本发明涉及具有醇和/或醛脱氢酶活性的醇/醛脱氢酶(下文称为AADH或AADHs)的重组酶制品。本发明还涉及编码AADH的新的重组DNA分子，含有所说的DNA的重组表达载体，含有所说的重组DNA分子和/或所说的重组表达载体的重组生物。而且本发明还涉及生产重组AADH酶制品的方法以及经过利用所说的重组酶制品生产醛，羧酸和酮，特别是2-酮基-L-古洛糖酸(下文称为2KGA)的方法和经过利用所说的重组生物生产醛，羧酸和酮，特别是2KGA的方法。
2-KGA是生产L-抗坏血酸(维生素C)的重要中间体。已知许多微生物的D-山梨醇或L-山梨糖生产2KGA。日本专利公开号51-40154(1976)公开了用醋杆菌属，杆菌属或假单胞菌属微生物从D-山梨醇生产2KGA。根据ActaMicrobiologicaSinica21(2)，185-191(1981)。可用微生物的混合培养物，特别是沟槽假单胞菌(Pseudomonasstriacta)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)从L-山梨糖生产2KGA。欧洲专利公开号0221707公开了用含有和不含并存细菌的产糖酮假葡糖杆菌(Psecldogluconobactersaccharoketogenes)从L-山梨糖生产2KGA。欧洲专利公开号0278447公开了用由菌株DSMNO4025氧化葡糖杆菌和DSMNo.4026(一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)菌株)组成的混合培养物从L-山梨糖生产2KGA的方法。欧洲专利公开号88116156公开了用氧化葡糖杆菌DSMNo.4025从L-山梨糖生产2KGA的方法。
从氧化葡糖杆菌DSMNo.4025纯化出了AADH并鉴定为催化醇和醛的氧化，并能由此从醇产生相应的醛和酮，由醛产生羧酸(见欧洲专利公开号606621)。更具体地说，AADH催化L-山梨糖经L-山梨糖醛酮氧化成2KGA。AADH的纯化样品的物理化学特性如下：
a)最适pH：大约7.0-9.0。
b)最适温度：大约20℃-40℃
c)分子量：135,000+/-5,000道尔顿(由2个亚基组成，该α-亚基和β-亚基以任意方式组合，各具有的分子量分别为64,500+/-2,000和62,500+/-2000)。
d)底物特异性，作用于包括L-山梨糖，L-山梨糖醛酮，D-山梨醇，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-果糖，DL-甘油醛，乙醇，1-丙醇，1-丁醇，1-戊醇，1-己醇，1-庚醇，2-丙醇，2-丁醇，丙醛，PEG1000，PEG2000，PEG4000，PEG6000和聚乙烯醇的伯和仲醇和醛上。
e)辅基：吡咯喹啉醌
f)等电点：大约4.4
一旦克隆出编码所说的AADH的基因，它们可用于构建能产生大量AADH的重组酶制品或各种醛酮和羧酸，特别是2KGA的重组生物。然而，至今尚未报道该基因的克隆。
因而本发明涉及具有醇和/或醛脱氢酶活性的AADH的新的重组酶制品。本发明包含的是编码AADH的新的重组分子；含有所说DNA的重组表达载体；携带所说DNA和/或重组表达载体的重组生物；生产重组AADH的方法，利用重组AADH重组生物生产醛，羧酸和酮特别是2KGA的方法。
更具体地说，本发明的一个方面涉及具有醇和/或醛脱氢酶活性的重组酶制品，它包含一种或多种酶活性多肽，该多肽选自由SEQIDNo5，SEQIDNO6，SEQIDNO7和SEQIDNO8鉴定的多肽，由SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7和SEQIDNO8鉴定的多肽和含有一个或多个氨基酸残基的添加，插入，缺失和/或取代的上面鉴定的多肽的功能性衍生物之间嵌合重组酶，其中所说的酶活性多肽具有醇和/或醛脱氢酶活性。
该功能性衍生物的制备可用本领域已知的化学肽合成或以本文公开的DNA序列为基础用本领域目前已知和由诸如Sambrook(分子克隆，冷泉港实验室出版社，美国纽约，第二版1989)公开的方法经重组方式来进行。一般不改变该分子活性的蛋白质和肽的氨基酸交换在本领域目前是已知的且由诸如H.Neurath和R.L.Hill在“蛋白质”(学院出版社，纽约，1979，特别是见图6，第14页)中描述。最通常发生的交换是：Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly以及这些的逆向交换。
本发明的另一方面涉及编码至少一个酶活性多肽的重组DNA分子，该多肽选自由SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7和SEQIDNO8鉴定的多肽和由SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7和SEQIDNO8鉴定的多肽与含有一个或多个氨基酸残基的添加，缺失和/或取代的上面鉴定的多肽的功能衍生物之间的嵌合重组酶，其中所说的酶活性多肽具有所说的醇和/或醛脱氢酶活性。
另外，本发明涉及编码具有醇和/或醛脱氢酶活性的多肽的DNA序列，例如在序列表中所公开的DNA序列以及其互补链，或包括这些序列的那些序列，在标准条件下与该序列或其片段杂交的DNA序列，由于遗传密码的简单性，在标准条件下不分该序列杂交但编码具有完全相同的氨基酸序列的DNA序列。
杂交的“标准条件”在本文中指本领域的技术人员一般用于检测特异性杂交信号的条件，它在例如Sambrook等，“分子克隆”，第二版，冷泉港实验室出版社1989，纽约中描述，或优选所谓的严格杂交和非严格洗涤条件或更优选所谓的严格杂交和严格洗涤条件，本领域的技术人员对这些是熟悉的且在例如Sambrook等(出处同上)中描述。另外，用本领域已知的方法使用根据本文公开的DNA序列设计的引物以聚合酶链式反应可制备的DNA序列也是本发明的一个目的。应明白本发明的DNA序列也可按例如EP747483所述经合成来制备。
本发明的其它方面包括携带一种或多种上面限定的重组DNA分子的重组表面载体和携带上面限定的重组表达载体和/或在染色体上携带一种或多种重组DNA分子的重组生物。
本发明的另一方面包括生产具有如上面所定义的醇和/或醛脱氢酶活性的重组酶制品的方法，它包括在合适的培养基中培养上面限定的重组生物且回收所说的重组酶制品。
本发明的另一方面包括从相应的底物生产醛、酮或羧酸产物的方法，包括经过使用上面限定的重组生物将所说的底物转变成产物。
本发明还有另一方面涉及生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，包括在含有L-山梨糖和/或D-山梨醇的合适的培养基中发酵上面限定的重组生物。
本发明的另一方面涉及从相应的底物生产醛，酮或羧酸产物的方法，包含培养含有本发明的重组酶制品的反应混合物。
本发明还有另一方面涉及生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，包含培养含有上面限定的重组酶制品和L-山梨糖和/或D-山梨醇的反应混合物。
本发明还有一个目的是提供从2-酮基-L-古洛糖酸生产维生素C的方法，其特征在于实现按上面所述的生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法并将该方法获得的2-酮基-L-古洛糖酸用本领域已知的方法转化成维生素C(L-抗坏血酸)。
在更详细地描述本发明前，提供附图的简短解释。
图1是分别携带编码本发明的重组酶A或B的重组DNA分子的重组表达载体的结构示意图。
图2是分别携带编码本发明的嵌合酶的重组DNA分子的重组表达载体的结构示意图。
图3是用于经同源重组方法构建嵌合体的分别携带含有酶A和酶B串联结构基因的重组DNA分子的母体质粒的结构示意图。
图4显示了使用优选的密码子选择分别编码嵌合体酶SA2，SA21，酶SA22或酶SB的重组表达载体，其中酶SA2具有“酶ANo.1-135部分，酶BNo.136-180部分和酶ANo.180-556部分”的结构，酶SA21具有“酶ANo.1-128部分，酶BNo.129-180部分和酶ANo.180-556部分”的结构，酶SA22具有“酶ANo.1-125部分，酶BNo.126-180部分和酶ANo.180-556部分”的结构，酶SB具有“酶ANo.1-95部分，酶BNo.96-180部分和酶ANo.180-556部分”的结构。这些数字是成熟酶氨基酸序列的氨基酸残基数。
图5显示了成熟酶A和酶B氨基酸序列的序列对比。
图6显示了编码本发明的嵌合酶的重组基因的构建方案。
图7显示了酶A和B基因的限制性图谱。
图8显示了经过在两个基因保守核苷酸序列上进行两个AADH基因的体内同源重组来构建嵌合基因。
图9显示了定点诱变以在酶B基因上游引入BamHI位点。
图10显示了酶B基因的启动子取代方案。
图11显示了本发明的嵌合酶的底物特异性。
本发明的AADH基因编码如上所述的能催化各种醇和醛氧化的AADH酶。具体地说克隆并表达了存在于葡糖杆菌属中的AADH的特定基因。除了葡糖杆菌属外作为选择来源可由本领域的技术人员使用本发明的教导从其它生物中发现。
一个具体的并优选的氧化葡糖杆菌菌株以DSMNo.4025保存于DeutscheSammlungVonMikroorganismeninGottingen(德国)。
而且，该菌株的一个传代培养物也以保藏号FERMBP-3812保藏于日本发酵研究所的工业科学和技术机构。欧洲专利公开号0278477公开了该菌株的特征。
本发明使用的AADH基因和重组微生物可用下列步骤获得：
(1)经过菌落或噬斑杂交，PCR克隆，蛋白质印迹分析，DNA印迹杂交等等从染色体DNA克隆AADH基因。
(2)以通常的方法测定该AADH基因的核苷酸序列并构建仅有且高效表达AADH基因的重组表达载体。
(3)经过转化，转导，转接和电穿孔构建携带位于重组表达载体或染色体上的重组AADH基因的重组微生物。
可用于本发明的上述方面的材料和技术在下面进行举例性地详细描述：
用本领域熟知的方法可纯化总染色体DNA(MarmurJ.，分子生物学杂志，3：208，1961)。然后用染色体DNA和下面详细描述的载体可构建该基因的菌株基因组文库。用下列方法可在总染色体DNA的质粒或噬菌体载体中克隆出编码AADH的基因：
(i)测定纯化酶的部分氨基酸序列，根据序列信息合成寡核苷酸，经DNA印迹杂交，菌落杂交，或噬斑杂交从基因文库中选择目标基因；
(ii)经过以上面所述合成的寡核苷酸作引物经聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因的部分序列，用PCR产物作探针，经DNA印迹杂交，菌落杂交或噬斑杂交从基因文库选择目的基因的完整序列；
(iii)用诸如以前在(例如)酶学方法，Vol.73，p46，1981中描述的方法制备与所需酶蛋白质反应的抗体，并用包括蛋白质印迹分析的免疫学分析选择表达所需多肽的克隆；
(iv)将同系物的氨基酸序列与这一个所需酶进行对比，选择完全保守的氨基酸序列，合成编码该保守序列的寡核苷酸，用上述寡核苷酸作引物经PCR扩增所需基因的部分序列，并按上面(ii)所述选择完整的序列。
用熟知的方法，如使用M13噬菌体的双脱氧链终止法(SangerF.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467，1977)可测定所需基因的核苷酸序列。
经过使用如此测定的核苷酸序列的信息(考虑密码子的选择)，可用根据所说核苷酸序列推导的氨基酸序列合成的探针经过菌落杂交或蛋白质杂交或经过用根据所述信息合成的引物进行聚合酶链式反应从不同生物中分离出编码进化上变异的醇和/或醛脱氢酶的基因，如果需要的话。
为了有效表达所需基因或一般来说所需的本发明的DNA序列，可使用各种启动子，例如，所说基因的原始启动子，抗生素抗性基因，如Tn5的卡那霉素抗性基因(Berg.D.E.和C.M.Berg.1983，生物/技术1：417-435)，pBR322的氨苄青霉素抗性基因的启动子，大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的启动子(lac)，trp-，tac-，trc-启动，λ噬菌体启动子和能在宿主中发挥功能的任意启动子，这些宿主由包括诸如大肠杆菌，恶臭假单胞菌(P.putida)，木质醋杆菌(Acetobacterxylinum)，巴斯德氏醋杆菌(A.pasteurianus)，醋酸化醋杆菌(A.aceti).A.hansenii和氧化葡糖杆菌的细菌的微生物，哺乳动物和植物细胞组成。
另外其它的调节元件，如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主细胞中有效的天然和合成序列)和在将要将入编码序列的宿主细胞中有效的转录终止子(反向重复结构，包括在宿主细胞中有效的任何天然和合成的序列)可与上面所述的启动子一起使用。
为了表达固质多肽(AADH)，通常含有总体疏水的15至50个氨基酸残基的信号肽是必需的。编码信号肽的DNA可选自在宿主细胞中有效的任意天然或合成序列。
多种宿主/克隆载体组合可用于克隆双链DNA。克隆载体一般是一种质粒或噬菌体，它含有复制起点，调节元件，包括多克隆位点的克隆位点和选择标记；如抗生素抗性基因，包括氨苄青霉素，四环素，卡那霉素，链霉素，庆大霉素，壮观霉素等的抗性基因。
用于在大肠杆菌中表达本发明的DNA序列的优选的载体选自任意常用于大肠杆菌的载体，如pBR322或其衍生物，包括pUC18和pBluescriptII.pAYC177和pACYC184(细菌学杂志，134：1141-1156，1978)及其衍生物，来自广宿主范围质粒的载体，如RK2和RSF1010。在包括氧化葡糖杆菌DSMNo.4025和恶臭假单胞菌的葡糖杆菌属中表达本发明的DNA序列的优选的载体选自在葡糖杆菌属和/或恶臭假单胞菌以及诸如大肠杆菌的优选的克隆生物中能复制的任意载体。优选的载体是广宿主范围载体，如象pVK102的粘粒载体和其衍生物，及RSF1010和其衍生物，含有一个在葡糖杆菌属中有功能的复制起点及在大肠杆菌中有功能的另一起点的载体。应仔细考虑载体的拷贝数和稳定性，以便稳定并有效地表达克隆的基因，也便于有效培养携带克隆基因的宿主细胞。含有诸如Tn5的转座因子的DNA分子也可用作载体以便将本发明的DNA序列导入优选的宿主。特别是染色体上。含有从优选的宿主中分离的任意DNA以及本发明的所需DNA序列的DNA分子也可用于将本发明的所需DNA序列导入优选的宿主中，特别是染色体上。经过转化，转导，转接或电穿孔可将该DNA分子转移进优选的宿主中。
有用的宿主可包括微生物、哺乳动物细胞，和植物细胞等。关于优选的微生物，可提及的有细菌，如大肠杆菌，恶臭假单胞菌，木质醋杆菌，巴斯德氏醋杆菌，醋酸化醋杆菌，A.hansensi，氧化葡糖杆菌和能产生重组AADH的任何革兰氏阴性细菌。所说微生物的功能性等价物，传代培养物，突变体和变异体也可用于本发明。优选的菌株是大肠杆菌K12和其衍生物，恶臭假单胞菌或氧化葡糖杆菌DSMNo.4025。
编码功能性AADH的本发明的DNA序列使用本领域熟知的方法连接到含有在上面所述的宿主细胞中有效的诸如启动子和核糖体结合位点的调节区的合适载体上以产生表达质粒。该重组表达载体的结构具体在图1，2，4和10中显示。
为了构建携带重组表达载体的重组微生物，可使用包括转化，转导，接合交配(普通和分子细菌学方法，第14和15章，PhilippGerbardt等编辑，美国微生物学会，(1994))和电穿孔的各种基因转移方法。构建重组生物的方法可选自分子生物学领域熟知的方法。通常的转化系统可用于大肠杆菌，假单胞菌属和醋杆菌属。转导系统也可用于大肠杆菌。接合交配系统可广泛用于包括大肠杆菌，恶臭假单胞菌和氧化葡糖杆菌的革兰氏阳性和革半氏阴性细菌。优选的接合交配方法在WO89/06688中描述。接合可在液体培养基中或在固体表面发生。优选的受体选自能用合适的重组表达载体产生活性AADH的大肠杆菌，恶臭假单胞菌和氧化葡糖杆菌。用于2KGA生产的优选的受体是氧化葡糖杆菌DSMNo.4025。对用于接合交配的受体，通常加入选择标记，例如，通常选择抗萘啶酮酸或利福平的抗性。
由本发明提供的AADH催化醇和/或醛的氧化并由此能从相应的底物产生醛，酮或羧酸。更具体地说，由本发明提供的AADH能催化L-山梨糖经L-山梨糖醛酮氧化成2KGA和/或D-山梨醇氧化成L-山梨糖，更具体地说，由本发明提供的AADH含酶A，酶A’，酶A”和酶B，它们分别具有SEQIDNo.5，6，7和8所示的氨基酸序列。
酶A，A’，A”和B基因分别具有SEQIDNo.1，2，3和4中所示的核苷酸序列，且编码具有SEQIDN.5，6，7和8分别所示的氨基酸序列的多肽，可从氧化葡糖杆菌菌株DSMNo.4025中产生。
由本发明提供的包括酶A，A’，A”和B的AADH可经过培养合适的生物，破碎细胞并从破碎的细胞的无细胞提取物，优选从微生物的可溶性部分分离和纯化它们来单独制备。
本发明提供的重组生物可在需氧条件下在补充了合适营养成份的含水培养基中培养。培养可在大约4.0和9.0之间的pH，优选在大约6.0和8.0之间的pH下进行。尽管培养时间根据pH、温度和使用的营养培养基而变化，但通常2到5天可产生较好的结果。进行培养的优选的温度范围是从大约13℃到45℃，优选从大约18℃到42℃。
通常需要培养基含诸如可固化的碳源，可消化的氮源和无机物，维生素，微量元素和其它生长促进因子的营养成份。至于可同化的碳源，可使用甘油，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-果糖，D-阿拉伯糖醇，D-山梨醇，L-山梨糖等等。
各种有机或无机物也可用作氮源，如酵母提取物，肉提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浆，尿素，氨基酸，硝酸盐，铵盐，等。至于元机物，可使用硫酸镁，磷酸钾，氯化亚铁和氯化铁，碳酸钙等。
下面概述了具体来自恶臭假单胞菌的纯化的重组AADH酶的特性和生产方法。
(1)酶活性
本发明的AADH在电子受体存在下按照下列反应催化包括D-山梨醇，L-山梨糖，和L-山梨糖醛酮的醇和醛氧化。
醇+电子受体→醛+还原的电子受体
醇+电子受体→酮+还原的电子受体
醛+电子受体→羧酸+还原的受体
糖醇+电子受体→醛糖+还原的电子受体
糖醇+电子受体→酮糖+还原的电子受体
醛酮糖+电子受体→酮基羧酸+还原的电子受体
羧酸+电子受体→酮基羧酸+还原的电子受体
该酶不利用分子氧化受体。至于受体，可使用2，6-二氯酚靛酚(DCIP)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)，Wurster’s蓝，铁氰化物，辅酶Q或细胞色素C。
一单位的酶活性定义为每分钟催化1μmol的DCIP还原所用的酶量。取pH8.0时DCIP的消光系数为15mM-1。标准反应混合物(1.0ml)含0.1mMDCIP，1mMPMS，2至125mM底物，50mMTris-苹果酸-NaOH缓冲液(pH8.0)和10μl酶溶液。对照杯含除底物外所有的上面的成份。
(2)AADH的特性
a)底物特异性和酶反应产物
使用8种底物：正丙醇，异丙醇，D-葡萄糖，D-山梨醇，L-山梨糖醛酮，D-甘露醇，L-山梨糖和D-果糖按上面所述以其底物特异性鉴定酶A，A’，A”和B。结果在表1中表示。
表1。酶A，A’，A”和B的底物特异性
(单位/mg纯化的蛋白)底物酶A酶A’*酶A”酶B50mM正-丙醇139.6180.7262.340.050mM异丙醇76.8108.9154.972.350mMD-葡萄糖2.40.017.8943.9125mMD-山梨醇14.07.830.1130.92mML-山梨糖醛酮23.155.026.573.650mMD-甘露醇7.11.36.2517.4125mML-山梨糖47.41.630.38.4125mMD-果糖30.72.917.32.1
*酶A’的值以1.5倍来校正，因为酶的纯度为大约65％。
酶B显示出对D-葡萄糖或D-甘露醇的高活性，但对正丙醇和异丙醇的活性相当低。酶A，酶A’和酶A”显示出对正丙醇和异丙醇的高活性，但对D-葡萄糖和D-甘露糖的活性低；除了酶A’对L-山梨糖或D-果糖活性极低外，这些酶显示出相似的底物特异性模式。
用含可靠化合物的薄层色谱(TLC)和/或高效液相色谱(HPLC)分析与酶A，酶A’，酶A”或酶B反应从底物形成的产物。酶A，酶A’和酶A”(命名为A组)将D-山梨醇，L-山梨糖，L-山梨糖醛酮，D-甘露醇，和D-果糖分别转变成D-葡萄糖与L-葡萄糖；L-山梨糖醛酮与2KGA，2KGA，D-甘露糖和2-酮基-D-葡萄糖酸(2KD)。酶B(命名为B组)将D-葡萄糖，D-山梨醇，L-山梨糖醛酮，D-甘露醇，L-艾杜糖，甘油，D-葡萄糖酸，D-甘露糖酸分别转变成D-葡糖酸盐，L-山梨糖，2KGA，D-果糖，L-艾杜糖酸，二羟丙酮，5-酮基-D-葡萄糖酸，和5-酮基-D-甘露糖酸。与对L-山梨糖醛酮的反应性相类似，以所有上面所述的AADH可将D-葡糖醛酮转变成2KD；实际上A组酶从D-果糖产生2KD。D-果糖可能的直接产物是D-葡糖醛酮。所有的酶对醇，包括诸如D-山梨醇和D-甘露醇的糖醇，以及醛，包括诸如D-葡萄糖的醛糖和诸如L-山梨糖醛酮的酮糖显示出活性。
b)最适pH
所有的酶在pH8.0-8.5具有其最适点，如表2所示。与酶A和A’相比，酶A”和B向更低的pH具有相当宽的pH范围。
表2酶的最适pH
(相对活性％)pH酶A酶A’酶A”酶B6.06.52.135.021.06.513.09.357.351.67.033.122.574.861.67.557.746.890.075.38.0100.0100.0100.0100.08.5113.2142.785.662.29.050.02.146.58.09.519.61.823.90.0
c)pH稳定性
酶A，A’，A”和B在各种pH值的缓冲液中25℃保温3小时，测定残余活性并以对在pH8下未保温所获得的相对值来表达。酶A，A’，A”和B在pH6至9之间稳定，如表3所示。
表3酶的pH稳定性
(相对活性，％)pH酶A酶A’酶A”酶B4.05.40.06.225.25.032.010.077.956.16.074.782.7105.8100.97.076.996.9100.9101.98.080.1100.099.0114.09.060.197.3100.9101.910.053.285.4104.085.511.031.061.379.270.1
d)热稳定性
在4，20，30，40，50和60℃处理酶5分钟后的残余活性在表4中显示。
表4，酶的热稳定性
(相对活性，％)温度酶A酶A’酶A”酶B4℃100.0100.0100.0100.020℃91.5100.896.097.230℃78.0103.686.195.440℃19.978.972.884.650℃4.10.626.629.260℃2.90.013.30.0
e)金属离子和抑制剂的影响
用各种金属和抑制剂处理酶后残余的活性在表5中显示。MgCl2和CaCl2对酶几乎无影响，而其它金属离子，特别是CuCl2明显影响其活性。EGTA和EDTA明显抑制酶A，A’和A”。然而酶B比A组酶受EDTA和EGTA的抑制要小。
表5，金属和抑制剂对酶A，A’，A”和B活性的影响
(相对残余活性)化合物酶AA’A”B
底物L-山梨糖正丙醇L-山梨糖D-山梨醇5mMCoCl216.67.946.923.65mMCuCl20.00.00.00.05mMZnCl21.56.119.20.05mMMgCl296.385.378.8100.05mMCaCl298.895.3123.0102.95mMMnCl20.045.70.00.05mMFeCl216.60.00.05.95mMFeCl37.80.044.70.05mMNiSO442.759.790.379.410mMEDTA43.155.152.69看.310mMEGTA20.416.756.474.01mMNaF98.297.194.9100.82mMNEM91.797.294.9100.81mM97.278.395.3100.2ICH2COONa0.5mM盐酸羟胺104.698.897.2102.1
f)分子量和亚基
从恶臭假单胞菌转接体纯化的酶A，A’，A”和B经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测量为由分别具有大约64,000,62,500，62,500和60,000的分子量的一类单位组成。当酶A，A’，A”和B基因/DNA序列在相同宿主中表达时，它们可以是由酶A，A’，A”和B的任意2个单位组成的杂二聚体。
g)N-端氨基酸序列
成熟酶A和B的N端序列是
酶A：Gln-Val-Thr-Pro-Val-Thr-
酶A”：封闭的N端残基
酶B：Gln-Val-Thr-Pro-Ile-Thr-Asp-Glu-Leu-Leu-Ala……。
由于样品的纯度不够，未测定成熟酶A’的N端。
(3)AADH的生产：
经离心或过滤从发酵培养基收获细胞。将细胞悬浮于缓冲液中并借助于匀浆器，声处理器或用溶菌酶处理等破碎以产生细胞的破碎溶液。
用通常的蛋白质纯化方法，如硫酸铵沉淀、透析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和亲和色谱从破碎细胞的无细胞提取物，优选从微生物的可溶性部分分离和纯化AADH。
(4)酶反应
在电子受体，例如DCIP，PMS，Wurster蓝，铁氰化物，辅酶Q，细胞色素C等存在的条件下在诸如Trio-HCl缓冲液，磷酸缓冲液等的缓冲液中在从大约6.0到大约9.0的pH值下在大约10℃到大约50℃，优选20℃到40℃的温度下进行酶反应。反应混合物中底物的浓度可根据其它反应条件而变化，一般来说，需要大约1-200g/l，最优选从1-100g/l。
在酶反应中，AADH也可用合适的载体以固定状态使用。可使用对本领域普遍已知的固定酶的任意方法。例如，酶可直接结合于具有功能团的树脂的膜颗粒或类似物上，或可通过具有官能团的桥连化合物，如戊二醛结合于树脂上。
本发明提供的多肽也包括从酶A，酶A”，酶A”，和酶B组成的AADH基因制备的衍生物和从由于遗传密码的简并性产生的基因同源物或与AADH基因明显同源的天然，合成或重组来源的任何序列制备的相关物。该衍生物可以是以SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7和SEQIDNO8鉴定的多肽的功能性突变体，它含有一个或多个氨基酸残基的添加，缺失和/或取代，其中所说的酶活性多肽具有醇和/或醛脱氢酶活性。经过用诸如紫外照射，X-射线照射，Y-射线照射的诱变剂处理AADH基因或与硝酸，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或其它合适的诱变剂接触或分离经过自发突变或以本领域已知的体外诱变的标准方法产生的克隆可制备突变基因。
AADH多肽的衍生物也包括以SEQIDNO5，SEQIDNO6，SEQIDNO7和SEQIDNO8鉴定的多肽之间的嵌合重组酶。经过用限制性酶和T4连接酶在两个序列的保守限制性位点体外组合本发明的DNA序列的2个或多个部分(如图6所示)或经过在两个基因的保守核苷酸序列上体内重组两个AADH基因(如图8所示)可制备嵌合体。
AADH多肽的衍生物也包括在AADH多肽的N端，C端和/或内部区域具有添加多肽的多肽。与氧化葡糖杆菌DSM4025的细胞色素C多肽(17-18KDa)在(端融合的)酶B，酶A/B25，和酶A/B3显示出的AADH活性比得上在将D-山梨醇转化成L-山梨糖时实施例4中所述的酶B，在将L-山梨糖转化为2KGA时实施例14中所述的酶A/B25和酶A/B3。因此，可将相当长的多肽加入到或插入由本发明提供的AADH中而保留AADH活性。
上面所述的AADH多肽的衍生物很可能显示出优选的特征，如所需的底物特异性，对底物的更高的亲和力，对抑制化合物的更低的亲和力，对温度和/或pH的更高的稳定性和更高的催化速率。正如下面所做的实施例中所述，这些衍生物将提高所需产品的生产力。
本发明的酶活性多肽通常以二聚体的形式产生。该二聚体含有酶A，A’，A”或B的均二聚体，或包括嵌合物的衍生物，以及由上面所述的两个不同酶活性多肽组成的杂二聚体。因此，本发明的重组酶制品也含有一个或多个所说的均二聚体和/或杂二聚体。
由本发明提供的重组生物对于生产具有醇和/或醛脱氢酶活性的AADH的重组酶制品非常有用。所说的生物对于经过利用所说的重组酶制品，和经过利用所说的重组生物生产醛，羧酸和酮，特别是2KGA是有用的。
用所说的重组生物生产2KGA可在上面所述的培养基和培养条件下经发酵来进行。用上面所述的重组生物与诸如大肠杆菌，恶臭假单胞菌和巨大芽孢杆菌的并存在物可进行2KGA的生产。
实施例
实施例1.AADH基因的克隆
(1)氧化葡糖杆菌DSMNo.4025的基因组文库的构建
按下面制备染色体DNA。在含20ml由5.0％D-甘露醇，0.25％MgSO4·7H2O，1.75％玉米浆，5.0％面包酵母(OrientalYeastCo.，Osaka，Japan)，0.5％CaCO3，0.5％尿素(分别灭菌)和2.0％琼脂(灭菌前为pH7.0)组成的NS2培养基的琼脂板上27℃培养氧化葡糖杆菌DSMNo.40253天。以琼脂板收集细胞，用10ml含1mMEDTA的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)洗涤，重悬于5ml含20mMEDTA的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中。用终浓度为400μg/ml的溶菌酶(Sigma化学公司，st.Louis，Mo.USA)37℃处理细菌悬液30分钟，然后用链霉蛋白酶(400单位)37℃处理30分钟，并用1％SDS37℃处理1小时。根据Maniatis等(分子克隆：实验手册。冷泉港实验室，冷泉港，纽约，(1982))描述的方法用酚和RNA酶A(BoheringerManwheim，GmbH，Mannheim，德国)处理染色体DNA。用168单位的SalI(BoehringerMannheim)37℃消化染色体DNA(200μg)5至90分钟。所得的15-35Kb的部分消化的片段用制备琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖：0.7％)分离；切下含所需片段的凝胶块，将DNA从凝胶上电洗脱进由40mMTris-乙酸和2mMEDTA组成的TAE缓冲液中。因此，获得40μg的DNA。在平行实验中，用SalI完全消化8μg的粘粒载体pVK102(ATCC3758)并根据供应商的建议用小牛肠碱性磷酸酶(BoehringerMannheim)处理。用连接试剂盆(TakaraShuzoco.Ltd.，Kyoto，日本)将pVK102(0.4μg)与13-35KbSalI片段(0.2-2μg)在26℃连接10分钟。然后根据供应商(Amersham)描述的方法将连接的DNA用于体外包装：将连接的DNA与噬菌体外壳蛋白部分混合。所得的噬菌体颗粒用于感染大肠杆菌ED8767(Murray，N.E.，IV.J.Brammar和K.Murray分子基因遗传学，150：53-61，1977)。获得了大约3,000KmrTcs菌落，所有的试验菌落(24个菌落)具有插入的DNA；其平均大小为26.5Kb。含55,000克隆的氧化葡糖杆菌DSMNo.4025的另一粘粒文库使用以EcoRI部分消化的氧化葡糖杆菌DSMNo.4025的染色体DNA并以几乎与上面所述相同的方法将其插入pVK100的EcoRI位点来构建。所有的试验菌落(24个菌落)具有插入的DNA(平均大小；27Kb)。
经过使用从大肠杆菌ED8767文库提取的重组质粒DNA的混合物将大肠杆菌ED8767中的这两个粘粒文库转移进大肠杆菌S17-1(Tra+，生物/技术，1：784-791，1983)。挑出大肠杆菌S17-1的大约4,000个Kmr转化子，分别在含100μl由10g/lBactotrypton(Difco)，5g/l酵母提取物(Difco)和5g/lNaCl并补充有50μg/ml卡那霉素组成的LB的的微滴度平板中37℃培养并用15％甘油在-80℃贮存作为大肠杆菌S17-1的粘粒文库。
在大肠杆菌S17-1中构建氧化葡糖杆菌DSMNo.4025-SalI和EcoRI粘粒文库。从该文库中经接合交配将1,400个克隆分别从大肠杆菌S17-1转移进恶臭假单胞菌ATCC21812中。复苏在-80℃的微量滴定平板中贮存的1,400个培养物并用平板转移筒(Nunc)转移进在每孔中含100μl新鲜LB培养基的微量滴定平板中并37℃培养过夜。将萘啶酮酸抗性(Nalr)的恶臭假单胞菌ATCC21812在30℃下在100ml由2.5％甘露醇，0.5％酵母提取物(Difco实验室，Detroit，Mich)和0.3％Bactotryptone(Difco)组成的MB培养基中培养过夜。将50μl恶臭假单胞菌培养物分别加入含粘粒文库培养物的1,400个孔中。将1,400个细胞混合物用平板转移筒点样到放于由5％果糖，1％酵母提取物(Difco)，1％多肽胨(DaigoEiyo日本)和1.8％琼脂组成的FB琼脂培养基表面的硝化纤维素滤膜上并27℃培养过夜。萘啶酮酸用于转接体对供体大肠杆菌的反选择。生长于滤膜上的细胞分别划线到含50μg/ml萘啶酮酸和50μg/ml卡那霉素的MB琼脂培养基(下文称为MNK琼脂板)±并在27℃培养4天以选择转接体。经过接上面所述在MNK琼脂平板上划线纯化所得的菌落。由此制备恶臭假单胞菌的1,400个转接体〔恶臭假单胞菌中的氧化葡糖杆菌DSMNo.4025的基因文库〕。
(2)氧化葡糖杆菌DSMNo.4025的AADH基因克隆的免疫学筛选
首先，在含5mlMNK培养基的试管中分别培养在MNK琼脂板上维持的350个转接体(175个来自SalI文库，175个来自EcoRI文库)。从1.5ml各培养基中收集细胞并按如下处理以进行蛋白质印迹分析。将细胞悬浮于50μl由62.5mMTris-HCl，pH6.8，10％甘油，5％巯基乙醇和2％SDS组成的Laemmli缓冲液中。将细胞悬液煮沸3分钟，将10μl细胞溶胞产物上样到SDS-PAGE上。然后经过在40V，200mA下在含20％甲醇的12.5mMTris-19.2mM甘氨酸缓冲液pH8.6中操作电印迹装置(MarysolIndustrialCo.，Ltd.)16小时将所得的蛋白质带电印迹到硝化纤维素滤膜上。然后将滤膜在3％明胶上在由20mMTris，pH7.5和500mMNaCl组成的TBS缓冲液中培养1小时。在由20mMTris，pH7.5，500mMNaCl和0.05％Tween20组成的TTBS缓冲液中简单漂洗后，用含有在含1％明胶的TTBS缓冲液中1∶500稀释的抗AADH抗体的第一抗体培养滤膜1小时。经过将从氧化葡糖杆菌DSMNo.4025纯化的AADH蛋白质与不完全佐剂混合，将所得的混合物以2周的间隔注射进大白兔两次，在第二次注射1周后收集全血并制备血清部分作为抗AADH抗体来制备抗AADH抗体。然后，滤膜在TTBS缓冲液中洗涤2次(每次5分钟)并在含有在含1％明胶的TTBS中1∶3,000稀释的第二抗体的第二抗体(山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶连接物)溶液中培养1小时。在TTBS缓冲液中洗涤2次并在TBS中洗涤一次后，半滤膜浸入显色溶液中直至用Konica免疫染色HRP试剂盆IS-50B(Konica，Tokyo，日本)根据供应商的建议可观察到蓝色的带。为进行实际筛选，混合5个细胞溶胞产物并上样到一个孔中以进行第一次蛋白质印迹筛选。在70个混合物中，14个显示出阳性带，9个样品具有大约Mr64,000的免疫反应性蛋白质，但其中2个表现出较弱的信号，一个具有大约Mr60,000的免疫反应性蛋白质；4个样品具有Mr55,000的免疫反应性蛋白质。
对在Mr64,000显示出强烈信号的7个混合物样品分别进行第二次蛋白质印迹筛选以鉴定各混合物中的克隆。对每个混合物样品鉴定了一个阳性克隆；7个克隆的质粒分别命名为p6E10，p16C8，p16F4，p17E8，p1E2，，p24D4和p26C3。经过限制性酶分析，发现4个质粒，p6E10，p16C8，p16F4和p17E8携带相同的DNA区域且其它3个携带前面4个质粒的不同区域。
(3)以菌落印迹和DNA印迹杂交从粘粒文库筛选AADH基因
为了发现除上面所述的免疫学筛选获得的基因之外的其它AADH基因，经过与p24D4的0.9KbSalI片段进行菌落和DNA印迹杂交筛选在大肠杆菌ED8767中的氧化葡糖杆菌DSMNo.4025的完整粘粒文库(SalI文库和EcoRI文库)。0.9Kb的SalI片段与寡核苷酸探针ATGATGGT(GATC)AC(GATC)AA(TC)GT杂交，该探针根据从氧化葡糖杆菌DSMNo.4025中纯化的天然AADH酶的内部氨基酸序列MetMetValThrAsnValAspValGlnMetSerthrGlu合成，该氨基酸序列经过消化获得并用自动气相测序仪(应用生物系统470A)测序。适当稀释粘粒文库的细胞并涂布在LK琼脂板上，所得的菌落印迹到尼龙滤膜上并经过与32p-标记的0.9KbSalI片段杂交来分析。大约1％的菌落显示出阳性信号；41个菌落选自SalI文库，20个选自EcoRI文库，对它们进行限制性酶分析，接着进行DNA印迹分析。在这次筛选中分离出如下6个不同的与AADH基因相关的DNA区域：4个已经分离的在p24D4，P1E2，p26C3和p17E8上携带的区域，2个新的在命名为pSS31和pSS53的2个不同的质粒上携带的区域。另一个质粒pSS33携带p24D4和pSS31上携带的两个区域。
(4)AADH克隆的免疫学和酶学鉴定
携带p24D4，p1E2，p26C3，pSS31和p17E8的恶臭假单胞菌细胞溶胞产物的蛋白质印迹分析表明5个克隆分别编码分子量大约为64,000，62500，62500，60,000和62,000的蛋白质。质粒pSS33编码分子量大约为64,000和60,000的2个免疫活性蛋白质，而pSS53不产生任何免疫反应性蛋白质。
经光度分析测量各克隆(无细胞提取物，可溶性部分和膜部分)的酶活性。将各克隆的细胞接种到试管的5mlMB培养基中并在30℃下培养24小时。所得的培养液转移进500ml瓶的200ml新鲜MB培养基中，在旋转的培养瓶摇动器中30℃摇动24小时。经过在6,000xg下离心10分钟收集细胞并用40ml由50mMTris-HCl，pH7.5，5mMMgCl2和0.5mM苯甲基磺酰氟组成的冷缓冲液洗涤，用相同的缓冲液悬浮以制备每5ml1g湿细胞的细胞悬液。将细胞悬液用弗氏压碎器(1500kg/cm2)处理2次且将所得的匀浆在6000xg下离心10分钟以去掉细胞碎片。由此获得的无细胞提取物(CFE)在100,000xg下离心60分钟。收集所得的上清液和沉淀分别作为细胞溶质部分和膜部分并按如下进行PMS-DCIP测定。酶反应混合物(1.0ml)含100μMDCIP，1mMPMS，50mMTris苹果酸-NaOH缓冲液，pH8.0，底物和酶(10μ1)。使用Kontron分光光度计UVIKON810在25℃测量600nm处DCIP吸光度的底物依赖性降低速率。表6显示了克隆的无细胞提取物和可溶性部分的酶活性水平。根据底物特异性，在各质粒上编码的酶分成三大组，A-，B-和C-组：A组催化L-山梨糖，D-山梨醇和1-丙醇的氧化；B组催化D-葡萄糖和D-山梨醇的氧化；C组显示出对所使用的底物无明显可检测的活性。在A组中，有三类，A，A’和A”，它们以其在各质粒上携带的DNA的物理图谱而互相区别。B和C组分别仅由来自染色体DNA一个区域的一类蛋白质组成。
表6醇组酶名称质粒CFE山梨糖125mM山梨糖*1葡萄糖*2山梨醇*3山梨糖醛酮*4正丙醇125mM50mM125mM2mM50mMAAp24D4AA’p1E2AA”p26C3BBpSS31C-p17E8A和BA和BpSS33+++++--++++++-+++++++++++-++++-+/-++-++++++++-+/----++++++++++++++++++
活性水平：++++：非常高
+++：高
++：中等
+：低
+/-：痕量
-：检测不到
*1-*4：经过休止细胞反应，接着经TLC分析测定各底物的氧化产物。
*1：酶A，A’，A”和〔A和B〕对L-山梨糖的氧化产物是2KGA。
*2：酶B和酶〔A和B〕对D-葡萄糖的氧化产物是D-葡萄糖酸。
*3：酶A，A’和A”对D-山梨醇的氧化产物主要是D-葡萄糖，酶B对其的氧化产物是L-山梨糖，酶〔A和B〕对其的氧化产物是D-葡萄糖和L-山梨糖的混合物。
*4：酶A，A’，A”，B和〔A和B〕对L-山梨糖醛酮的氧化产物是2KGA。
实施例2核苷酸测序
使用M13mp18和M13mp19(BoehringerMannheim)以双脱氧核苷酸链终止法分别用质粒p24D4，p1E2，p26C3和pSS31测定酶A，A’，A”和B的基因的核苷酸序列。发现了各基因的一个开放阅读框(ORF)；4个基因的核苷酸序列在序列表SEQIDNo.1至4中显示，由这些核苷酸序列推断的氨基酸序列在SEQIDNo.5至8所列的序列中显示.酶A，A’，A”和B基因的ORF是1737，1737，1734和1737bp长且编码579，579，578和579个氨基酸残基，均包括信号序列的23个氨基酸。
酶A，A’，A”和B之间的同源性在表7中显示。
表7.AADH之间的氨基酸序列的同源性(％)
酶A酶A’酶A”酶B酶A100---酶A’89100--酶A”8586100-酶B838281100
图5显示了成熟酶A和酶B的氨基酸序列的序列对比以进行比较。
酶A，A’，A”和B的同源性检索揭示了酶A，A’，A”和B与包括Acetobacteraceti(T.Inoue等，细菌学杂志：171：3115-3122)或Acetobacterpolyoxogenes(T.Tamaki等，B.B.A.，1088：292-300)的乙醇脱氢酶和Paracoccusdenitrificans(N.Harms等，细菌学杂志，169：3966-3975)，Methylobacteriumorganophilum(S.M.Machlin等，细菌学杂志，170：4739-4747)，或Methylobacteriumextorquens(D.J.Anderson等，基因90：171-176)的甲醇脱氢酶的一些醌蛋白显示出相当低的同源性(通过多肽测定为26-31％的同源性)。
实施例3.AADH基因的亚克隆
酶A基因最初作为p24D4的粘粒克隆被克隆，它具有在pVK100EcoRI位点上的大约25Kb的插入片段。然后，它进一步被亚克隆以用作酶A基因盒。从3.4KbNruI片段上切下包括酶A基因的ORF且在两端具有大约500bp的非编码区的2.7KbEcoRV片段，其中NruI片段在M13mp18中从p24D4分离，用HindIII连接子(CAAGCTTG)将2.7KbEcoRV片段连接进pUC18的HindIII位点。所得的质粒命名为pSSA202。然后将酶A基因盒(2.7KbHindIII片段)插入pVK102的HindIII位点以生产pSSA102R。用实施例1-(1)所述的接合交配方法将质粒pSSA102R写入萘啶酮酸抗性的恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕中。携带pSSA102R的恶臭假单胞菌的转接体在含50μg/ml萘啶酮酸和10μg/ml四环素的MB琼脂培养基(MNT琼脂培养基)上选择并进行最小静止细胞反应。由20g/lL-山梨糖，3g/lNaCl，10g/lCaCO3组成的反应混合物(100μl)和用牙签以MNT琼脂培养物中收集的细胞在室温下轻轻摇动培养24小时。用TLC分析反应混合物并鉴定2KGA为产物，而用宿主，萘啶酮酸抗性恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕进行的相同静止细胞反应观察不到2KGA。
酶B基因最初作为pSS31的粘粒克隆被克隆，它具有在pVK102的SalI位点上的大约30Kb插入片段。它作为6.5Kb的BglII片段被亚克隆进pVK101(ATCC37157)的BglII位点以获得pSSB102。然后它进一步被亚克隆以用作酶B基因盒。6.5Kb的BglII片段克隆进pUC18的BamHI位点以获得pSSB202。然后，以pSSB202切下2.3KbXhoII片段。2.3Kb的XhoII片段包括具有120bp5’非编码区和大约500bp3’非编码区的酶B的ORF。用Klenow片段处理该片段以补齐粘性末端并用HindIII连接子克隆进pUC18的HindIII位点以产生pSSB203。酶B基因盒(2.3KbHindIII片段)在pVK102的HindIII位点插入以制备pSSB103R。经接合交配方法将质粒pSSB103R导入萘啶酮酸抗性的恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕中，携带pSSB103R的恶臭假单胞菌转接体在MNT琼脂培养基上选择并进行最小静止细胞反应。携带pSSB103R的恶臭假单胞菌在静止细胞反应中显示出酶B活性(从D-山梨醇形成L-山梨糖)。顺便提一句，发现XhoII片段不是XhoII-XhoII片段，而作为核酸测序的结果是一个XhoII-XhoI片段。XhoI可能存在于XhoII制品中)。
酶A’和酶A”基因最初作为p1E2和p26C3的粘粒克隆被克隆，它具有在pVK102的SalI位点中的大约30Kb的插入片段且基本上按上面所述进一步亚克隆。在3.5KbXhoII片段中的酶A’基因亚克隆进pVK102的BglII位点以构建pSSA’101R，在2.7KbEcoRV片段中的酶A”基因首先亚克隆进M13mp19，然后再亚克隆进pVK102的HindII和BglII位点之间以构建pSSA”102。
实施例4，从恶臭假单胞菌的转接体中分离和鉴定AADH
(1)微生物的培养：
携带含有酶A，A’，A”和B基因的粘粒载体pVK102，分别为pSSA102R，p1E2，p26C3和pSSB103R的恶臭假单胞商〔ATCC21812〕在抗生素存在的条件下在MB培养基中培养。加进培养基的抗生素如下：对于pSSA102R(酶A)和PSSB103R(酶B)为5μg/ml四环素，对于p1E2(酶A’)和p26C3(酶A”)为25μg/ml的卡那霉素。从含各自抗生素的MB的琼脂板上将细胞接种到含具有各自抗生素的5mlMB培养基的10只试管中并在30℃下摇动培养。培养2天后，将细胞转移进含100ml相同培养基的10个500ml锥形瓶中并在30℃摇动培养。培养1天后，合并种子培养物并转移到30L发酵罐(Marubishi)的18升培养基中并以300rpm搅动及1.0VVM通气在30℃下培养18小时。经过在6,000xg离心10分钟收获细胞，用1.5升含5mMCaCl2，1mMMgCl2，0.2MNaCl，2.5％蔗糖和0.5mMPMSF的25mMTris-HClpH7.5洗涤一次产在-20℃下贮存备用。结果获得大约150g湿重细胞。
(2)克隆的酶A，A’，A”和B的纯化。
用具有几乎相同规模的相同程序进行酶A，A’，A”和B的纯化。所有操作在4-10℃进行，除非另有说明。在整个纯化步骤中酶A，A’，A”和B的酶活性测定分别用底物L-山梨糖，正丙醇，正丙酶和D-葡萄糖通过实施例1中所述的分光光度测定进行。复苏细胞(含8-10g总蛋白质的大约100g湿重的细胞)并悬浮于大约200ml25mMTris-HCl，pH8.0中，经通过弗氏压碎器(1500kg/cm2)二次破碎。然后分别以0.01mg/ml和1mM的终浓度向悬液中加入DNA酶和MgCl2以降低溶液由DNA产生的粘度。经以6,000xg离心10分钟去掉细胞碎片。用25mMTris-HCl缓冲液pH8.0将悬液补充至240ml，以100,000xg离心90分钟以去掉不溶性膜成份。用Tris缓冲液将可溶性上清补充至240ml，然后分别以12.5μM和5mM的终浓度加入吡咯并喹啉醌(PQQ)和CaCl2，溶液在室温下剧烈搅拌15分钟。接上面所述制备的可溶性部分经(NH4)2SO4分级分离。沉淀35-60％饱和的(NH4)2SO4部分并重悬于100ml含5mMCaCl2，5％蔗糖的25mMTris-HCl缓冲液pH8.0，然后再以12.5μM的终浓度加入PQQ。用1000ml相同缓冲液(无PQQ)透析酶溶液过夜。缓慢向透析物中加入20g固体聚乙二醇#6000并轻轻搅拌。搅拌30分钟后，经以10,000xg离心20分钟去掉沉淀，用上面所述的缓冲液将上清液补充至200ml。
用下面的3步色谱纯化上面制备的酶溶液。第一步：DEAE-Toyopearl650M。
将粗制酶溶液上样到用含5mMCaCl2，和5％蔗糖的25mMTris-HCl缓冲液pH8.0平衡的DEAE-Toyopearl650M(2.5×40cm)柱上。用400ml的相同缓冲液洗柱并用在缓冲液中的200ml0-0.5MNaCl线性梯度以150ml/小时的流速洗脱酶。合并酶活性部分并用无NaCl的缓冲液稀释2倍。
第二步：Q-琼脂糖(FastFlow)
将酶溶液上样到用无NaCl的缓冲液平衡的Q-琼脂糖(FastFlow)柱上。用200ml含0.2MNaCl的缓冲液洗柱，用600ml在缓冲液中的0.2-0.6MNaCl线性梯度以50ml/小时的流速洗脱酶。合并酶活性部分并使用超滤器：Amicon，PM-30在N2气中浓缩至2.5ml。
第三步：SephacrylS-300HR(凝胶过滤)
经过用含5mMCaCl2，5％蔗糖和0.2MNaCl的25mMHEPES，pH7.5平衡的SephacrylS-300HR(2.5×100cm)柱过滤浓缩的酶。用相同的缓冲液以20ml/小时的流速洗脱该柱。合并酶活性部分并经过上面所述的超滤器浓缩到低于1ml并在-80℃贮存。在HEPES缓冲液中浓缩的酶在-80℃至少稳定2个月。
结果获得26.0mg的酶A，0.35mg的酶A’，0.41mg的酶A”和5.0mg的酶B。
(3)酶A，A’，A”和B的特性。
a)分子量和亚基
酶A，A’，A”和B在相同条件下从相同的SephacrylS-300HR凝胶过滤柱上的相同位置洗脱出来。酶的分子量与分子量柱准蛋白质(SDS-PAGE标准品，LowRange，Bio-RadLaboratories，Richmond，CA，USA)进行比较估测为大约135,000。酶A，A’，A”和B在SDS-PAGE分析上显示出均匀的单条带，分子量分别为64,000，62,500，62,500，和60,000。所有的酶带A，A’，A”和B使用抗-AADH兔血清在蛋白质印迹分析上检测到。因此，推断酶由2个相同的亚基作为均二聚体形式组成。
b)N-末端氨基酸序列和氨基酸组成。
用自动气相测序仪(470A，应用生物系统)以Edman方法〔ActaChem.Scand.，4，283-293，(1950)〕分析成熟酶A，A’，A”和B的N端氨基酸序列。未做酶A’的分析，因为样品的纯度不够。结果如下：
酶A：Gln-Val-Thr-Pro-Val-Thr……
酶A”：封闭的N端残基
酶B：Gln-Val-Thr-Pro-Ile-Thr-Asp-Glu-Leu-Leu-Ala……
酶A和B测定的序列与从SEQIDNO.5和8中描述的核苷酸序列推断的序列(从24个残基开始)相同；这些结果表明酶的起始23个残基是信号序列。以酶A和B的相似性推断酶A’和A”的前23个残基也是信号序列。
测定酶A的氨基酸组成。用6NHCl在110℃下处理24小时或用4M甲磺酸(用过甲酸氧化后)在115℃处理24小时来水解蛋白质。经过使用Kontron氨基酸分析仪(茚三酮系统)进行氨基酸分析。将分析资料与从酶A基因的DNA序列推导的氨基酸组成相比较。显示纯化的酶A确定是酶A基因的产物。
c).底物特异性：
使用8种底物，正丙醇，异丙醇，D-葡萄糖，D-山梨醇，L-山梨糖醛酮，D-甘露醇，L-山梨糖和D-果糖在上面所述的PMS-DCIP试验中鉴定酶A，A’，A”和B的底物特异性。结果在表1显示。
d).理化特性
使用PMS-DCIP测定进行酶A(对L-山梨糖脱氢酶活性)，A’(对正丙醇脱氢酶活性)，A”(对L-山梨糖脱氢酶活性)和B(对D-山梨醇脱氢酶活性)的最适pH，pH稳定性和热稳定性的理化研究。
表2概括了酶最适pH的结果。使用各种pH缓冲液以PMS-DCIP分光光度测定分析酶活性。缓冲液是50mMTris-苹果酸-NaOH，pH6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5；50mM甘氨酸-NaOH，pH9.0和9.5。在pH6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0和9.5下的DCIP的消光系数分别是10.8，13.2，14.5，14.9，15.0，15.1，15.1和15.1。所有的酶在pH8.0-8.5显示出其最适点。与酶A和A’相比，酶A”和B向低pH具有相当宽的pH范围。
表3显示了酶的pH稳定性的结果。酶(大约0.01mg/ml)用含5％蔗糖，0.2MNaCl，和5mMCaCl2的50mM缓冲液在25℃下保温3小时并用PMS-DCIP分光光度方法测定。缓冲液为乙酸钠，pH4和5，Tris-苹果酸-NaOH，pH6，7和8，甘氨酸-NaOH，pH9和10。表中的值以对在pH8.0下未保温所获得的值的相对活性来表达。用于酶的底物是：对于酶A和A”是125mML-山梨糖，对于酶A’是50mM正丙醇，对于酶B是125mMD-山梨糖。酶A，A’，A”和B的pH稳定性情况几乎相同，它们在pH6至9的范围内稳定。
表4显示了酶的热稳定性结果。存在于含5％蔗糖，0.2MNaCl和5mMCaCl2的25mMHEPES缓冲液pH7.5中的酶(大约0.05mg/ml)在表中所示的温度(4-60℃)下培养5分钟，在冰浴中冷却并以PMS-DCIP分光光度方法测定。残留的活性以对4℃保温所获得的值的相对活性来表达。用于酶的底物对酶A和酶A”是125mML-山梨糖，对酶A’是50mM正丙醇，对酶B是125mMD-山梨醇。40℃处理酶5分钟后，酶A的残留活性是20％，酶A’，A”和B的残留活性是70-85％。
(e)一般抑制剂。
溶于含5％蔗糖的25mMHEPES缓冲液pH7.5中的酶(大约0.05mg/ml)与金属或抑制剂一起在25℃保温30分钟。经实施例1所述的PMS-DCIP分光光度测定分析残留活性。残留活性以对空白保温的相对活性来表达。金属离子对酶的影响在表5中列出。MgCl2和CaCl2对酶几乎无影响，而其它金属离子，特别是CuCl2影响显著。抑制剂对酶的影响在表5中列出。EGTA和EDTA显著抑制酶A，A’和A”。然而，酶B受EDTA和EGTA的抑制比A组酶要小。
实施例5.酶B在大肠杆菌中的有效生产
酶B的信号肽区域用大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(malE)的信号肽区域取代如下。用应用生物系统381ADNA合成仪合成两个寡核苷酸(SEQIDNo.9和10)并退火以产生编码氨基酸序列(SEQIDNo.11)，MetLysIleLysThrGlyAlaArgIleLeuAlaLeuSerAlaLeuThrThrMetMetPheSerAlaSerAlaLeuAla(Gln)的双链DNA片段，然后将它用T4多核苷酸激酶处理〔生物化学杂志，259，10606-10613，(1984)〕。用限制酶SphI消化pSSB203(见实施例3)，用T4DNA聚合酶处理并用BstP1消化。琼脂糖凝胶电泳后从琼脂糖凝胶中分离携带酶B基因而没有编码成熟酶B起始信号序列和第一个氨基酸残基(Gln)的区域的所得的1.72KbDNA片段。用限制性酶NcoI(在ATG起始密码子处)和SmaI消化的大肠杆菌表达载体pTrc99A(ParmaciaCo.，Uppsala，瑞典)与上述2个DNA片段连接。所得的质粒为pTrcMal-EnzB并用于转化大肠杆菌JM109。转化子在各含有600ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB的2个2升瓶中28℃下生长，当细胞浓度达到大约1.5OD600时加入IPTG至0.1mM。加入IPTG后，细胞再培养3-4小时。经过在25℃下离心(4,000xg)10分钟收获细胞，用500ml含20％蔗糖的30mMTris-HCl，pH8.0在25℃下悬浮。向细胞悬液中加入EDTA至1mM后，在25℃下轻轻摇动培养细胞5分钟并在4℃离心(8,000xg)15分钟收集。用500ml冰冷的5mMMgSO4溶液重悬细胞并在4℃轻轻摇动培养5分钟。细胞悬液在4℃下以8,000xg离心10分钟以获得上清作为冷渗压振扰提取物，经SDS-PAGE分析发现它含有纯度超过50-60％的酶B蛋白质(分子量为60,000)。上清首先补充Tris-HCl，pH8.0至20mM，并在25℃下先用10mM终浓度的EDTA保温10分钟，其次用20mM终浓度的CaCl2保温10分钟，最后用25μm终浓度的PQQ保温。为了稳定该酶，在上清中加入α-甲基-D-葡糖苷(一种竞争性抑制剂)至20mM终浓度。以下面两种色谱完全纯化酶B。首先，将上清上样到已用含1mMCaCl2和20mMα-甲基-D-葡糖苷的20mMTris-HCl，pH8.0平衡的Q-Sepharose柱(1.6×12cm)上，用600ml在相同缓冲液的0-0.4MNaCl线性梯度中洗脱酶B。收集在大约0.25MNaCl洗脱的红色蛋白质峰并用Centricon-30(Amicon)浓缩成大约0.5ml。最终，将酶B通过具有含0.2MNaCl，1mMCaCl2和20mMα-甲基-D-葡糖苷的20mMHEPES，pH7.8的Sephacryls-300HR柱。收集在分子量为135,000道尔顿位置周围洗脱的红色蛋白质峰作为最终纯化的酶B。结果，从大肠杆菌的1.2升培养液中获得大约8mg的纯化的酶B。
实施例6.宿主-载体系统
经过使用具有广宿主范围粘粒pVK102的接合交配系统建立氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕的宿主-载体系统。首先，从具有萘啶酮酸抗性的氧化葡萄杆菌〔DSMNo.4025〕仅分离出一个转接体。经过消除pVK102从携带pVK102的转接体氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕中分离出一个新宿主GOS2。然后经过加入利福平抗性(100μg/ml)从GOS2产生第二宿主，GOS2R，该抗性使得从供体大肠杆菌中易于选择转接体。转移进GOS2R的质粒转移频率是10-3-10-4转接体/受体。而GOS2R的2KGA产率比氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4-25〕大约低10％。通过一系列实验，包括接合，消除和2KGA发酵选择具有利福平抗性，高2KGA产率和相当高感受态的菌株从氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕获得了第三宿主，GORS6-35。
(1)GOS2的分离
将对萘啶酮酸的抗性加入氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕中。将氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕细胞划线到具有50μg/ml萘啶酮酸的TypticaseSoyBroth(BBL，BectonDickinsonMicrobiologysystemsCockeysville，MD.USA)(T)琼脂培养基(TN琼脂培养基)上并在27℃培养5天。将所得的菌落再次划线到相同琼脂板上以获得萘啶酮酸抗性氧化葡糖杆菌DSMNo.4025GON。经过如下的三亲本接合交配从携带pVK102的大肠杆菌将广宿主范围粘粒pVK102(Kmr，TCr)转移进GON菌株。辅助菌株携带pRK2013的大肠杆菌和携带pVK102的供体菌株在具有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜。将培养物转移到含卡那霉素的新鲜LB培养基中培养5-6小时。受体菌株GON在TN液体培养基中30℃培养过夜。分别离心大肠杆菌和GON菌株并分别重悬于等体积和十分之一体积的新鲜T培养基中。将100μl的各细胞悬液一起混合并将30μl部分的混合物点样到放于NS2琼脂板表面上的硝化纤维素滤膜上。在含50μg/ml萘啶酮酸和50μg/ml卡那霉素的T琼脂培养基(TNK琼脂培养基)上选择转接体。在选择平板上获得一些菌落，其中也出现许多大肠杆菌(Nalr，kmr)菌落的自发突变体。制备转接体候选物的质粒和染色体DNA并经过限制性分析和DNA印迹杂交与真正的pVK102和氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕的一个转接体GON8-1。从GON8-1制备的质粒DNA与pVK102的相同且在大肠杆菌中复制。GON8-1的染色体DNA与氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕的相同。
为了分离作为对结合交配具有更高感受性的宿主的菌株，消除转接体GON8-1的质粒pVK102。GON8-1在无抗生素的T培养基中30℃下培养2天，将2％的培养物转移到新鲜T培养基中。经过3轮该培养循环后，将细胞涂布在T琼脂板上，在27℃下培养4天，将所得的菌落桃到TNK和TN琼脂板上以选择Kms菌落。一个Kms菌株命名为GOS2并以DNA印迹杂交证实不携带pVK102的任意DNA区域。然后经接合交配将pVK102转移进菌株GOS2；该菌株显示出比氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕高102-103倍的感受性(10-5～10-6转接体/受体)。
(2)GOS2R，GOS2的一种利福平抗性突变体的分离
经过将GOS2细胞重复转移到含20-100μg/ml利福平的T琼脂培养基上从GOS2分离利福平抗性(Rifr)突变株；一个Rifr菌株命名为GOS2R。菌株GOS2R显示出非常高的感受性；在TRK琼脂(含100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的T琼脂培养基)板和在TRT琼脂(含100μg/ml利福平和3μg/ml四环素的T琼脂培养基)板上分别为10-2～10-3和10-4转接体/受体。
比较GOS2R和氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕从L-山梨糖生产2KGA的产率。将在NS2琼脂培养基上维持的细胞接种到5ml由8％L-山梨糖(分别灭菌)，0.05％甘油，0.25％MgSO4·7H2O，1.75％玉米浆，5.0％面包酵母，1.5％CaCO3和0.5％尿素(分别灭菌)(灭菌前pH7.0)组成的种子培养基中并30℃培养24小时。将所得的种子培养物(5ml)接种进含有50ml由10％L-山梨糖，(分别灭菌)，0.05％甘油，0.25％MgSO4·7H2O，3％玉米浆，6.25％面包酵母，1.5％CaCO3，和1.6％尿素(分别灭菌)(灭菌前pH7.5)组成的生产培养基PMS10的500ml锥形瓶中并在38℃下摇动(180rpm)培养4天。以高效液相色谱进行2KGA的定量测定。GOS2R和氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕分别产生87.3和97.3g/l的2KGA。
(3)分离作为具有高2KGA产率的宿主的GORS6-35。
为了评价与氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕具有相同的从L-山梨糖生产2KGA的产率的菌株中AADH基因的自我克隆，经过(i)加入利福平抗性(200μg/ml)(ii)导入并消除pVK102和(iii)选择从L-山梨糖生产2KGA的高产菌来构建新宿主。由此获得的GORS6-35显示出下列2个特征：(i)与亲本氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕几乎相同的2KGA产率(大约从10％L-山梨糖生产100g/l2KGA)；和(ii)感受态(10-6-10-7转接体/受体)。
实施例7.取代启动子的酶B基因的构建
在氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕中酶A基因的启动子(PA)可能很强，因为当对氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕的总无细胞提取物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并用考马斯亮兰R-250染色所得凝胶时发现酶A是细胞中的一个最高表达量的蛋白质。将PA和另一启动子，在氧化葡糖杆菌〔DSMNo.4025〕中表达卡那霉素抗性的Tn5卡那霉素抗性基因的启动子(PTn5)连接到图10所示的具有酶B基因SD序列的结构基因上。
将含酶B基因的2.3KbHindIII片段插入M13mp18，用T7-GENTM外诱变试剂盒(TOYOBOCo.Ltd.Osaka日本)根据供应商的建议进行对所得的噬菌体DNA的定点诱变(图9)。为了在酶B基因上游插入各种启动子以代替酶B启动子，在SD序列上游产生BamHI位点。用应用生物系统381ADNA合成仪合成诱变引物GTTAGCGCGGTGGATCCCCATTGGAGG(包括BamHI位点的27聚体，SEQIDNo.12)。所得的BamHI-HindIII片段携带酶BSD和无酶B启动子(PB)的结构基因。
使用以HindIII和BamHI位点的序列标记的引物经PCR方法亚克隆酶A基因的启动子(PA)。用GeneAmpTMDNA扩增试剂盒(TakaraShuzo，Kyoto，日本)以热循环器，ZymoreactorII(AttoCorpTokyo，日本)进行PCR反应。反应由加酶前的预处理(94℃，5分钟)；30个循环的变性步骤(94℃，1分钟)，退火步骤(60℃，1分钟)，和合成步骤(72℃，1分钟)；以及后处理(72℃，5分钟)组成。质粒pSSA202(pUC-酶A基因在2.7Kb的HindIII片段中)用作模板DNA。反应混合物含200μmdNTP，各引物1μm，1ng的模板DNA和在提供的缓冲液中的2.5U的AmpliTaqTMDNA聚合酶。结果，扩增了SD序列上游的300bp片段。将PCR产物插入pUC18的HindIII和BamHI位点之间并用于核苷酸测序；扩增的序列没有在PC中由错误掺入而引起的任何突变。
卡那霉素抗性基因的启动子PTn5作为HindIII-PstI片段从质粒pNeo(PharmaciaCo.，Uppsala.瑞典)首先获得。然后将HindIII-PstI片段插入pUC18的多克隆位点，最后PTn5作为HindIII-BamHI片段切下。
含有PA和PTn5启动子的HindIII-BamHI片段与含有去掉PB启动子的酶B结构基因的BamHI-HindUI片段一起插入pUC18的HindIII位点。将所得质粒的HindIII片段亚克隆进pVK100以产生pSSAP-B和pSSPTn5-8，它们经过实施例6所述的接合交配转移进GOS2R。
实施例8.用GOS2R的转接体在瓶中生产2KGA
(1)用扩增分酶A基因的转接体在瓶中以单一培养物发酵从L-山梨糖生产2KGA。
经过实施例6所述的接合交配方法将酶A质粒pSSA102R和载体质粒pVK102导入GOS2R中。将所得的转接体在含30μg/ml四环素的NS2琼脂培养基上维持并进行从L-山梨糖的2KGA发酵。转接体的细胞接种进5ml实施例6所述的种子培养基中并在30℃培养24小时。所得的种子培养物(5ml)接种进含50ml实施例6所述的PMS10生产培养基或由12％L-山梨糖(分别灭菌)，0.05％甘油，25％MSO4·7H2O，3％玉米浆，10％面包酵母，1.5％CaCO3和2％尿素(分别灭菌)(灭菌前pH7.5)组成的PMS12生产培养基的500ml锥形瓶中并在30℃摇动(180rpm)培养4或5天。结果，GOS2R(pSSA102R)和GOS2R(pVK102)分别在4天后从10％L-山梨糖产生92.2和89.1g/l2KGA，在5天后从12％L-山梨糖分别产生105.7和99.9g/l2KGA。
(2)用GOS2R(pSSB103R)在瓶中以单一培养物发酵从D-山梨糖生产2KGA。
按实施例6所述的接合交配方法将酶B质粒pSSB103R和载体质粒pVK102导入GOS2R。所得的转接体在含30μg/ml四环素的NS2琼脂培养基上维持并进行从D-山梨醇的2KGA发酵。将转接体的细胞接种进5ml由8％D-山梨醇，0.05％甘油，0.25％MgSO4·7H2O，1.75％玉米浆，5.0％面包酵母，1.5％CaCO3和0.5％尿素(分别灭菌)(灭菌前pH7.0)组成的种子培养基中并在30℃培养24小时。将所得的种子培养物(5ml)接种进含50ml表8所示的3种生产培养基的500ml锥形瓶中并在30℃摇动(180rpm)培养3天。结果，GOS2R(pSSB103R)从8％，10％和12％D-山梨醇分别产生大约61.5，71.5和73.0g/l2KGA，而GOS2R(pVK102)分别产生19.5，25.4和30.2g/l2KGA。
表8(％)成份PMSL8PMSL10PMSL12D-山梨醇8.010.012.0甘油0.050.050.05MgSO4·7H2O0.250.250.25CSL3.03.03.0面包酵母5.06.2510尿素*1.251.62.0CaCO31.51.51.5
灭菌前pH7.5
*：分别灭菌
(3)用GOS2R(pSSAP-B)和GOS2R(pSSPTn5-B)在瓶中以单一培养物发酵从D-山梨醇生产2KGA。
将GOS2R(pSSAP-B)，GOS2R(pSSPTn5-B)和GOS2R(pSSB103R)，GOS2R(pVK100)的细胞在锥形瓶的PMSL10生产培养基中在30℃下按实施例8(2)所述培养3天。产生的2KGA量在表9中显示。
表9
2KGA的量(g/l)菌株1天2天3天GOS2R(pSSAp-B)47.267.067.7GOS2R(pSSPTn5-B)23.428.629.4GOS2R(pSSB103R)30.554.362.7GOS2R(pVK100)10.218.319.3GOS2R6.714.716.4
实施例9.以单一微生物在3-L发酵罐中从D-山梨醇生产2KGA
(1)用GOS2R(pSSB103R)进行单一培养物发酵
将按实施例8-(2)所述在试管中制备的种子培养物的5ml部分转移进含50ml相同种子培养基的4个500ml锥形瓶中并在30℃摇动(180rpm)培养24小时。将所得的培养物(200ml种子培养物)接种进含1800ml含3ml消泡剂的PMSL10生产培养基的3L发酵罐中。发酵罐在30℃下以700rpm和0.5vvm操作。以下列方式加入D-山梨醇：(i)。将200ml50％的D-山梨醇在从第24小时至第30小时的6小时中加入；或(ii)将280ml50％D-山梨醇在从第24小时到第32.3小时的8.4个小时内加入。结果，经过(i)和(ii)加料程序发酵分别在51小时后产生99.0和103.4g/l2KGA。
实施例10.用扩增了酶B基因的GOS2R在瓶中与大肠杆菌混合培养发酵从D-山梨醇生产2KGA
(1)用B.megaterium，大肠杆菌和恶臭假单胞菌的混合培养发酵。
将生长因子提供菌B.megaterium[DSMNo.4026]，大肠杆菌HB101和恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕在150ml由0.3％酵母提取物(Difco)，0.3％牛肉膏(KyokutoSeiyaku，Tokyo，日本)，3％玉米浆，1％多肽胨(Kyotuto)，0.1％尿素，0.1％KH2PO4，0.02％MgSO4·7H2O，2％L-山梨糖，0.1％CaCO3(灭菌前pH7.1)组成的种子培养基中分别于37，37和30℃培养24小时。将菌株GOS2R(pSSB103R)在含在实施列8(2)所述的5ml种子培养基的2个试管中30℃培养24小时。将4mlGOS2R(pSSB103R)种子培养物和3.5ml生长因子提供菌种子培养物接种到含有50ml用于混合培养发酵的由8％D-山梨醇，0.01％MgSO4·7H2O，1％玉米浆，0.1％KH2PO4，0.6％CaCO3，1.5％尿素(分别灭菌)和消泡剂(每瓶1滴)(灭菌前pH7.0)组成的生产培养基的500ml锥形瓶中，将瓶在30℃摇动46.5小时。结果，含有B.megateriumDSMNo.4026，大肠杆菌HB101和恶臭假单胞菌ATCC21812的混合培养物分别产生49.9，54.1，31.3g/l2KGA。
(2)GOS2R(pSSAP-B)与大肠杆菌在瓶中的混合培养发酵
按上面所述以相同的方式进行GOS2R(pSSAP-B)与大肠杆菌的混合培养发酵，除了大肠杆菌的种子培养物含2％D-山梨醇以代替2％L-山梨糖。从10％D-山梨醇，GOS2R(pSSAP-B)在48.5小时后产生73.7g/l2KG。
实施例11：用重组AADH生产2KGA
含1.7mg/ml纯化的酶A(根据实施例4纯化)，50mMTris-HCl，pH7.5，5mMCaCl2，8mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，1mMPMS，20μg/mlPQQ和4％L-山梨糖的反应混合物在30℃轻轻摇动保温20小时。结果，产生大约2g/l2KGA(TLC测定)。
含纯化的酶A和酶B(根据实施例4纯化)各2.4mg/ml，50mMTris-HCl，pH7.5，5mMCaCl2，8mg/mlBSA，1mMPMS，20μg/mlPQQ，和2％D-山梨醇的其它反应混合物在30℃轻轻摇动培养20小时。结果，产生0.25g/l2KGA(HPLC测定)和大约5g/lL-山梨糖(TLC测定)。
实施例12：从醇生产醛，从醇或羧酸生产酮以及从醛生产羧酸
按实施例11所述进行纯化酶A或酶B与各种底物的酶反应。以TLC和/或HPLC鉴定所得的产物，如表10所示。
表10酶底物产物酶AD-山梨醇D-葡萄糖，L-葡萄糖
L-山梨糖L-山梨糖醛酮，2KGA
L-山梨糖醛酮2KGA
D-甘露醇D-甘露糖
D-果糖2KD酶BD-葡萄糖D-葡糖酸
D-山梨醇L-山梨糖
L-山梨糖醛酮2KGA
D-甘露醇D-果糖
L-艾杜糖L-艾杆糖酸
甘油二羟丙酮
D-葡糖酸5-酮基-D-葡糖酸
D-甘露糖酸5-酮基-D-甘露糖酸
酶A将D-果糖转变成2KD，这意味着D-葡糖醛酮也是以D-果糖形成的作为中间产物的产品。
实施例13用恶臭假单胞菌转接体生产2KGA和L-山梨糖
含1％CaCO3，0.3％NaCl，1mMPMS，5μg/mlPQQ，2％L-山梨糖和10OD600单位细胞的携带pSSA102R或pVK100的萘啶酮酸抗性(Nalr)恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕的静止细胞混合物(2ml)在30℃轻轻摇动培养17小时。结果，携带pSSA102R或pVK100的Nalr恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕分别产生18.9或0.0g/l2KGA。
含1％CaCO3，0.3％NaCl，1mMPMS，5μg/mlPQQ，2％D-山梨醇和10OD600单位细胞的具有pSSB103R或具有pVK100的Nalr恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕的静止细胞混合物(2ml)在30℃轻轻摇动培养17小时。结果，携带pSSB103R或具有pVK100的Nalr恶臭假单胞菌〔ATCC21812〕分别产生7.8或0.0g/lL-山梨糖。
实施例14嵌合体AADH酶的构建和鉴定
(1)嵌合体AADH酶的构建
为了改变AADH酶的底物特异性，构建酶A和B之间的各种嵌合酶。
(i)图2显示了方案I(限制和连接方法)的嵌合基因的结构。在两上基因中都保守的限制性位点，AvaI(酶A基因的核苷酸号603)，EcoRI位点(核苷酸号1084)和SalI位点(核苷酸号1470)(图7)用于构建。首先，酶A和B基因盆(分别为2.7Kb和2.3Kb的HindIII片段)以相同的方向按该顺序亚克隆进pUC18以生产质粒pSSAB201，酶B和A基因盒也以相同方向按该顺序亚克隆进pUC18产生pSSBA201(图3)。用各限制性酶部分消化这些质粒后，连接所得的消化产物并用于转化大肠杆菌JM109。分析氨苄青霉素抗性转化子的质粒，选择分别具有预期的2.7Kb和2.3KbHindIII片段大小的酶A基因开头和酶B开头的嵌合基因盒。将由此构建的嵌合基因盒导入pVK102的HindIII位点以产生pSSA/B101R，pSSA/B102R，pSSA/B103R，pSSB/A101R，pSSB/A102R，和pSSB/A103R，它们分别编码酶A/B1，酶A/B2，酶A/B3，酶B/A1，酶B/A2和酶B/A3，如图2所示。以实施例1所述的接合交配方法将这6个质粒导入Nalr恶臭假单胞菌。
(ii)图8显示了以方案II构建嵌合基因的程序，构建嵌合体的体内同源重组方法在随机位置重组以改变AADH酶的底物特异性。该方法的原理如下：(i)将待重组的两个同源基因串联置于带选择性标记的一个质粒中；(ii)在两个基因之间的限制性位点剪切并用该线性质粒转化recA+大肠杆菌细胞；(iii)选择显示选择标记的转化子，它携带经过在两基因各位点之间重组的环化DNA。在pUC18上具有酶A和酶B基因的两个质粒pSSAB201和pSSBA201用图8所示的限制性酶对线型化。用这些线型化的DNA转化大肠杆菌JM1O1(recA+)。以101-102/μgDNA的频率获得转化子。开始，测定DNA大小以去掉非常规重组子。结果，以30％的比率获得正确的重组子。失去C端大约2/3的酶A基因的XhoI-BalI片段对于获得在N端1/3内重组的嵌合体有效。接着，重组体分成两侧为三种SmaI，SphI，SalI和BalI限制性位点的重组位点组(图7)。由此构建的嵌合基因以HindIII盒在pVK100上亚克隆并以接合交配方法将该质粒导入Nalr恶臭假单胞菌中。
(2)嵌合AADH酶的鉴定。
(I)以限制和连接方法获得的嵌合体的特性
按实施例1所述使用转接体细胞的可溶性部分以酶方法鉴定在Nalr恶臭假单胞菌中表达的嵌合体酶。图11所示的8种底物用于评价。酶A/B1和A/B3显示出酶A型底物特异性，尽管其表达水平比酶A更低。另一方面，酶B/A1，B/A2和B/A3显示出酶B型底物特异性，尽管随酶A区域的增加对正丙醇的活性(酶A型活性)更高；酶B/A1基因的表达水平比野生型酶B基因大约高2倍。按以重组和连接方法获得的嵌合体的结果推断酶A或酶BN端1/3区域基本上决定其底物特异性。
(ii)用同源重组方法获得的嵌合体的特性
在上面获得的嵌合体中，图7所示的从在SmaI2和SalI位点之间重组的嵌合体基因获得的18个嵌合酶中有7个显示出更好的底物特异性。这7个嵌合酶将D-山梨醇转变成L-山梨糖，而不是由酶A所产生的D-葡萄糖，且象酶A一样将L-山梨糖转变成2KGA。按实施例2所述的核苷酸测序确定重组位点。这类具有“N端2/9的酶A+C端7/9的酶B”的合适结构的嵌合体分类为酶SuperA型。根据重组位点有3个SuperA型酶：酶A/B21(由酶A氨基酸残基No1-128部分和酶BNo129-556部分组成的嵌合体)，酶A/B22(由酶A部分氨基酸残基No.1-125和酶B部分No.126-556组成的嵌合体)和酶A/B25(由酶A氨基酸残基No.1-135部分和酶BNo.136-556部分组成的嵌合体)。表达酶A/B21，酶A/B22或酶A/B25基因的恶臭假单胞菌被转接体将D-山梨醇转变成L-山梨糖且不能将D-山梨醇转变成D-葡萄糖。另一类嵌合酶A/B31(酶A氨基酸残基号1-95部分和酶BNo.96-556部分)将D-山梨醇有效转变成L-山梨糖且不能将L-山梨糖转变成2KGA；这种嵌合体显示出酶B型活性。上述嵌合体的表达水平比野生型酶B更高，因为当用程序CodonPreference(WisconsinsequenceAnalysisPackageTM，遗传学计算机组)分析基因时发现酶B基因含有许多罕用密码子，但酶A不是。
(3)在嵌合基因中密码子使用的改进
为了在更好的密码子使用方面进一步改进嵌合体酶A/B21，酶A/B22，酶A/B25和酶A/B31，由酶B残基组成的C末端2/3用由酶A残基组成的C末端2/3代替。酶A/B21，酶A/B22，酶A/B25和酶A/B31基因用于构建酶sA21(酶A氨基酸残基No.1-128部分，酶BNo.129-180部分及酶ANo.180-556部分)，酶SA22(酶A氨基酸残基号1-125部分，酶BNo.126-180部分及酶ANo.180-556部分)，酶sA2(酶A氨基酸残基No.1-135部分，酶BNo.136-180部分及酶ANo.180-556部分)和酶sB(酶A氨基酸残基号1-95部分，酶BNo.96-180部分及酶ANo.180-556部分)的新嵌合基因(图4)。实际上，经过用AvaI部分消化质粒，携带酶sA基因和酶B/A1基因的pUC18及携带酶A/B31基因和酶B/A1基因的pUC18，连接所得的消化产物，转化大肠杆菌JM109，用限制性分析来分析转化子的质粒结构并测定核苷酸序列以证实预期的重组位点AvaI来进行酶sA2和酶sB的取代实验。经过用含有酶A/B21或酶A/B22基因重组位点的相应HindIII-SspI片段取代编码酶sA2N端部分的pSSsA2的HindIII-SspI片段进行酶sA21和酶sA22的取代实验(图4)。
(4)嵌合体酶的动力学特性。
表11和12概括了嵌合酶sA2和酶sB分别与酶A和酶B比较的动力学特性。
表11酶sA2对酶A
酶sA2酶AKm山梨糖128mM36mMKm山梨醇2140388Km葡萄糖20-
在用酶sA2和酶A的产品试验中从L-山梨糖的产物是2KGA。在用酶sA2和酶A的产品试验中从D-山梨醇的产物分别是带痕量D-葡萄糖的L-山梨糖及D-葡萄糖。因此，酶sA2显示出从D-山梨醇生产2KGA的所需特性；与酶A一样的从L-山梨糖生产2KGA的L-山梨糖/L-山梨糖醛酮脱氢酶活性以及象酶B一样从D-山梨醇生产L-山梨糖的D-山梨醇脱氢酶活性。
表12酶sB对酶B
酶sB酶BKm山梨醇61mM128mMKi山梨糖150100
与酶B相比，酶sB显示出对D-山梨醇更高的亲和力和对L-山梨糖更低的亲和力，L-山梨糖是D-山梨醇的氧化产物且是D-山梨醇转变成L-山梨糖的抑制剂。
实施例15用嵌合AADH酶扩增的GOS2R衍生物从D-山梨醇生产2KGA
为了评价酶sA2和酶sB，构建GOBΔK和GOI13菌株。经过去掉全部酶B基因并代替插入从pUC4K[4.1Kb，Kmr，Ampr；Pharmacia，Uppsala，瑞典；Viera，J.和Messing，基因杂志19：259，(1982)]分离的1.28KbKmr基因盒从GOS2R制备GOBΔK，该制备使用自杀载体pSUP201〔Ampr，Cmr，mobt，pBR325的衍生物，生物/技术，1：784-791，(1983)〕进行。
经过用酶sB基因取代野生型酶A基因并用自杀载体pSUP202〔Ampr，Cmr，Tcr，mobt，pBR325衍生物，生物/技术，1：784-791，(1983)〕缺失用庆大毒素(Gm)抗性基因盒取代的野生型酶A”基因从GOBΔK构建GOI13。经过以DNA片段Tn5-GM〔Sasagawa等，基因56：283-288，(1987)〕作模板进行PCR扩增将Gmr基因盒设计成两端具有PstI位点，将所得的PC产物插入pUC4K的PstI位点以产生pUC8G；经过用EcoRI，BamHI，SalI或PstI消化可从pUC8G分离Gmr基因。
(1)在2KGA生产中酶sA2扩增的影响
以实施例6所述的接合交配方法将具有含酶sA2基因的2.7KbHindIII盒的质粒pSSsA2，pVK100以及具有含酶A基因的2.7KbHindIII盒的其控制质粒pSSA102R，pVK102导入GOI13。按实施例8所述将所得的转接体在PMSL10培养基中在30℃下培养4天。携带pSSsA2和pSSA102R的GOI13分别产生66.3和38.5g/l的2KGA，及分别为8.4和25.9g/l的2KD(从D-山梨醇经D-葡萄糖和D-葡萄糖酸生产2KGA时的副产品)。
(2)按实施例6所述的接合交配方法将分别具有含酶sA21和酶sA22基因的2.7KbHindIII盒的pVK100的质粒pSSsA21和pSSsA22导入GOI13。按实施例8所述将所得的转接体在PMSL10培养基中30℃培养4天。携带pSSsA21和pSSsA22的GOI13分别产生66.8和77.4g/l的2KGA及分别为0.3和0.4g/l的2KD。
(3)在2KGA生产中酶sB的效力
质粒pSSsB，具有含酶sB基因的2.7KbHindIII盒的pVK100(图4)和其控制质粒pSSB103R，含2.3Kb酶B基因的pVK102经接合交配方法导入GOBΔK。按实施例8(2)所述在PMSL8培养基中培养携带pSSsB的GOBΔK，携带pSSB103R的GOBDK和GOBΔK且分别产生52.0，46.8和1.1g/l的2KGA及分别为6.9，9.3，32.3g/l的2KD。
在染色体DNA上携带一拷贝的酶sB而没有酶B，酶A和酶A”的野生型基因的GOI13也在PMSL10培养基中培养2天。它产生79.3g/l的L-山梨醇。
序列表(1)一般信息(i)申请人姓名：F.HOFFMANN-LAROCHEAG街道：Grenzacherstrasse124城市：Basle国家：Switzerland邮编：CH-4002电话：061-6882505传真：061-6881395电传：962292/965542hlrc(ii)发明题目：新的醇/醛脱氢酶(iii)序列数：12(iv)计算机可读形式：(A)媒体类型：Floppy盘(B)计算机：Macintosh(C)操作系统：(D)软件：MSwordver5.1(2)SEQIDNO：1信息(i)序列特征：(A)长度：1740个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓朴：线型(ii)分子类型：DNA(基组)(iii)原始来源：生物：氧化葡糖杆菌菌株：DSM4025(iv)特征：特征关键：CDS位置：1..1737测序方法：EATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGCCAGTGCTGGCGCACTTGCATTGCT50TGCCGCACCCGCCTTTGCTCAAGTGACCCCCGTCACCGATGAATTGCTGG100CGAACCCGCCCGCTGGTGAATGGATCAGCTACGGTCAGAACCAAGAAAAC150TACCGTCACTCGCCCCTGACGCAGATCACGACTGAGAACGTCGGCCAACT200GCAACTGGTCTGGGCGCGCGGCATGCAGCCGGGCAAAGTCCAAGTCACGC250CCCTGATCCATGACGGCGTCATGTATCTGGCAAACCCGGGCGACGTGATC300CAGGCCATCGACGCCAAAACTGGCGATCTGATCTGGGAACACCGCCGCCA350ACTGCCGAACATCGCCACGCTGAACAGCTTTGGCGAGCCGACCCGCGGCA400TGGCGCTGTACGGCACCAACGTTTACTTTGTTTCGTGGGACAACCACCTG450GTCGCCCTCGACACCGCAACTGGCCAAGTGACGTTCGACGTCGACCGCGG500CCAAGGCGAAGACATGGTTTCGAACTCGTCGGGCCCGATCGTGGCAAACG550GCGTGATCGTTGCCGGTTCGACCTGCCAATACTCGCCGTTCGGCTGCTTT600GTCTCGGGCCACGACTCGGCCACCGGTGAAGAGCTGTGGCGCAACTACTT650CATCCCGCGCGCTGGCGAAGAGGGTGATGAGACTTGGGGCAACGATTACG700AAGCCCGTTGGATGACCGGTGCCTGGGGCCAGATCACCTATGACCCCGTC750ACCAACCTTGTCCACTACGGCTCGACCGCTGTGGGTCCGGCGTCGGAAAC800CCAACGCGGCACCCCGGGCGGCACGCTGTACGGCACGAACACCCGTTTCG850CGGTGCGTCCTGACACGGGCGAGATTGTCTGGCGTCACCAGACCCTGCCC900CGCGACAACTGGGACCAGGAATGCACGTTCGAGATGATGGTCACCAATGT950GGATGTCCAACCCTCGACCGAGATGGAAGGTCTGCAGTCGATCAACCCGA1000ACGCCGCAACTGGCGAGCGTCGCGTGCTGACCGGCGTTCCGTGCAAAACC1050GGCACCATGTGGCAGTTCGACGCCGAAACCGGCGAATTCCTGTGGGCCCG1100TGATACCAACTACCAGAACATGATCGAATCCATCGACGAAAACGGCATCG1150TGACCGTGAACGAAGATGCGATCCTGAAGGAACTGGATGTTGAATATGAC1200GTCTGCCCGACCTTCTTGGGCGGCCGCGACTGGCCGTCGGCCGCACTGAA1250CCCCGACAGCGGCATCTACTTCATCCCGCTGAACAACGTCTGCTATGACA1300TGATGGCCGTCGATCAGGAATTCACCTCGATGGACGTCTATAACACCAGC1350AACGTGACCAAGCTGCCGCCCGGCAAGGATATGATCGGTCGTATTGACGC1400GATCGACATCAGCACGGGTCGTACGCTGTGGTCGGTCGAACGTGCTGCGG1450CGAACTATTCGCCCGTCTTGTCGACCGGCGGCGGCGTTCTGTTCAACGGT1500GGTACGGATCGTTACTTCCGCGCCCTCAGCCAAGAAACCGGCGAGACCCT1550GTGGCAGACCCGCCTTGCAACCGTCGCGTCGGGCCAGGCCATCTCTTACG1600AGGTTGACGGCATGCAATATGTCGCCATCGCAGGTGGTGGTGTCAGCTAT1650GGCTCGGGCCTGAACTCGGCACTGGCTGGCGAGCGAGTCGACTCGACCGC1700CATCGGTAACGCCGTCTACGTCTTCGCCCTGCCGCAATAA1740SEQIDNO：2信息(i)序列特征：(A)长度：1740个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓朴：线型(ii)分子类型：DNA(基组)(iii)原始来源：生物：氧化葡糖杆菌菌株：DSM4025(iv)特征：特征关键：CDS位置：1..1737测序方法：EATGAAGACGTCGTCTTTGCTGGTTGCGAGCGTTGCCGCGCTTGCAAGCTA50TAGCTCCTTTGCGCTTGCTCAAGTGACCCCCGTCACCGATGAATTGCTGG100CGAACCCGCCCGCTGGTGAATGGATCAGCTACGGTCAGAACCAAGAAAAC150TACCGTCACTCGCCCCTGACGCAGATCACGACTGAGAACGTCGGCCAACT200GCAACTGGTCTGGGCGCGCGGCATGCAGCCGGGCAAAGTCCAAGTCACGC250CCCTGATCCATGACGGCGTCATGTATCTGGCAAACCCGGGCGACGTGATC300CAGGCCATCGACGCCAAAACTGGCGATCTGATCTGGGAACACCGCCGCCA350ACTGCCGAACATCGCCACGCTGAACAGCTTTGGCGAGCCGACCCGCGGCA400TGGCGCTGTACGGCACCAACGTTTACTTTGTTTCGTGGGACAACCACCTG450GTCGCCCTCGACACCGCAACTGGCCAAGTGACGTTCGACGTCGACCGCGG500CCAAGGCGAAGACATGGTTTCGAACTCGTCGGGCCCGATCGTGGCAAACG550GCGTGATCGTTGCCGGTTCGACCTGCCAATACTCGCCGTTCGGCTGCTTT600GTCTCGGGCCACGACTCGGCCACCGGTGAAGAGCTGTGGCGCAACTACTT650CATCCCGCGCGCTGGCGAAGAGGGTGATGAGACTTGGGGCAACGATTACG700AAGCCCGTTGGATGACCGGCGTCTGGGGTCAGATCACCTATGACCCCGTT750GGCGGCCTTGTCCACTACGGCTCGTCGGCTGTTGGCCCGGCTTCGGAAAC800CCAGCGCGGCACCACCGGCGGCACCATGTACGGCACCAACACCCGTTTCG850CTGTCCGTCCCGAGACTGGCGAGATCGTCTGGCGTCACCAAACTCTGCCC900CGCGACAACTGGGACCAAGAGTGCACCTTCGAGATGATGGTTGCCAACGT950TGACGTGCAGCCCGCAGCTGACATGGACGGCGTCCGCTCGATCAACCCGA1000ACGCCGCCACCGGCGAGCGTCGCGTTCTGACCGGCGTTCCGTGCAAAACC1050GGCACCATGTGGCAGTTCGACGCCGAAACCGGCGAATTCCTGTGGGCCCG1100TGACACCAGCTACGAGAACATCATCGAATCGATCGACGAAAACGGCATCG1150TGACCGTCGACGAGTCGAAAGTTCTGACCGAGCTGGACACCCCCTATGAC1200GTCTGCCCGCTGCTGCTGGGTGGCCGTGACTGGCCGTCGGCTGCGCTGAA1250CCCCGATACCGGCATCTACTTTATCCCGCTGAACAACACCTGCATGGATA1300TCGAAGCTGTCGACCAGGAATTCAGCTCGCTGGACGTGTACAACCAAAGC1350CTGACCGCCAAAATGGCACCGGGTAAAGAGCTGGTTGGCCGTATCGACGC1400CATCGACATCAGCACAGGCCGCACCCTGTGGACCGCTGAGCGCGAAGCCT1450CGAACTACGCGCCTGTCCTGTCGACCGCTGGCGGCGTTCTGTTCAACGGC1500GGCACCGACCGTTACTTCCGCGCTCTCAGCCAAGAGACCGGCGAGACCCT1550GTGGCAGACCCGTCTGGCGACTGTCGCTTCGGGCCAAGCTGTCTCGTACG1600AGATCGACGGCGTCCAATACATCGCCATCGGCGGCGGCGGCACGACCTAT1650GGTTCGTTCCACAACCGTCCCCTGGCCGAGCCGGTCGACTCGACCGCGAT1700CGGTAATGCGATGTACGTCTTCGCGCTGCCCCAGCAATAA1740SEQIDNO：3信息(i)序列特征：(A)长度：1740个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双链(D)拓朴：线型(ii)分子类型：DNA(基组)(iii)原始来源：生物：氧化葡糖杆菌菌株：DSM4025(iv)特征：特征关键：CDS位置：1..1734测序方法：EATGAAACTGACGACCCTGCTGCAAAGCAGCGCCGCCCTGCTTGTGCTTGG50CACCATTCCCGCCCTTGCCCAAACCGCCATCACCGATGAAATGCTGGCGA100ACCCGCCCGCTGGTGAATGGATCAACTACGGTCAGAACCAAGAGAACTAC150CGCCACTCGCCCCTGACGCAGATTACCGCAGACAACGTCGGCCAACTGCA200ACTGGTCTGGGCGCGCGGTATGGAAGCGGGCAAGATCCAAGTGACCCCGC250TTGTCCATGACGGCGTCATGTATCTGGCAAACCCCGGTGACGTGATCCAG300GCCATCGACGCCGCGACCGGCGATCTGATCTGGGAACACCGCCGCCAACT350GCCGAACATCGCCACGCTGAACAGCTTTGGTGAGCCGACCCGCGGCATGG400CCCTCTATGGCACCAACGTCTATTTCGTCTCGTGGGACAACCACTTGGTC450GCGCTGGACACCTCGACCGGCCAAGTCGTATTCGACGTCGATCGCGGTCA500AGGCACGGATATGGTCTCGAACTCGTCCGGCCCGATTGTCGCCAATGGCG550TCATCGTTGCGGGCTCGACCTGTCAGTATTCGCCGTTCGGCTGTTTCGTT600TCGG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-20-15-10LeuLeuAlaAlaProAlaPheAlaGlnValThrProValThrAsp
-515GluLeuLeuAlaAsnProProAlaGlyGluTrpIleSerTyrGly
101520GlnAsnGlnGluAsnTyrArgHisSerProLeuThrGlnIleThr
253035ThrGluAsnValGlyGlnLeuGlnLeuValTrpAlaArgGlyMet
404550GlnProGlyLysValGlnValThrProLeuIleHisAspGlyVal
556065MetTyrLeuAlaAsnProGlyAspVolIleGlnAlaIleAspAla
707580LysThrGlyAspLeuIleTrpGluHisArgArgGlnLeuProAsn
859095IleAlaThrLeuAsnSerPheGlyGluProThrArgGlyMetAla
100105110LeuTyrGlyThrAsnValTyrPheValSerTrpAspAsnHisLeu
115120125ValAlaLeuAspThrAlaThrGlyGlnValThrPheAspValAsp
130135140ArgGlyGlnGlyGluAspMetValSerAsnSerSerGlyProIle
145150155ValAlaAsnGlyValIleValAlaGlySerThrCysGlnTyrSer
160165170ProPheGlyCysPheValSerGlyHisAspSerAlaThrGlyGlu
175180185GluLeuTrpArgAsnTyrPheIleProArgAlaGlyGluGluGly
190195200AspGluThrTrpGlyAsnAspTyrGluAlaArgTrpMetThrGly
205210215AlaTrpGlyGlnIleThrTyrAspProValThrAsnLeuValHis
220225230TyrGlySerThrAlaValGlyProAlaSerGluThrGlnArgGly
235240245ThrProGlyGlyThrLeuTyrGlyThrAsnThrArgPheAlaVal
250255260ArgProAspThrGlyGluIleValTrpArgHisGlnThrLeuPro
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