用于发育细胞的含有高浓度硫辛酸的培养基的制作方法

专利名称：:用于发育细胞的含有高浓度硫辛酸的培养基的制作方法
技术领域：
：本发明主要涉及哺乳动物体外受精(IVF)以及用于进行受精及胚胎发育和用于进行干细胞培养的培养基和方法。具体而言，本发明提供一种含有高浓度硫辛酸的培养基，所述培养基支持发育细胞包括胚胎的生长和发育并明显增加了IVF中成功受孕的可能性。
背景技术：
：下面的描述是为了帮助读者理解。本发明人未承认所提供的信息或引用的文献为本发明的现有技术。体外受精是一种用于克服多种形式的雄性和雌性不育的技术。该方法包括在体外用精子使卵子受精并随后将该发育中的胚胎转移到雌性身体中。尽管从第一例IVF的诞生(Steptoe，P.C.andEdwards,R.G，2(8085):366(1978))至今已经近30年，然而该方法一直存在着床率和受孕率低的问题。在第一例"试管嬰儿"的诞生之后的十年间，有报告的IVF的成功率仅为8-10%。这种低成功率至少部分是由于胚胎培养基的质量差。不幸的是，尽管在过去的30年中一直努力提高和特化IVF培养基，然而在采用单转移的情况下成功率仅提高至约30-35%(基于2005年芬兰和瑞典的国家IVF登记)。此单转移数据与1978年的数据相当接近。这种提高IVF成功率的緩慢进展反映了改变和加强用于发育细胞(例如配子、受精卵和胚胎)的培养基的困难和不可预测性。目前用于人类IVF的培养基类型分为两类简单的和复杂的。简单培养基，如Earle，s培养基和人输卵管液(HTF)，是添加有碳水化合物能源例如丙酮酸盐、乳酸盐和葡萄糖的平衡盐溶液。复杂培养基，如Ham，sF-10,还包括非必须和必须氣基酸以及其他添加剂如维生素、抗生素和血清或蛋白。尽管某些IVF培养基意在用单一培养基支持胚胎发育至8细胞期或更高的阶段，然而趋势是优化不同的培养基以支持处于发育不同阶段的发育中的胚胎。这导致了IVF中序贯培养基的广泛应用。例如，序贯培养基系统可在发育的最初48小时期间使用一种培养基用于从单细胞受精卵到8细胞胚胎的胚胎生长，并使用另一种培养基用于8细胞胚胎到胚泡期的生长。由于雌性生殖道为发育中的胚胎提供不断变化的环境，因此所述序贯培养基旨在更接近地模仿体内胚胎生长期间的雌性生殖道。该培养基的组成通常在例如氨基酸和糖的组分上不同以提高对该培养基支持胚胎生长和发育的优化。IVF中所用的培养基在过去的30年中已经有了一些发展。然而，在某些方面，所述培养基仍然明显保持不变。大多数针对提高胚胎培养基的研究的焦点已经集中在构成所述培养基核心或主体的组分——^水化合物能源、氨基酸、血清和盐/緩沖液。而很少关注其他成分。在某些情况下，胚胎培养基中包括这些成分似乎只是因为它们存在于由其最初演变出胚胎培养基的早期体细胞培养基中。硫辛酸(LA)就是这样一种成分。硫辛酸，也称为a-硫辛酸或硫辛酸(thiocticacid)，作为催化丙酮酸盐、a-酮戊二酸盐和支链a-酮酸的氧化脱羧作用的多酶复合体的E2(二氢硫辛酸酰基转移酶)亚基的辅酶而广为人知。然而，在过去10年左右的时间内，已清楚^Tu辛酸也是一种抗氧化剂。^Tu辛酸的效力已经被归因于硫辛^/二氩硫辛酸系统独特的抗氧化剂特性、其活性氧族(ROS)净化能力和对其他抗氧化剂(包括最强的抗氧化剂之一，谷胱甘肽)的还原形式的组织浓度的明显作用。文献记载的数据显示硫辛酸和二氢硫辛酸(DHLA)对特定细胞类型(如小鼠白血病细胞和JurkatT细胞)可能具有也可能不具有生长促进作用。参见Dovinova"7Veo^/"s附a，Vol.46，pp.237-241(1999)和Mizunoa/"丑/oc/^附.及es;CVww/mww.，Vol.200，pp.1134-1136(1994)。硫辛酸是一种二硫化物、两性化合物，其含有一个手性中心从而可形成两种对映形式(R和L)，其中R对映体生物活性最强。所述二碌u组分使该分子具有金属鳌合性质，而该化合物的两性性质使该相对较小的分子(MW=206.34g/mol)可容易地扩散通过细胞膜，在那里其容易被数种细胞多酶复合体转化为其二硫基的还原形式一一DHLA,所述细胞多酶复合体参与能量代谢中重要的步骤——a-酮酸的氧化脱羧。此外，所述6DHLA/LA对具有已报道的-0.29V的氧化还原电势，使得该对成为一个强电子受体/氧自由基清除单位。这一强氧化还原电势使该分子可作为其他抗氧化剂如维生素C、维生素E、谷胱甘肽、辅酶Q10和泛醌的潜在循环器(recycler)。尽管据推测硫辛酸的还原发生在细胞内，然而人们认为生成的DHLA可从细胞泄漏到周围培养基中，涉及细胞内和细胞外的抗氧化剂能力。硫辛酸广泛地存在于原核和真核细胞中。硫辛酸根——未质子化的碱一一是生理条件下最普遍的形式，并被认为是由硫辛酸合成酶在细胞内用前体辛酸和硫源(最可能的是半胱氨酸残基)合成的。这使得该分子成为一种非必需营养素，尽管已有报导称其在与过度氧化压力有关的疾病中是一种有价值的饮食添加剂，所述疾病包括关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、代谢综合征和老年性痴呆。参见，例如，PershadsinghHA，五x/eWO/mVi/騰鄉16:291-302(2007》Holquist"tf/"i^ar扁co/7to113:154-64(2007).。尽管关于硫辛酸在体内的作用的知识不断增加，但关于其对培养基中的发育细胞(例如胚胎)生长的作用仍知之甚少。尽管胚胎培养基中有时含有低浓度的硫辛酸，但通常是不含的。两项已经系统性地研究了硫辛酸在胚胎培养基中的作用的研究得出，在胚胎培养基中省略硫辛酸对结果没有影响。第一项研究观察了Ham，sF10培养基中11种水溶性维生素(包括硫辛酸)对8细胞仓鼠胚胎在体外发育至正赙化和已孵出胚泡的作用(KaneC/"丑/o/ogy0/及印radw"/0"，39，1137(1988).)。此研究得出，在8细胞仓鼠胚胎的发育中省略硫辛酸不会对任何培养阶段的发育造成明显影响。第二项研究观察了Ham，sF10培养基中11种水溶性维生素(包括硫辛酸)的省略对兔桑椹胚至扩展胚泡的培养的影响(Kane，/.E，c/^.Z卯/ogy，245，220(1988).)。此研究也得出硫辛酸的省略无明显影响。虽然如此，某些胚胎培养基中还是包括硫辛酸。尽管从出版文献中找不到清楚的原因，然而那些包括硫辛酸的胚胎培养基都将其浓度限制为lnM或更低。这可能是由于许多胚胎培养基最初是从早期和仍然常见的体细胞培养基Ham，sF10和F12培养基演变而来，所述体细胞培养基中硫辛酸的浓度恰好是l^M。然而，从上面引用的研究中可明了，在这些培养基中包括硫辛酸的必要性或可取性在早期使用Ham，sF10和F12培养基作为早期胚胎培养基的基础时并没有考虑。这还可由当前大部分商业胚胎培养基产品中似乎根本不含任何硫辛酸的事实来清楚地证明。事实上，体细胞培养基从Ham，sF10和F12培养基演变的趋势是那些培养基的稀释物，从而导致了含有更低浓度硫辛酸的培养基。例如，一种来自Ham'sF12的常用培养基是DMEM/F12,所述DMEM/F12是Ham，s12被Dulbecco，s改良必需基本培养基(DMEM)以1+1稀释所得的培养基，所述DMEM是另一种不含硫辛酸的培养基。RDF是另一种出现更晚并以DMEM/F12为基础的常见培养基。RDF是DMEM/F12被RPMI1640培养基以1+1稀释所得的培养基，所述RPMI1640是另一种不含硫辛酸的培养基。因此，这种培养基从Ham，sF10和F12演变的趋势证明硫辛酸在培养基中的作用已经被忽视和不被欣赏。体细胞培养基中也以其他浓度包括硫辛酸，然而，硫辛酸在这些培养基中所用的浓度是呈许多数量级变化的，且已经公认"不同细胞类型的成功的体外培养经常需要使用不同的培养基配方"(参见，例如，PCT申请公开号WO98/08934)。这对于用于发育细胞如胚胎的培养基是特别正确的，发育细胞具有与体细胞非常不同的要求。此外，即使在体细胞培养基领域内，对于硫辛酸在培养基中是否有益也是有分歧的(参见，例如，PCT申请公开号WO99/35242,第44页称"有时将a-^^辛酸(硫辛酸)加入到培养基中，但几乎没有确实需要该物质的证据")。因此，关于在体细胞培养基中使用硫辛酸的文献未说明硫辛酸在用于发育细胞(如配子、受精卵和胚胎)的培养基中的需要性或作用。
发明内容的改良培养基。本发明还提供在所述培养基中培养哺乳动物发育细胞的方法。所述培养基的特征在于明确限定下述硫辛酸和/或疏辛酸衍生物浓度范围，即至少为任何其他已知胚胎培养基的5倍，更理想地至少为IO倍。与对照培养基相比，包括浓度在发明人指定范围内的硫辛酸或硫辛酸衍生物的培养基能够使胚泡的存活率增加、细胞数量增加、内细胞团增加和/或内细胞团占总细胞团的百分比增加。这具有重要意义，因为这些因素被认为是胚胎健康以及未来在子宫中成功发育为胎儿的预示。在一个具体实施方案中，所述培养基包括水、无机盐、至少一种能源和浓度为5pM-40的硫辛酸。在一个实施方案中，所述培养基还包括一种或多种氨基酸。这包括具有浓度为5nM的硫辛酸的培养基，还包括具有浓度为5nM硫辛酸的培养基，还包括具有浓度为8pM硫辛酸的培养基并且还包括具有浓度约为10nM硫辛酸的培养基。所述培养基可任选地包括其他成分，例如但不限于生长因子、激素、维生素和抗生素。所述培养基可被调整为适合支持发育细胞从第一发育阶段到第二发育阶段的生长。例如，培养基可被设计为支持哺乳动物胚胎发育至4细胞期、至8细胞期或至胚泡期。因此，本发明涵盖的多种培养基可包括浓度可变的不同组分。结合附图，根据下面的详细描述可明了本发明更多的目标、特性和优图1给出了显示依照本发明在20%的02下体外小鼠胚胎的胚泡发育的数据。图2给出了显示依照本发明在5%的02下体外小鼠胚胎胚泡发育的图3给出了显示在硫辛酸存在的情况下对活性氧族(ROS)的抑制的数据。具体实施方式本发明提供含有高浓度的硫辛酸和/或硫辛酸衍生物的IVF和干细胞培养基组合物，其支持配子、受精卵和或胚胎植入前的体外发育。更具体地，本发明的IVF培养基含有浓度为5nM-40pM的硫辛酸和/或石危辛酸衍生物。在此范围内，胚胎发育的最大提高发生在约10pM。因此，本发明的培养基也包括其中硫辛酸和/或硫辛酸衍生物浓度在更精确范围内的培养基，所述范围包括，例如，5-20^M、5-15pM和8-12^M,优选为约10pM。因此，本发明提供用于哺乳动物胚胎的培养基，其与包括硫辛酸的已知胚胎培养基相比硫辛酸浓度至少增加5倍，更理想地至少增加10倍。除商业和工业用途之外，本文所述的培养基及其用途还具有重要的非商业和非工业用途(如研究)。本发明并不意图支持法律所禁止的人类胚胎的商业用途。术语"培养基，，在本说明书通篇中都是用于指具有限定渗透压和pH的含有盐和碳水化合物的水性介质，其用于发育哺乳动物细胞(如干细胞、配子、受精卵和胚胎)的体外培养。这些培养基可以是由任何本领域技术人员在实验室中制备，也可以商业购得。尽管下面的很多讨论都关注于用于发育胚胎的培养基，应理解所述培养基也可用于发育和培养干细胞、配子和受精卵。术语"胚胎"用于指从受精卵至最初5到6天的所有发育阶段的细胞。术语"发育细胞"用于指干细胞、配子、受精卵和胚胎。本发明至少部分基于本发明人的以下发现含有浓度为在5-40的硫辛酸的培养基与省略了硫辛酸或含有浓度在此范围之外的硫辛酸的培养基相比大大提高了IVF方法的成功率。尽管并不意图为理论所限制，本发明人相信因用于发育细胞的培养基中高的硫辛酸浓度而得到的益处是由于多种作用的相互影响。硫辛酸的抗氧化作用似乎在所述培养基中起到了重要作用。具体地，在培养基中添加硫辛酸被认为对保护发育细胞免于自由基和活性氧族的氧化破坏起作用。然而，其他作用似乎也有助于所述益处并帮助将在用于配子、受精卵和胚胎的培养基中的硫辛酸限定在一个较窄的有效范围。这些作用包括增加GSH细胞间水平和螯合作用的可能性。此外，因培养基中硫辛酸水平增加而带来的益处可为多种硫辛酸代谢产物的结果，所述代谢产物存在于发育细胞内的硫辛酸代谢的不同阶段。例如，所述益处可来自于硫辛酸衍生物，例如甲基化硫辛酸或DHLA。由本发明的培养基提供的提高可通过几个参数中的一个或多个进行测量。这些参数包括至4或5天阶段的胚泡的存活率增加、胚泡的细胞数目增加、胚泡的内细胞团增大以及胚泡的内细胞团占总细胞团的百分比增加。本发明人已经发现，硫辛酸浓度范围在5-40jiM之外的培养基不能提供这些有益效果，并甚至可对胚胎发育具有有害作用。例如，本发明人已经发现，向培养中添加浓度低于5jiM的硫辛酸对(i)培养中的胚胎发育至胚泡期，(ii)体外胚泡中的细胞数量，或(m)胚泡的内细胞团只显示出很小的作用(如果有的话)。相反，在含有至少5jiM硫辛酸的培养基中培养的胚胎展现了全部这些有益效果。同样，当向培养基中添加浓度高于约40jiM的硫辛酸时也得不到这些有益效果。高于此浓度时，会出现第4天胚泡发育降低和细胞数目减少的趋势。因此，硫辛酸似乎只在一个临界范围内有作用。因使用本发明培养基而导致的胚胎发育的改善可通过比较在含有高浓度疏辛酸和/或其矛汴生物(即5-40nM)的改良培养基中培养的胚胎与在对照培养基中培养的胚胎来加以定量，所述对照培养基与所述改良培养基的不同仅在于对照培养基中不含硫辛酸或其衍生物。例如，当受精的哺乳动物受精卵(例如，CF1小鼠受精卵)在本发明培养基中培养至第4或第5天时，本发明培养基在以下一个或多个方面可提供至少5%、至少10。/。或甚至至少15%的增高(l)第3天的致密化百分比；(2)第4天的总胚泡发育百分比；(3)第5天的总胚泡发育百分比；和(4)第5天的胚泡孵化百分比。此外，本发明培养基可使胚泡的总内细胞数量增加和/或由内细胞导致总团的百分比增加，与在对照培养基中培养的胚泡相比，增加至少10°/。，甚至至少15%。本发明培养基可被优化以支持在各个阶段的胚胎发育。例如，所述培养基可被优化以将胚胎培养至4细胞期、8细胞期、从4细胞期到8细胞期、到胚泡期或者从4或8细胞期到胚泡期。因此，所述培养基的必需和非必需成分的性质和浓度是可变的，然而，在每种包括硫辛酸(或其衍生物)的培养基中，理想的硫辛酸浓度都是5-40pM。在序贯发育细胞培养中，硫辛酸或硫辛酸衍生物可在一种培养基中存在而在其他培养基中不存在。本发明培养基在有氧条件下(如约20%)和低氧条件下(如约5%)都可使生长和发育的胚泡获得改善。这很重要，因为大多数IVF过程都在有氧条件下培养胚胎，尽管低氧条件能更好地模仿子宫环境和提供更好的结果。Quinn，P"Harlow，GM.，"Theeffectofoxygenonthedevelopmentofpreimplantationmouseembryos/"W加"，/￡"平Zoo/"Oct.1978，206(1):73國80.;Thompson,J.(i，Simpson,A.C.，Pugh，P.A"Donnelly,P.E.，Tervit，H.R.，"Effectofoxygenconcentrationonin画vitrodevelopmentofpreimplantationsheepandcattleembryos,"/及c/wyw/.i^W//.，July19卯，89(2):573-8.这种情况通常是因为在低氧条件下培养所需要的三气培养箱的费用。因此本发明培养基组合物提供一种能够更好地适应在高氧化压力下培养的胚胎的培养基。用于培养发育细胞(如胚胎)的典型培养基包括水、无机盐、一种或多种能源、一种或多种氨基酸(包括非必需氨基酸和任选地包括必需氨基酸)作为核心成分。胚胎培养基中典型的能源包括包括碳水化合物能源，如丙酮酸盐、乳酸盐和葡萄糖。合适的无机盐包括CaCl2*2H20、CuS045H20、FeS04.7H20、KC1、MgS04、NaCl、NaHC03、Na2HP04、ZnS04*7H20和KH2P04。非必需氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸。必需氨基酸包括组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。除硫辛酸和核心成分之外，所述培养基通常还包括其他添加剂。这些包括维生素如生物素、泛酸、叶酸、烟酰胺、维生素B6、核黄素和硫胺素，还包括生长因子、激素和抗生素如青霉素G和硫酸链霉素。还可在所述培养基中加入白蛋白(如人血清白蛋白或重组人白蛋白)、聚乙烯吡咯烷酮、透明质烷、螯合剂如EDTA,以及緩冲液如HEPES緩沖液或MOPS緩沖液。所述培养基中还可包括的各种特定成分包括但不限于氯化胆碱、次黄噤呤、肌醇、胸腺嘧啶、氰钴胺、半胱胺、酚红和谷胱甘肽。培养基可针对胚胎发育阶段而优化，从而培养基中核心成分和其他添加剂的浓度可根据胚胎发育阶段而变化。所述培养基中无机盐的典型浓度可为约100mM到约150mM或约110mM到约140mM。所述培养基中能源的典型浓度可为约5mM到约40mM,约5mM到约30mM，或约5mM到约15mM。所述培养基中^J^酸总量的典型浓度可为约0.1mM到约15mM，约0.5mM到约12mM或约0.5mM到约6mM。所述氨基酸组成和其浓度可根据所述培养基中细胞的发育阶段而变化。所述培养基中加入的维生素、生长因子、激素和其他各种成分的浓度相当低，如lmM或更低，0.5mM或更低或者甚至0.1mM或更4氐。本发明培养基可通过以下方法来配制，即在已有的胚胎培养基中加入足够的硫辛酸或硫辛酸衍生物以提供浓度为5-40硫辛酸或硫辛酸衍生物。硫辛酸衍生物包括衍生自硫辛酸的分子，其对于提高培养中的发育细胞的存活或发育具有等同或基本等同的生物学作用。因此，硫辛酸的衍生物包括但不限于曱基化硫辛酸和DHLA。对于此申请，衍生物也指具有基本等同的生理性质的其他生物学活性的两性二辟u化物/硫辛酸分子。所添加的硫辛酸或硫辛酸衍生物既可为对映体混合物，也可为单一对映体。对于后者，R-对映体是更理想的，因为其生物学活性更高。例如，可将硫辛酸加入到市售简单培养基如人类输卵管液(HTF),Whittingham，sT6培养基和Earle，s平衡盐溶液(EBSS)(可从IrvineScientific获得)中，所述简单培养基中已经加入丙酮酸盐、葡萄糖和乳酸盐作为能源。这些简单培养基通常已经被用于临床IVF设备以进行卵子受精并培养胚胎直到在第2或第3天进行转移。也可将^5克辛酸加入到i殳计用于支持早期胚胎生长的更复杂胚胎培养基中。这些培养基包括可从Vitrolife获得的G1TM培养基。这种培养基设计用于支持卵裂期的胚胎发育至约8细胞期。该培养基含有碳水化合物、氨基酸和螯合剂以支持所述早期胚胎。该G1培养基的完整配方见表1。表1-G1培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(除非另外指出，表l中的浓度单位是mM。)或者，可将硫辛酸或硫辛酸衍生物加入到市售的能够支持胚胎发育到第3天(8细胞期)以上的IVF培养基中。这些培养基设计用于将胚胎培养到胚泡期然后植入。根据本发明，可将硫辛酸加入这些培养基以加强胚泡发育甚至更进一步的发育。一个实例包括Desai""/.，好"附做及e/ww/12:328-335(1997)中所述的a-改良必需培养基(aMEM)。第二个实例包括加有泛酸盐的HECM隱6培养基(McKiernanSHandBavisterBD，好"附""及印/w/15:157-164(2000))。其他实例包括可从Vitrolife获得的G2培养基。G2是一种设计用于支持胚胎从约8细胞期(第3天)发育到胚泡期的培养基。该培养基(表2)含有碳水化合物、氨基酸和维生素以支持所述晚期胚胎。表2-G2培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在一个实施方案中，将8细胞期胚胎从一种添加有硫辛酸的经优化用于支持早期生长(即至8细胞期)的胚胎培养基中转移到一种经优化用于支持晚期生长(即至胚泡期)的胚胎培养基中，所述晚期培养基中可添加或不添加為1t辛酸。本发明培养基也可通过以下方法来配制，即在已有的配子(卵子或精为5-40fiM的硫辛酸或硫辛酸衍生物。下面的表3-5提供了其中可加入硫辛酸以提高细胞发育和存活的配子培养基。表3-卵子成熟培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表4-精子制备和受精培养基的组成*<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在每次处理中用200个培养胚胎分析胚泡发育和计量细胞数量。结果示于附图1(20%02)和2(5%02)中。该数据基于每次研究所培养的200个胚胎。当试验浓度为1-100pM的硫辛酸对培养中远系繁殖(CF1)小鼠胚胎的作用时，使用10jiM硫辛酸时所得到的胚泡的细胞数量明显较高。硫辛酸浓度为lfiM时，在5%或20%的氧气浓度下都未观察到细胞数量有统计学上显著的增加。此外，硫辛酸在更高浓度下也没有有益效果。事实上，当硫辛酸浓度为100nM时，所述胚胎的细胞数量明显低于在对照培养基中生长的对应胚胎。附图1和2的数据分别示于表6和7中，其还提供了滋养外胚层、内细胞团(ICM)和ICM比例的结果。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例2-第4天小鼠胚胎的序贯IVF培养中的硫辛酸单独使用Gl或使用Gl加10nM硫辛酸培养CF1小鼠胚胎。48小时后，将两处理组的胚胎都移入G2中。所有培养物都在低02条件下孵育。在71和78小时评估致密化率和测量胚泡发育率。然后对胚泡进行差别染色和计数。结果示于表8。在G1中加入硫辛酸增加了内细胞团的细胞数和内细胞团占总细胞的百分比。表8第3第4天第4天处理n天上午%娱叫遊-《卜虽^第4天扩展％TEICM总数ICM%Gl(对照)5881.022.751.719.034±211.4±45土225%Gl+10nM5881.022.465.539.734±216±1头头50士231%LA明显与对照不同；根据Student'sT检验计算，*，PO.05;**，P<0.01实施例3-硫辛酸对小鼠胚胎发育的有效浓度范围使用CF1小鼠胚胎确立了硫辛酸增加胚泡发育和细胞数量的有效浓度范围。结果示于表9。该数据显示硫辛酸在5-40jiM之间对促进胚泡发育和增加细胞数量有效。在所述浓度以上，与对照相比，硫辛酸到第5天时导致较低胚泡发育以及较少细胞数目。表9.硫辛酸浓度对在20%氧气下培养的CF1小鼠受精卵发育的作用n第3天(致密第4天(总第5天(总第5天(孵总细胞化％)胚泡％)胚泡％)化％)数80.2±4.对照6634.3%50.0%75.0%34.4%95nM6238.9%51.6%81.8%40.9%90.2±4.21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例4-石危辛酸抗活性氧族的保护作用为了确定硫辛酸是否具有抗氧化作用，使用可与活性氧族(ROS)中间体反应的荧光染料2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DFFDA)进行了一系列实验。将200nM溶于DMSO中的H2DFFDA加入GMOPS-Plus(可从Vitrolife获得)。硫辛酸溶解在乙醇中并使培养基中的终浓度为0.1%EtOH。然后每滴用紫外线照射4个连续的2.5分钟以进行光氧化来生成ROS。图3显示了硫辛酸降低所述培养基中ROS生成的作用。所有结果都基于与溶剂组(0.95%EtOH)的比较，溶剂组与对照组相比无明显差异。全部浓度的硫辛酸都造成活性氧生成的浓度依赖性降低，从而表明硫辛酸具有抗氧化作用。实施例5-硫辛酸G培养基对人类胚胎发育的作用根据本发明，检测了含硫辛酸的培养基对人类胚胎发育的作用。将良好预后患者的胚胎的一半在不含硫辛酸的Gl培养基(即对照)中培养，而另一半在含10硫辛酸的Gl培养基(即，高硫辛酸培养基)中培养。所得数据与在小鼠模型中获得的数据一致。与对照相比，胚胎在高硫辛酸培养基中更快地发育至8细胞和胚泡期。对于此公开内容，除非特别指出，"一"或"一个"是指"一或多个"。本文引用的所有专利、申请、参考文献和出版物都以引用的方式全文并单独纳入本文中。尽管已经结合具体实施方案对本发明的原理进行了描述，但是应清楚地理解仅通过举例的方式作出这些描述而非意图限制本发明的范围。权利要求1.一种发育细胞培养基，包括(a)水；(b)无机盐；(c)至少一种能源；和(d)浓度为约5μM-约40μM的硫辛酸、硫辛酸衍生物或它们的组合。2.权利要求l的培养基，还包括一种或多种氨基酸。3.权利要求1或2的培养基，其中所述培养基支持干细胞、配子、受精卵或胚胎中的至少一种从一个发育阶段发育到另一个发育阶段。4.权利要求1或2的培养基，其中所述培养基支持胚胎的发育。5.权利要求1或2的培养基，其中所述培养基支持人类胚胎的发育。6.权利要求1或2的培养基，其中所述培养基支持配子的发育。7.权利要求1或2的培养基，其中所述培养基支持干细胞的发育。8.权利要求2的培养基，其中所述培养基中无机盐的浓度为约115mM-约140mM，所述培养基中能源的浓度为约5mM-约30mM，以及所述培养基中氨基酸的总浓度为约0.1mM-约15mM。8.权利要求1或2的培养基，还包括螯合剂、抗生素和透明质烷。9.权利要求1或2的培养基，还包括一种或多种选自生长因子、激素、抗生素和维生素的组分。10.权利要求1或2的培养基，还包括乙醇。11.权利要求1或2的培养基，含有浓度为约5nM-约20的硫辛酸。12.权利要求1或2的培养基，含有浓度为约5pM-约10的硫辛酸。13.权利要求1或2的培养基，含有浓度为约8^M-约12的硫辛酸。14.权利要求1或2的培养基，含有浓度为约10nM的石危辛酸。15.权利要求4的培养基，其中所述培养基支持胚胎发育至4细胞期。16.权利要求4的培养基，其中所述培养基支持胚胎发育至8细胞期。17.权利要求4的培养基，其中所述培养基支持胚胎发育至胚泡期。18.权利要求4的培养基，其中所述培养基支持胚胎从8细胞期发育至胚泡期。19.权利要求1或2的培养基，其中所述培养基是卵子成熟培养基、受精培养基、ICSI培养基、精子培养基或冻存培养基。20.—种用于培养发育细胞的方法，所述方法包括在权利要求1或2的培养基中培养干细胞、配子、受精卵或胚胎。21.权利要求20的方法，其中所述干细胞、配子、受精卵或胚胎是在有氧条件下培养。22.权利要求20的方法，其中所述干细胞、配子、受精卵或胚胎在低氧条件下培养。23.权利要求20的方法，其中所述培养干细胞、配子、受精卵或胚胎的步骤包括培养人类胚胎。24.权利要求20的方法，其中所述培养干细胞、配子、受精卵或胚胎的步骤包括培养胚胎至4细胞期。25.权利要求20的方法，其中所述培养干细胞、配子、受精卵或胚胎的步骤包括培养胚胎至8细胞期。26.权利要求20的方法，其中所述培养干细胞、配子、受精卵或胚胎的步骤包括培养胚胎至胚泡期。27.权利要求20的方法，其中所述培养干细胞、配子、受精卵或胚胎的步骤包括将胚胎从8细胞期培养至胚泡期。28.权利要求20的方法，其中所述培养干细胞、配子、受精卵或胚胎的步骤包括培养胚胎至第3天阶段。29.权利要求20的方法，其中所述培养干细胞、配子、受精卵或胚胎的步骤包括培养胚胎至第5天阶段。30.—种发育细胞培养基，包括(a)水；(b)无机盐；(c)至少一种能源；和(d)硫辛酸、疏辛酸衍生物或它们的组合，其中所述培养基支持哺乳动物胚胎发育至胚泡期，且其中所述培养基使第5天的胚泡总数与对照培养基相比至少增加10%,所述培养基与对照培养基的不同仅在于对照培养基不含》危辛酸和硫辛酸衍生物。31.权利要求30的培养基，还包括一种或多种氨基酸。32.权利要求30或31的培养基，其中所述哺乳动物胚胎为CF1小鼠胚胎。33.权利要求30或31的培养基，其中所述发育细胞培养基包括5pM-40HM的硫辛酸、>琉辛酸衍生物或它们的组合。34.—种培养胚胎的方法，所述方法包括在权利要求30或31的培养基中将胚胎培养至胚泡期。35.—种发育细胞培养基，包括(a)水；(b)无机盐；(c)至少一种能源；和(d)硫辛酸、硫辛酸衍生物或它们的组合；其中所述培养基支持哺乳动物胚胎发育至胚泡期，且其中所述培养基使第5天的胚泡的总细胞数与对照培养基相比至少增加10%,所述培养基与对照培养基的不同仅在于对照培养基不含硫辛酸和硫辛酸衍生物。36.权利要求35的培养基，还包括一种或多种氨基酸。37.权利要求35的培养基，其中所述哺乳动物胚胎为CF1小鼠胚胎。38.权利要求35的培养基，其中所述发育细胞培养基包括5的硫辛酸、硫辛酸衍生物或它们的组合。39.—种培养胚胎的方法，所述方法包括在权利要求35的培养基中将胚胎培养至胚泡期。40.—种发育细胞培养基，包括(a)水；(b)无;f几盐；(c)至少一种能源；和(e)硫辛酸、硫辛酸衍生物或它们的组合；其中所述培养基支持哺乳动物胚胎发育至胚泡期，且其中所述培养基使第5天的胚泡的内细胞团与对照培养基相比至少增加10%,所述培养基与对照培养基的不同仅在于对照培养基不含硫辛酸和硫辛酸衍生物。41.权利要求40的培养基，还包括一种或多种氨基酸。42.权利要求40的培养基，其中所述哺乳动物胚胎为CF1小鼠胚胎。43.权利要求40的培养基，其中所述发育细胞培养基包括5pM-40pM的硫辛酸、碌K辛酸衍生物或它们的组合。44.一种培养胚胎的方法，所述方法包括在权利要求40的培养基中将胚胎培养至胚泡期。专利摘要本发明提供了使用含有高浓度硫辛酸的培养基的用于体外受精的组合物和方法。更具体地，本发明提供含有浓度为5μM-40μM的硫辛酸的用于发育细胞的培养基。与对照培养基相比，包括浓度在所述指定范围内的硫辛酸的培养基能够使胚泡的存活率增加、细胞数量增加、内细胞团增加和/或内细胞团占总细胞团的百分比增加。文档编号A01N1/02GKCN101679944SQ200880014345公开日2010年3月24日申请日期2008年4月10日发明者D·K·格德勒,D·林克,M·G·拉蒙申请人:维特罗莱夫瑞典有限公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan