化由拴住的酶的活性产生。在使用的偶联反应途 径下只有这两种酶一起才显示活性。这证明反应缓冲液和其单个组分没有被任何一种酶污 染，也没有被在有任何一种酶的情况下可以引起吸光度变化的其它化学制品污染。
虽然在此已经描述和详细描写了优选实施方案，对于相关技术领域：
的技术人员明 显地，可以产生多种改变、添加、替换等而不背离本发明的精神并且这些因此被认为是在如 随后的权利要求
中限定的本发明的范围之内。
权利要求
一种用于产生三磷酸腺苷的系统，所述系统包括支持物和能够共同从葡萄糖或果糖代谢产生三磷酸腺苷的一种或更多种酶，其中所述一种或更多种酶偶联到所述支持物。
2.权利要求
1的系统，其中所述支持物包括复数的分离的表面，不同组的复数的酶附 着到该分离的表面。
3.权利要求
2的系统，其中附着到单个表面的不同酶各自通过不同的偶联化学作用附
4.权利要求
1的系统，其中所述一种或更多种酶是己糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、 6-磷酸果糖激酶、醛缩酶、丙糖_磷酸_异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶、磷酸甘油酸激 酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶。
5.权利要求
4的系统，其中复数的酶以选择的位置连续地偶联到支持物上以连续地进 行从葡萄糖或果糖代谢生产三磷酸腺苷的步骤。
6.权利要求
1的系统，进一步包括在适合转变丙酮酸盐为乳酸盐的位置偶联到该支持物的乳酸脱氢酶。
7.权利要求
1的系统，其中所述一种或更多种酶通过用能够使所述一种或更多种酶靶 向该支持物的结构域替代所述一种或更多种酶的靶向/支架结构域偶联到该支持物。
8.权利要求
7的系统，其中用组氨酸标签替代所述一种或更多种酶的靶向/支架结构 域并且该支持物具有与组氨酸标签结合的连接剂和/或用GST融合标签替代所述一种或更 多种酶的所述靶向/支架结构域并且该支持物具有与GST融合标签结合的连接剂。
9.权利要求
8的系统，其中该连接剂是次氮基三乙酸镍或谷胱甘肽。
10.权利要求
1的系统，其中该支持物被聚乙二醇或金涂布。
11.一种用于进行包括三磷酸腺苷到二磷酸腺苷的转变的反应的装置，所述装置包括用于产生三磷酸腺苷的系统，所述系统包括 支持物和能够共同从葡萄糖或果糖代谢产生三磷酸腺苷的一种或更多种酶，其中所述一种或更 多种酶偶联到所述支持物和与所述系统相关并且能够把三磷酸腺苷转变为二磷酸腺苷和进行该反应的部件。
12.权利要求
11的装置，进一步包括 围绕所述系统和所述部件的包封试剂。
13.权利要求
12的装置，其中该包封试剂选自脂质体、硅橡胶植入物和特氟隆植入物。
14.权利要求
12的装置，进一步包括以下之一或两者定位于包封试剂中把葡萄糖或果糖运送至偶联到该支持物的酶的溶质载体家族2转 运蛋白或葡萄糖转运蛋白；和/或定位于包封试剂中从所述装置转运丙酮酸盐和/或乳酸盐的单羧酸盐转运蛋白。
15.权利要求
12的装置，进一步包括 包封试剂中底物的进口和包封试剂中作为与该装置相关的酶活性的结果从底物生产的反应产物的出口，其中该活性需要三磷酸腺苷到二磷酸腺苷的转变。
16.权利要求
15的装置，其中该进口和出口独立地选自通道、转运蛋白和孔。
17.权利要求
15的装置，进一步包括 定位在支持物上使底物磷酸化的酶。
18.权利要求
12的装置，进一步包括包封试剂中的三磷酸腺苷结合盒家族转运蛋白的成员，其中该转运蛋白与三磷酸腺苷 相互作用以从该装置释放试剂。
19.权利要求
11的装置，其中所述一种或更多种酶是己糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、 6-磷酸果糖激酶、醛缩酶、丙糖_磷酸_异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶、磷酸甘油酸激 酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶。
20.权利要求
19的装置，其中复数的酶以选择的位置连续地偶联到支持物上以连续地 进行从葡萄糖或果糖代谢生产三磷酸腺苷的步骤。
21.权利要求
11的装置，进一步包括在适合转变丙酮酸盐为乳酸盐的位置偶联到该支持物的乳酸脱氢酶。
22.权利要求
11的装置，其中所述与所述系统相关的部件进行生物化学或生物学反应。
23.一种用于进行包括三磷酸腺苷到二磷酸腺苷的转变的反应的方法，所述方法包括提供用于从葡萄糖或果糖代谢产生三磷酸腺苷的系统，所述系统包括 支持物和能够共同从葡萄糖或果糖代谢产生三磷酸腺苷的一种或更多种酶，其中所述一种或更 多种酶偶联到所述支持物；在从葡萄糖或果糖代谢有效产生三磷酸腺苷的条件下使该系统与葡萄糖或果糖接触；和把三磷酸腺苷转变为二磷酸腺苷并且进行该反应。
24.权利要求
23的方法，进一步包括 把葡萄糖或果糖运送至该系统。
25.权利要求
23的方法，进一步包括 从该系统转运丙酮酸盐和/或乳酸盐。
26.权利要求
23的方法，进一步包括 运送底物至该支持物和从该支持物移去作为三磷酸腺苷到二磷酸腺苷转变的结果从该底物生产的反应产物。
27.权利要求
26的方法，其中该反应产物是由定位到该支持物上以使底物磷酸化的酶 产生的磷酸化形式的底物。
28.权利要求
23的方法，进一步包括作为三磷酸腺苷与三磷酸腺苷结合盒家族转运蛋白的成员相互作用的结果从该装置 释放试剂。
29.权利要求
23的方法，其中所述一种或更多种酶是己糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、 6-磷酸果糖激酶、醛缩酶、丙糖_磷酸_异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶和丙酮酸激酶。
30.权利要求
29的方法，其中复数的酶以选择的位置连续地偶联到支持物上以连续地 进行从葡萄糖或果糖代谢生产三磷酸腺苷的步骤。
31.权利要求
23的方法，进一步包括用偶联到该支持物的乳酸脱氢酶把丙酮酸盐转变为乳酸盐。
32.权利要求
23的方法，其中所述一种或更多种酶通过用能够使所述一种或更多种酶 靶向该支持物的结构域替代所述一种或更多种酶的靶向/支架结构域偶联到该支持物。
33.权利要求
32的方法，其中用组氨酸标签替代所述一种或更多种酶的靶向/支架结 构域并且该支持物具有与组氨酸标签结合的连接剂和/或用GST融合标签替代所述一种或 更多种酶并且该支持物具有与GST融合标签结合的连接剂。
34.权利要求
33的方法，其中该连接剂是次氮基三乙酸镍或谷胱甘肽。
35.权利要求
23的方法，其中该支持物被聚乙二醇或金涂布。
36.权利要求
23的方法，其中该系统最初由NAD+、ADP和/或ATP启动。
37.权利要求
23的方法，其中所述反应跨膜移动氢以产生电。
38.权利要求
37的方法，进一步包括转换三磷酸腺苷中的能量来为外部电路提供动力。
39.权利要求
23的方法，其中所述反应产生氢，所述方法进一步包括 使用该氢来促进跨膜运输。
40.一种用于产生三磷酸腺苷的方法，所述方法包括提供用于从葡萄糖或果糖代谢产生三磷酸腺苷的系统，所述系统包括 支持物和能够共同从葡萄糖或果糖代谢产生三磷酸腺苷的一种或更多种酶，其中所述一种或更 多种酶偶联到所述支持物；和在从葡萄糖或果糖代谢有效产生三磷酸腺苷的条件下使该系统与葡萄糖或果糖接触。
专利摘要
本发明涉及用于产生ATP的系统。该系统由支持物和偶联到支持物的能够共同从葡萄糖或果糖代谢产生ATP的一种或更多种酶组成。本发明另外涉及一种装置，其包括该系统，以及一种使用该系统进行包含ATP到ADP的转变的反应的方法。
文档编号C12P19/30GKCN101889094SQ200880119760
公开日2010年11月17日 申请日期2008年10月16日
发明者A·特拉维斯 申请人:康乃尔研究基金会有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan