鉴定区分中国红豆杉属种和品种的核苷酸序列和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药用观赏植物种质资源的鉴定技术领域，特别涉及一种鉴定区分中国 红豆杉属种和品种的核苷酸序列和方法。
【背景技术】
[0002] 红豆杉属植物为常绿小乔木或灌木，雌雄异株，为典型的阴性树种，基本无纯林存 在。由于其耐荫性较好，如套种在其他用材林下，既可改善林相景观效果、又可提高林地综 合经济效益。由于种群竞争力弱、天然更新缓慢和地理分布局限等客观因素，红豆杉属植物 早在80年代就被列入国家二级保护植物，90年代以来，随着抗癌新药紫杉醇的开发利用， 红豆杉原料供需矛盾日益突出，人类掠夺式的生产经营活动，加剧了其濒危程度。1999年我 国将红豆杉属的全部植物种列入国家一级保护植物。
[0003] 根据最新的中国植物志英文版，中国红豆杉属下共有5个种，分别为密叶红豆 杉（Taxus fuana)、须弥红豆杉（Taxus wallichiana var. wallichiana)、红豆杉（Taxus wallichiana var. chinensis)、南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei)、以及东北 红豆杉（Taxus cuspidata)。国内外的研宄已表明，红豆杉是获得紫杉醇的最佳药源植物来 源之一，同时具有重要药用价值和优良园林观赏价值。由于栽培历史悠久，红豆杉的种间或 种内杂交常有发生，再加之从形态分类学的角度很难区分不同的红豆杉种枝叶，品种与紫 杉醇含量都难以保证，这已成为中国红豆杉属植物产业发展的瓶颈。有研宄证实不同种的 红豆杉在形态特征、生物量及紫杉醇含量等方面都有较大差异。目前在红豆杉遗传分化和 遗传多样性研宄方面，除了采用形态解剖学、细胞学和植物化学等方法外，在分子水平上系 统地对中国红豆杉属下的种和品种的遗传背景、亲缘关系的研宄报道较少。
[0004] 随着现代分子生物学的研宄深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多 态性（RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、ISSR标记、AFLP技术等得到了广泛应用。这些方 法各具优势但也存在很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAH)方法可 以很好的揭示亲缘物种间的演化关系，但受试验条件限制较大且不稳定；ISSR标记具有快 速、简便及多态性高等优点，但其引物通用性较差，操作要求高花费大。
[0005] ITS序列是中度重复序列，广泛分布于基因组并且是同步进化的，它的碱基序列同 源性的程度决定了生物之间的亲缘关系的远近，并以此作为分类依据来划分物种。本发明 结合以上分子标记的方法和技术优点，依据分子标记技术的原理，设计出一对特异引物进 行PCR反应，目的是提出一种特异性鉴定红豆杉种的分子鉴别方法，为中国红豆杉属的种 和品种的鉴别提供依据，并希望得到广泛的实际应用与推广。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的是针对目前存在的红豆杉种和品种问题，提供一种鉴定中国红 豆杉属植物的引物，从DNA水平上分析红豆杉种质资源的遗传特性，为区分中国红豆杉属 植物的种和品种提供有效的分子标记，为中国红豆杉属植物的种和品种的真伪鉴定和质量 优劣鉴定、及筛选优良种质等奠定基础。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明设计一种红豆杉属植物的PCR检测特异引物对， 其中包括正向引物序列TITS1 :5' -GG AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，反向引物序列TITS2 : 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0008] 本发明还提供了一种利用上述核苷酸序列鉴定区分中国红豆杉属植物的种和品 种的方法。
[0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0010] 鉴定中国红豆杉属植物的种和品种的核苷酸序列，该序列来源于须弥红豆杉原变 种的rDNA的ITS序列（GenBank中序列编号为EF660577. 1)，具体如SEQ ID NO. 1所述。
[0011] 利用上述核苷酸序列鉴定区分中国红豆杉属植物的种和品种的方法，收集测试样 品的茎、叶（花）芽、或叶片，按照下述主要步骤进行鉴定工作：
[0012] (1)总DNA的提取及纯化
[0013] 取待检植物的叶片、叶（花）芽或茎，用无菌水处理后，在液氮中研成粉末，用 QIAGEN试剂盒提取总DNA。
[0014] (2)PCR 反应
[0015] 以步骤⑴提取得到的DNA样品为模板进行PCR反应。所用引物分别 为，正向引物序列 TITS1 :5' -GG AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，反向引物序列 TITS2 : 5 ' -TCCTCCGCTTAITGATATGC-3 '。PCR 反应体系为：10 X PCR buf f er (含 Mg2+) 2 y L，2. 5mM dNTPs 2 y L，10 y M 引物 TITS1/TITS2 各 1 y L，DNA 模板 1 y L，5U/ y L Taq 酶 0? 2 y L，加灭 菌双蒸水至终体积为20 y L ;PCR程序为：94°C预变性3min ;94°C变性30s，54°C退火40s， 72°C延伸lmin，共30个循环；再72°C延伸lOmin。
[0016] (3) PCR产物检测与纯化
[0017] 将步骤（2)获得的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；并用QIAGEN试剂盒或其他方 法纯化，按试剂盒操作指南进行。
[0018] (4)DNA序列测定
[0019] 将步骤（3)纯化后的产物直接进行测序，得到待检样品的ITS1区碱基序列。
[0020] (5) DNA序列数据分析及种类的鉴别
[0021] 将步骤⑷获得的喊基序列通过MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 5. 05分子进化遗传分析软件中的CLUSTAL W对序列进行排列并人工校正，采用 邻接法构建NJ系统树进行聚类分析，其中个分支的置信度用自展检验法检验，共进行2000 次循环，评价各分支系统学意义与可靠性。最终根据序列比对和聚类分析的结果鉴别区分 中国红豆杉属植物的种和品种。
[0022] 为了使测定结果尽可能准确可靠，每一个样品从提取总DNA、PCR扩增、产物纯化， 到测序、分析等重复进行多次。
【附图说明】
[0023] 图1为利用本发明设计的特异性引物进行的PCR检测，鉴定中国红豆杉属植物的 种和品种的电泳结果。
[0024]图 1 中：M为DNA MARKer DL2000，l-8分别为曼地亚红豆杉（Taxus x media)、欧 洲红豆杉（Taxus baccata)、密叶红豆杉（Taxus fuana)、须弥红豆杉（Taxus wallichiana var. wallichiana)、红豆杉（Taxus wallichiana var. chinensis)、南方红豆杉（Taxus wallichiana var.mairei)、假种皮黄色的南方红豆杉假种皮黄色（Taxus wallichiana var. mairei yellow)、以及东北红豆杉（Taxus cuspidata)。
[0025] 图2为不同材料ITS序列聚类分析结果图。
[0026] 以红豆杉科穗花杉（Amentotaxus argotaenia)为外类群（GenBank系列号为 AF259285. 1)进行分析。从图中可以清楚的区分不同的红豆杉种：曼地亚红豆杉是欧洲红 豆杉和东北红豆杉的自然杂交种，可以看出这三者亲缘关系较近；须弥红豆杉种下的须弥 红豆杉原变种、南方红豆杉、红豆杉聚为一类；自然变异为黄色假种皮的南方红豆杉与其原 变种的亲缘关系最近。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述
[0028] 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例
[0029] 实施例
[0030] 本实施例测定了来自不同种源地的8份红豆杉属种质资源的rDNA ITS1序列，分 别为：中国红豆杉属下的5个种（及1个自然突变品系），包括密叶红豆杉（Taxus fuana)、 须弥红豆杉（Taxus wallichiana var. wallichiana)、红豆杉（Taxus wallichiana var. chinensis)、南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei)、假种皮黄色的南方红豆杉 (Taxus wallichiana var. mairei yellow)、东北红豆杉（Taxus cuspidata)，以及国外的 2 个种，曼地亚红豆杉（Taxus x media)和欧洲红豆杉（Taxus baccata)。以红豆杉科穗花杉 (Amentot