专利名称:活性羧肽酶b的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种活性羧肽酶B的制备方法。
背景技术：
羧肽酶B(carboxypeptidase B，简称CPB，)是一种含锌的胰外肽酶。CPB含307个氨基酸，分子质量35ku。由于CPB特异的水解肽链C端的碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸或鸟氨酸)，所以其可用于蛋白质和多肽的序列分析，特别是用来确定羧基端氨基酸。此外，目前CPB的主要商业用途是作为工业用酶应用于胰岛素的工业生产。
目前制备活性CPB的方法可分为三类，其一是，从动物的胰腺中提取及活化获得。该法的缺陷在于，由于所获得的CPB可能含有感染其它物质(如病毒或其它有害的生物活性组分)而限制了CPB的应用；其二是，经原或真核[如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)]表达得不具活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B，简称proCPB)，再将proCPB经胰蛋白酶酶解得到活性CPB(WO 0151624，DE 19915938和WO 9623064)。该法的不足在于，由于表达所得的proCPB须经胰蛋白酶“激活”才能获得活性CPB，且还须再经去除胰蛋白酶和活性肽部分的纯化步骤；其三是，在细菌或酵母中以融合蛋白形式表达(如β-办乳糖苷酶-proCPB融合蛋白形式表达)，但其仍须去除融合蛋白才能获得活性CPB。
鉴于此，如何避免为得到活性CPB而需先表达proCPB，然后经胰蛋白酶酶切激活proCPB，再去除胰蛋白酶和前肽等繁琐步骤是本发明需要解决的技术问题。
发明内容本发明目的在于，提供一种通过直接表达CPB来制备活性CPB的方法，以此克服现有技术中存在的步骤繁琐之缺陷。
本发明所说的活性羧肽酶B(CPB)的制备方法，其主要步骤为首先经上清表达或包涵体表达带CPB的DNA的重组菌株，然后经分离得到活性CPB，其特征在于，所述重组菌株的质粒为pT7-473-CPB，宿主为E coli BL21(DE3)(BL21(DE3)F-，ompT，HsdSB，(rB-，mB-)，dcm，gal，λ(DE3)购自invitrogen公司。
本发明所说的质粒(pT7-473-CPB)的构建在pT7-473(来源于pET-21a(invitrogen出品)，增加多克隆位点后命名，增加多克隆位点的方法(参照Molecular CloningA LaboratoryManual 2nded(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的多克隆位点NdeI和HindIII之间插入CPB的编码DNA片段，该质粒为T7启动子，含Lac调节元件，氨苄抗性。其结构如图2所示。
其中CPB的DNA片段来源于已构建的质粒pT7-473-proCPB，proCPB核苷酸序列来源于RT-PCR技术获得的大鼠胰腺proCPB RNA序列(Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters2003，10(6)1-10)。
图1.重组克隆质粒pMD-T-CPB鉴定的DNA电泳图，其中1-酶切前重组质粒T-CPB；2-HindIII单酶切；3-HindIII酶切后加入NdeI酶切2min；4-HindIII酶切后加入NdeI酶切5min；5-HindIII酶切后加入NdeI酶切10min；6-HindIII酶切后加入NdeI酶切8min；7-HindIII酶切后加入NdeI酶切30min；8-DNA分子量Marker(分子量标记在右侧，单位kb)。
图2重组克隆质粒pMD-T-CPB及重组表达质粒pT7-473-CPB的结构示意图，其中2a-重组克隆质粒pMD-T-CPB的结构示意图，2b-质粒TpT7-473-CPB的结构示意图。
图3为SDS-PAGE分析重组菌在不同温度下的诱导表达蛋白质情况其中M-蛋白质分子量Marker(分子量标记在图左侧)；1-20℃IPTG诱导培养菌体超声破碎离心后的沉淀；2-20℃IPTG诱导培养菌体超声破碎离心后的上清；3-20℃IPTG诱导前菌体超声前样品；4-20℃IPTG诱导后菌体超声前样品；5-15℃IPTG诱导培养菌体超声破碎离心后的沉淀；6-15℃IPTG诱导培养菌体超声破碎离心后的上清。
图4.SDS-PAGE分析37℃诱导表达CPB情况及包涵体洗涤前后CPB纯度其中M-蛋白质分子量Marker(分子量标记在图左侧)，1-IPTG诱导培养菌体超声破碎离心后的上清；2-IPTG诱导培养菌体超声破碎离心后的沉淀；3-包涵体用0.5％Triton-X100洗涤离心后上清；4-包涵体用0.5％Triton-X 100洗涤后沉淀。
具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步的阐述I质粒pT7-473-CPB的构建及重组菌株的制备(1)CPB基因来源于已构建好含有羧肽酶原B基因的质粒pT7-473-proCPB，该基因为通过RT-PCR的方法从Wistar大鼠的胰腺获得(参见Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters2003，10(6)1-10)。PCR扩增的CPB基因，以5’-GCG CAT ATG GCA ACG GGA CAC AGCTAC ACC AAG TAC-3’；3’-TTA ATA CAG GCT CTT CTA GAT ATA ATC ACT TTC AAGGGC-5’为引物，PCR扩增条件如下3’端引物 1μg5’端引物 1μg模板pT7-473-pCPB(10倍稀释后) 5μl10×buffer 5μl10mM dNTPs 1μl50mM MgSO42μlTaq聚合酶I 1.5u灭菌双蒸水ddH2O 加至50μl94℃×2min；92℃×1.5min，53℃×1.5min，72℃×1.5min，40循环；72℃×15min，反应完成后，4℃保存。PCR产物用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收930bp左右处的条带，连接入通用载体pMD-T(购自Takara公司)，转化感受态细胞E Coli DH5α80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rk-，mk+)，supE4，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169(购自invitrogen公司)，质粒小量抽提，测序，测序结果用BLAST程序与模板上proCPB DNA序列对照证实(参见Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters 2003，10(6)1-10)；(2)参见图1，限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切已鉴定的质粒pMD-T-CPB，电泳鉴定，回收940bp CPB双酶切片段，由于CPB基因内部含有一个NdeI的酶切位点，所以进行两步的限制性酶切，先用HindIII进行彻底酶切后，再用NdeI不同时间酶切，回收940bp的酶切片段，设计与同样酶切的pT7-473连接，转化感受态细胞E coli DH5α(购自invitrogen公司)，筛选阳性克隆，质粒小量抽提，NdeI和HindIII双酶切鉴定，得重组质粒pT7-473-CPB，其结构如图2所示。将质粒pT7-473-CPB转入宿主(E coli BL21(DE3)中即得带CPB的DNA的重组菌株(参照Molecular CloningA Laboratory Manual 2nded(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)。
II带CPB的DNA的重组菌株的上清表达及CPB的活性测定(1)组菌株(含有重组表达质粒pT7-473-CPB，宿主为E coli BL21(DE3))接种一级瓶，37℃摇床过夜培养，按照1％接种至二级瓶，37℃培养至OD600为0.3～0.7，0.1mmol/L～1mmol/L IPTG诱导，降温至12-20℃，继续培养3～5h后，收获菌体，离心弃上清，菌体沉淀用5～100mmol/L pH7.0-8.5的TE缓冲液悬浮，超声破碎菌体，离心，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE分析CPB在上清和不溶物形式的表达情况，结果参见图3；可见降温至培养温度可得到CPB的上清表达。
(2)上清表达的CPB活性测定直接测定上清中CPB的活性，活性为0.15u/ml，加入不同浓度的Zn2+，如0.1mmol/L～0.001mmol/L ZnCl2或ZnSO4可帮助CPB活性提高，可使CPB的活性提高10倍以上，比如20倍，达到0.2～2.6u/ml。
活性测定方法参照Folk(Folk et al，J.Biol.Chem.1960)的方法，以含0.1M NaCl的0.01mmol/L～1mmol/L马尿酰-L-赖氨酸(或马尿酰-L-精氨酸)为底物测定，25℃测定。活力定义为25℃时，每分钟催化水解1μmol马尿酰-L-精氨酸(或马尿酰-L-赖氨酸)底物，导致254nm处1cm路径长的光吸收增加0.12的酶量定义为一个酶活单位。
III带CPB的DNA的重组菌株的包涵体形式表达及其CPB的变性与复性(1)重组菌接种一级瓶，37℃摇床过夜培养，按照1％接种至二级瓶，37℃培养至OD6000.3～0.7，0.1mmol/L～1mmol/L IPTG诱导，37℃继续培养3～5h后，收获菌体，离心弃上清，菌体沉淀用5～100mmol/L pH7.0-8.5的TE缓冲液悬浮，超声破碎菌体，离心，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE分析表达情况。
(2)包涵体的洗涤与变性将大肠杆菌裂解后，离心，收集沉淀，经SDS-PAGE电泳鉴定表明沉淀为CPB的包涵体表达部分，将包涵体收集，用0.2％～2％ Triton-X 100悬浮，充分洗涤，离心，然后用不含的Triton-X 100的Tris-HCl缓冲液充分洗涤以彻底去除Triton-X100。将充分洗涤的包涵体离心收集后，用4mmol/L～8mmol/L尿素充分溶解，离心，取上清，即为变性CPB。
(3)包涵体的复性分别配制不同pH7.5～pH11的20mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl或甘氨酸-NaOH缓冲液，将CPB变性液缓慢加入，放置室温复性10h～24h测定活性，结果表明复性pH以pH9.0-pH10.5为最佳。
向复性缓冲液中添加不同比例的氧化还原对还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH∶GSSG比(摩尔比)分别为1∶10～10∶1，将CPB变性液缓慢加入，放置室温复性10h～24h测定活性，结果表明GSH∶GSSG的摩尔比为10∶1～2∶1的复性效果较好。
将CPB在室温条件下的复性液中放置24h～60h，无沉淀产生，也无活力下降现象。
本发明实现了通过直接表达CPB来制备活性CPB的目的，克服了现有技术中存在的步骤冗杂之缺陷。
下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围
实施例1从LB固体培养平板(LB培养液，加琼脂粉至浓度为1.5(wt％))上挑取重组单菌落于含100μg/ml氨苄的5ml LB液体培养液(1％(wt％)tryptone，0.5％(wt％)yeast extract，0.5％(wt％)NaCl，pH7.0)中，37℃，摇菌过夜；过夜菌按1％(v/v)接种于含250ml LB含100μg/ml氨苄抗性培养液中，37℃培养至OD600为0.5，0.5mmol/L IPTG诱导，降温至18℃，继续培养5h后，收获菌体，离心弃上清，菌体沉淀用5～100mmol/L pH8.0的TE缓冲液悬浮，超声破碎菌体，离心取上清，测定上清中的酶活性，活性为0.15u/ml，加入ZnCl2于上清中使其终浓度为0.01mmol/L，轻摇混匀，放置30min后，测定CPB的活性，为2.6u/ml。
上清上阴离子交换柱DEAE-FF(购自Pharmacia公司)，DEAE-FF事先用20mmol/LTris-HCl缓冲液(含有0.1mmol/L ZnCl2)，pH8.0平衡，样品上柱后，用20mmol/L Tris-HCl(含有0.1mmol/L ZnCl2)，pH8.0缓冲液平衡至基线，然后用含80mmol/L的NaCl的20mmol/LTris-HCl(含有0.1mmol/L ZnCl2)，pH8.0洗脱，分部收集，测各收集管的OD280nm及活性。合并含有CPB活性的收集管，即为纯化的CPB，活性检测为56u/mg蛋白。
实施例2从LB固体培养平板(LB培养液，加琼脂粉至浓度为1.5(wt％))上挑取重组单菌落于含100μg/ml氨苄5ml LB液体培养液(1％(wt％)tryptone，0.5％(wt％)yeast extract，0.5％(wt％)NaCl，pH7.0)中，37℃，摇菌过夜；过夜菌按1％(v/v)接种于含250ml LB含100μg/ml氨苄抗性培养液中，37℃培养至OD600为0.5，0.5mmol/L IPTG诱导，1mmol/L IPTG诱导，37℃继续培养3h后，收获菌体，离心弃上清，菌体沉淀用20mmol/L pH8.0的TE缓冲液悬浮，超声破碎菌体，离心，收集沉淀，经SDS-PAGE电泳鉴定表明沉淀为CPB的包涵体表达部分，将包涵体收集，用1％(v/v)Triton-X 100悬浮，充分洗涤，离心，然后用不含的Triton-X 100的Tris-HCl缓冲液充分洗涤以彻底去除Triton-X 100。将充分洗涤的包涵体离心收集后，用8mmol/L尿素充分溶解，离心，取上清，即为变性CPB。测定变性液中蛋白质浓度(Bradford方法，Bradford MM，Anal Biochem.1976，7(72)248-254))。将CPB变性液缓慢加入到pH10.0的20mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液中(含有1mmol/L还原型谷胱甘肽和0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L ZnCl2)，使复性液中的蛋白含量为100μg/ml，放置室温复性24h，测定复性液中CPB活性。CPB活性为1.5u/ml复性液。
权利要求
1.一种活性羧肽酶B(carboxypeptidase B)的制备方法，其主要步骤为首先经上清表达或包涵体表达带羧肽酶B的DNA的重组菌株，然后经分离得到活性羧肽酶B，其特征在于，所述重组菌株的质粒为pT7-473-CPB，宿主为E.coli BL21(DE3)。
2.如权利要求
1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的主要为将所说的重组菌株经上清表达和分离得到活性羧肽酶B，其中表达温度为12～20℃。
3.如权利要求
2所述的制备方法，其特征在于，在分离得的上清液中加入ZnCl2或ZnSO4，使Zn2+的浓度为0.001mmol/L～0.1mmol/L。
4.如权利要求
1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的主要为将所说的重组菌株经包涵体表达、变性、复性和分离得到活性羧肽酶B，其中表达温度为37℃。
5.如权利要求
4所述的制备方法，其特征在于，其中所说的变性是将经洗涤的包涵体表达物用4mmol/L～8mmol/L尿素充分溶解。
6.如权利要求
4所述的制备方法，其特征在于，其中复性所用的缓冲液为pH＝7.5～11的20mmol/L～100mmol/L的Tris-HCl或甘氨酸-NaOH缓冲液。
7.如权利要求
6所述的制备方法，其特征在于，其中pH＝9.0～10.5。
8.如权利要求
6或7所述的制备方法，其特征在于，其中在复性所用的缓冲液中加入还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比为(10～2)∶1。
专利摘要
本发明涉及一种活性羧肽酶B的制备方法，其主要步骤为首先经上清表达或包涵体表达带CPB的DNA的重组菌株，然后经分离得到活性CPB，其特征在于，所述重组菌株的质粒为pT7－473－CPB，宿主为E coli BL21(DE3)。本发明实现了通过直接表达CPB来制备活性CPB的目的，克服了现有技术中存在的步骤冗杂之缺陷。
文档编号C12N1/21GK1990861SQ200510112348
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月29日
发明者李素霞, 袁勤生 申请人:西藏金稞科技有限公司, 华东理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan