一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预 后的生物标志物组合及其应用。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是一种原发于大肠的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。结直肠癌因其发 部位不同而表现出不同的临床症状及体征，主要有腹痛、便血、腹部包块、肠梗阻等，伴或不 伴贫血、发热和消瘦等全身症状。在我国，结直肠癌作为第=大肿瘤，其发病率及死亡率近 年来逐年上升。由于诊断技术的不断提高，使新发结直肠癌病例中非转移性疾病的比例大 大增加，对于该部分患者，外科手术及辅助化疗是主要治疗手段。但是目前尚缺乏有效的预 后判断及化疗疗效评价指标。目前临床上主要依据基于临床病理指标（如肿瘤大小、淋己 结转移数目、远处转移、组织分级等）的?m分期作为疾病预后的判断及指导临床治疗，但 根据此分期判断患者预后存在较大的异质性，亦不能预测肿瘤患者对化疗的反应。
[0003] 研究表明II、111期结直肠癌患者经过标准治疗后仍有20% -30%出现复发，其中 40 -50 %复发发生在原发灶切除后一年内，80 %复发发生在原发灶切除=年内，复发后5年 生存率低于1%。约有50%结直肠癌患者最终会进展为转移性疾病而死亡。转移性结直肠 癌患者仅有极少数可W经手术及化疗而得到治愈，全身化疗是该类患者的主要治疗方法， W氣尿喀晚药物为基础联合奥沙利销或者伊立替康方案已成为晚期结直肠癌的标准治疗 方案。此外，近年来抗血管生成药物（贝伐珠单抗）或表皮生长因子单抗（西妥昔单抗或 帕巧单抗）联合标准化疗使有效率进一步提高，但有相当一部分病人在治疗时出现化疗药 物耐药甚至开始即出现不敏感最终因疾病进展而死亡。因此，筛选出对化疗敏感的人群在 临床实践中显得尤为重要，可使化疗无效人群避免不必要的毒副作用及承担巨大的经济负 担，但至今尚没有有效的手段用于化疗药物敏感人群的选择，寻求有效的标志物用于化疗 敏感性指标具有极大的应用前景。
[0004] 微小核糖核酸（microRNA,miRNA)是一类长约19至23个核巧酸的非编码单链小 核糖核酸分子，其主要功能是参与基因转录后水平调控。miRNA通过与祀mRNA3'端非 翻译序列完全或部分互补结合，导致祀mRNA降解或转录后翻译抑制从而调控祀基因的表 达。miRNA参与1/3人类蛋白编码基因调控，它与多种生理活动有关，如生长发育、细胞增 殖、细胞调亡、细胞分化等；也与许多疾病的发生发展密切相关，如糖尿病、屯、血管疾病、月中 瘤等。最近的研究显示h^33，miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥抑癌基因或癌基因样作用。 已证实，肿瘤组织和肿瘤细胞中的某些miRNA表达水平发生了变化，相对于正常组织，一些 miRNA表达量显著上升或下降。许多癌组织如肺癌、乳腺癌和食管癌等组织都有若干组织特 异性miRNA的表达，提示miRNA有肿瘤组织特异性。另外，miRNA的表达也与肿瘤分化程度 W及预后有关。最近，大量的研究结果揭示，miRNA在血清中能长期稳定存在，耐RNA酶的 降解，一些肿瘤包括非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌和膜腺癌患者血清中miRNA 表达谱与正常人有显著差异，均有各自特异的表达谱，同时该种变化还可见于早期癌中。该 种稳定存在于血清中的循环miRNA因其用于肿瘤等疾病的早期诊断、预后及疗效判断从而 指导个体化治疗显示出潜在的临床应用前景。
[0005]目前尚没有利用无创伤性、取材方便的血液标本检测与转移性结直肠癌化疗疗效 及预后生物标志物相关的特异性miRNA组合及检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就在于通过对患者接受化疗前的血清样本miRNA进行检测和比对， 分析miRNA表达水平与化疗敏感性的关系，联系患者的生存资料及治疗效果，筛选一组与 转移性结直肠癌化疗疗效及预后相关的血清miRNA,并利用该些miRNA的化qMan探针制备 出适用于临床诊疗用途的试剂盒，为预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性提供特异性的W 及迅速的无创伤性检测手段。
[0007]W下是对本发明的进一步描述：
[0008] -种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNA组合，其包括下列 miRNA;miR- 13化及miR- 208b。
[0009] 上述miRNA组合的筛选方法包括W下步骤（见图1):
[0010] (1)分别收集12例对奥沙利销（F0LF0幻敏感和不敏感患者化疗前混合血清样本， 提取总RNA;
[0011] (2)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的低密度巧片技术（TaqManlowdensity Arraytechnology)进行miRNAs检测，筛选在化疗敏感组（PR+SD)及不敏感组（PD)间稳定 差异表达的一组miRNA;
[0012] (3)用实时巧光定量PCR方法（TaqMan探针法）对一组标本进行逐个检测，从低密 度巧片方法初筛出的miRNA中复筛出表达差异显著miRNA;
[0013] (4)进一步用定量PCR方法对大批量标本进行逐个验证，筛选出稳定的表达差异 显著的一组miRNA。
[0014] 具体来说，上述筛选方法包括W下步骤；（1)收集接受奥沙利销（F0LF0幻患者化 疗前混合血清或血浆样本，提取总RNA;(2)运用低密度巧片技术对上述RNA进行检测，初筛 出在化疗敏感组（PR+SD)及不敏感组（PD)间稳定差异表达的一组miRNA;(3)将抽提的RNA 逆转录为cDNA，采用巧光定量PCR订aqMan探针法）对初筛出的miRNA进行复筛和验证，挑 选出稳定、特异表达的一组miRNA。
[001引本发明使用的检测方法可W选自；RT-PCR方法、低密度巧片技术（TaqManlow densityArraytechnology)、Real-timePCR方法中的一种或几种。例如，血清中miRNA 分子的检测方法包括W下步骤：
[0016] (1)使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取血清总RNA;
[0017] (2)通过RNA逆转录反应得到cDNA;
[001引 （3)利用化qMan探针法进行PCR反应；
[0019] (4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；
[0020] (5化B染色后在紫外灯下观察结果。
[0021] 本发明还提供了一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNA 化qMan探针组合物，包括miR- 13化和miR- 208b的化qMan探针。
[0022] 上述化qMan探针组合物优选包括W下序列所示的化qMan探针中的一种或多种：
[0023]
【主权项】
1. 一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNA组合，其特征在于该 miRNA组合包括下列miRNA:miR- 135b和miR- 208b。
2. -种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNATaqMan探针组合物，其 特征在于该TaqMan探针组合物包括权利要求1所述miRNA的TaqMan探针。
3. 根据权利要求2所述的TaqMan探针组合物，其特征在于所述miRNA的TaqMan探针 序列为：SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2。
4. 权利要求1所述的miRNA组合在制备检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的试 剂或工具中的应用。
5. 权利要求1所述的miRNA组合在制备预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的试剂或 工具中的应用。
6. 权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物在制备检测转移性结直肠癌化疗疗效和 /或预后的试剂或工具中的应用。
7. 权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物在制备预测转移性结直肠癌患者化疗敏 感性的试剂或工具中的应用。
8. -种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的试剂盒，其特征在于该试剂盒 包含权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物。
9. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还可以包括Taq酶、dNTP、氯 化镁和不含Mg2+的10XPCR缓冲液PCR缓冲液。
10. -种用于预测转移性结直肠癌患者化疗敏感性的试剂盒，其特征在于该试剂盒包 含权利要求2或3所述的TaqMan探针组合物。
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的生物标志物组合及其应用。所述miRNA组合包括：miR-135b、miR-208b。所述试剂盒包括上述miRNA的TaqMan探针组合。在本发明中，血清较易获得，无需其它组织，属于无创性检查；血清miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，以其作为化疗疗效和预后标志物可以提高检测的准确性；所述试剂盒简化了TaqMan探针库，减少制作成本和生产时间，增加了针对性和实用性，提高了检测的灵敏度和特异性；所述组合、方法、试剂盒不仅能够用于转移性结直肠癌化疗疗效判断，还能用于转移性结直肠癌化疗的预后判断。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104774916
【申请号】CN201410794712
【发明人】张辰宇, 巴一, 曾科, 李佳璐, 陈熹
【申请人】南京大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2014年12月18日