一种催化灯标及其制备方法以及用催化灯标测定痕量铀的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学分析领域中痕量铺的英光检测方法，特别是涉及一种催化灯标及 应用催化灯标快速、准确、高灵敏度和高选择性检测痕量铺(铺含量）的方法。
【背景技术】
[0002] 铺是一种天然放射性金属元素，在能源和军事领域中有着重要的应用，是核能源 和核武器生产重要的原材料。铺虽然在人类的生产、生活中发挥重要作用，但也是一种常见 的放射性污染源。已有研究表明，铺核素可直接经过呼吸道、皮肤、直接照射等途径进入人 体，也可通过生物循环经食物链进入人体，从而引发白血病等癌症和一些肾脏、神经系统疾 病巧日急性肾病、己尔干综合症等)。随着科学技术的进步，核电站和核武器数量逐渐增多， 人们暴露于铺福射环境中的概率不断增加，尤其是在发生核泄漏事故时情形更为严重。例 女口，1984年切尔诺贝利核泄漏事故后前3个月内有31人死亡，之后15年内有6-8万人死 亡，13. 4万人遭受各种程度的福射疾病折磨，方圆30公里地区的11. 5万多民众被迫疏散。 因此，铺含量的监控对人们健康、生产安全、环境保护具有极其重要的意义。
[0003] 目前，铺含量的测定方法包括紫外脉冲英光法巧Ij立坤，郭冬发，李斌凯等，铺矿地 质，2011,27(3) : 180)、电感禪合等离子体光谱法(胡明松，分析化学，2005, 33(2) : 173)、 电感禪合等离子体质谱法化UOM.B.,HuB.,化angX.,etal,Anal}ftical Qiemistry, 2010, 82, 282)、激光英光法化ehmannS,GeipelG.,GramboleG.et al.Spectrochim.ActaA:Mol.Biomol.Spectrosc. , 2009, 73 巧）：902)等。上述方法或因仪 器昂贵、使用成本较高（电感禪合等离子体质谱法)，或因操作过程繁琐、流程长（电感禪合 等离子体光谱法)，或因灵敏度低、选择性差(紫外脉冲英光法）等原因在实际应用中仍显不 足。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种高灵敏及对铺高选择性的催化灯标及其制备方法。
[0005] 本发明所提供的催化灯标，为用于测定痕量铺的催化灯标，由DNA酶和底物DNA两 部分杂交形成，DNA酶序列的3'末端为连续的4个鸟嘿岭脱氧核巧酸（G)，底物DNA的序列 中间具有一个腺嘿岭核巧酸（rA)，底物DNA的5'末端用4-甲基-6-駿基罗丹明（TAMRA) 英光染料修饰。
[0006] 其中，所述DNA酶的核巧酸序列由序列表中序列1表示。所述底物DNA的核巧酸 序列由序列表中序列2表示。
[0007] 所述DNA酶和底物DNA杂交比例为1. 5:1 (摩尔质量比）。
[000引催化灯标的制备方法为：将DNA酶和底物DNAW1. 5:1的比例(摩尔质量比）混匀 后于沸水浴中反应2-10分钟(优选5分钟)，然后在1-2小时内逐渐冷却至15-25C(优选 2(TC)，最后放入0-l(TC(优选4°C)冰箱中冷藏至少30分钟，使DNA酶与底物DNA充分杂 交，得到催化灯标。本段括号中优选内容的组合为催化灯标制备的优选方案。
[0009] 本发明另一目的是提供一种快速、准确、高灵敏度和高选择性的用催化灯标测定 痕量铺(铺含量）的方法。
[0010] 本发明用所述催化灯标测定痕量铺的方法，将DNA酶与底物DNA混合杂交形成所 述催化灯标，加入到待测样品体系中反应，测定已知浓度硝酸铺醜离子的英光强度和样品 的英光强度并计算得到样品中的铺含量。
[0011] 具体的，所述痕量铺的测定方法包括W下步骤：
[0012] 1)、测定反应体系中已知浓度硝酸铺醜离子的英光强度，绘制标准曲线；
[0013] 2)、测定样品反应体系中的英光强度Alp;
[0014] 3)、用算式C咖2化=(AIf-83.67) /3. 41计算样品中铺含量C咖2)2+。
[00巧]所述反应体系中包括；40微升50mmol/L2-(N-吗啡晰）己賴酸（MES)缓冲溶液 (P册.5)、40微升1. 6Xl〇-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L化C1溶液、40微升已知浓度的 硝酸铺醜离子溶液或样品溶液、W及200微升二次蒸觸水；反应温度15-25C(优选2(TC)， 反应时间5-15分钟(优选10分钟)，W加入100微升50mmol/LH轻甲基氨基甲焼（Tris)缓 冲溶液（P服.0)终止反应。
[0016] 英光强度的测定采用F-7000英光分光光度计，并设定仪器参数为：激发波长： 525nm;发射波长；550-700nm;电压；700V;狭缝；lOnm。
[0017] 绘制标准曲线中已知浓度硝酸铺醜离子溶液浓度范围为1. 121-112.Inmol/L。
[001引 50mmol/L2-(N-吗啡晰）己賴酸（MES)缓冲溶液（P册.5)配制过程为：准确称 取0.4880g的MES固体粉末，溶解于二次蒸觸水中，用Imol/L化0H调抑至5. 5,定容至 50.OmL;
[0019] 50mmol/LH轻甲基氨基甲焼（Tris)缓冲溶液（P服.0)配制过程为；准确称取 0. 3028gTris碱、24. 0500g尿素，加水溶解后加入10. 0mL2mol/L邸TA，然后用浓盐酸调pH 至8.0,定容至100血。
[0020] 本发明用催化灯标测定痕量铺(铺含量）的原理是：当DNA酶与底物DNA杂交形成 催化灯标后，底物DNA5'-末端的TAMRA英光染料与DNA酶3'末端的G碱基靠近，发生从 TAMRA到G碱基的电子能量转移，从而使TAMRA的英光被G碱基巧灭；当催化灯标与铺共存 时，铺催化DNA酶从底物DNA中间的rA碱基断裂，释放其5'端的单链片段，从而使TAMRA 远离G碱基，英光增强，
[0021] 采用W上技术方案，本发明用催化灯标测定痕量铺(铺含量）的方法明显优于现有 检测技术，具有W下优点：
[0022] 1)检测速度快；15分钟之内即可完成；
[0023] 2)准确度高；相对标准偏差RSD为3. 1 % ;
[0024] 3)灵敏度高巧检测低至1. 121nmol/L的铺；
[00巧]4)选择性好；一般金属离子即使溶度高于1000倍也不干扰测定；
[002引 5)操作简单：仅2个步骤；
[0027]6)对仪器设备要求低；仅需英光分光光度计；
[0028] 7)成本低廉；每个样品的测试成本不高于200元；
[0029] 8)应用范围广；可用于水样、±壤、矿石、空气等样品分析，适合大面积推广和应 用。
[0030] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0031] 图1为催化灯标与不同浓度硝酸铺醜离子相互作用的英光光谱图
[0032] 图2为催化灯标与硝酸铺醜离子相互作用的标准曲线
[0033]图3为催化灯标与硝酸铺醜离子相互作用不同时间的动态曲线
[0034] 图4为催化灯标与硝酸铺醜离子及其它金属离子相互作用的选择性分析结果
【具体实施方式】
[00巧]实施例在W本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0036] 实施例、催化灯及其制备W及用催化灯标测定痕量铺(铺含量）
[0037] 实验材料：
[003引DNA酶和底物DNA由Takara公司合成，DNA酶的核巧酸序列为： 5 '-CACGTCCATCTCTGCAGTCGG GTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGGGG-3'(序列表中序列 1)， 黑色下划线部分的碱基与底物DNA互补配对；底物DNA的核巧酸序列为；5'-TAMRA-往T￡A￡ TATrAGGAAGAGATGGACGTG-3' (序列表中序列2)，黑色下划线部分的碱基与DM酶互补配对。
[0039]硝酸铺醜（U〇2 (N03)2? 6&0)为商购。
[0040] 2-(N-吗啡晰）己賴酸（MESXH轻甲基氨基甲焼（Tris)、邸TA购于Sigma公司。
[0041] 主要仪器设备：
[0042] 英光分光光度计；型号F-7000,日立高新技术公司；
[0043] 电子天平；型号FA1204B(M)，上海精密科学仪器有限公司；
[0044] 超声波清洗仪：型号KQ2200E，昆山市超声波仪器有限公司；
[0045] 恒温水浴锅；型号HH-W0-5,上海一科仪器有限公司。
[0046] 本实施例用催化灯标测定痕量铺(铺含量)，包括W下内容：
[0047] 1、制备催化灯标
[004引将DNA酶和底物DNAW1. 5:1的比例娘摩尔质量比)混匀后于沸水浴中反应2-10 分钟(优选5分钟)，然后在1-2小时内逐渐冷却至15-25C(优选2(TC)，最后放入0-l(TC (优选4°C)冰箱中冷藏至少30分钟，使DM酶与底物DM充分杂交，得到催化灯标。
[0049] 2、绘制标准曲线
[0050] 2. 1配制溶液
[0051] 使催化灯标与硝酸铺醜离子(或其它离子）相互作用的缓冲溶液(作用缓冲液）； [005引50mmol/L(抑5. 5) 2-(N-吗啡晰）己賴酸（MES)缓冲溶液：准确称取0. 4880g的 168固体粉末，溶解于二次蒸觸水(重蒸水）中，然后用111101/1化地调抑至5.5，定容至 50.OmL;
[0053] 2mol/L化Cl溶液；准确称取5. 8440g的化Cl固体粉末，溶解于二次蒸觸水中，然 后定容至50.0 mL。
[0054] 终止催化灯标与硝酸铺醜离子(或其它离子）相互作用的缓冲溶液(终止缓冲液）；
[0055]50mmol/L(p服.0)H轻甲基氨基甲焼（Tris)缓冲溶液（8mol/L尿素，200mmol/LEDTA);准确称取0. 3028gTris碱、24. 0500g尿素，加水溶解后加入10. 0mL2mol/LEDTA，然 后用浓盐酸调抑至8. 0,定容至100血。
[005引2. 2硝酸铺醜（U02 (N03)2? 6&0)与催化灯标的相互作用
[0057] 1)催化灯标与硝酸铺醜离子相互作用：将40微升50mmol/L2- (N-吗啡晰）己賴 酸（MES)缓冲溶液（P册.5,作用缓冲液)、40微升1. 6Xl〇-7mol/L催化灯标、80微升2mol/L化Cl溶液依次与 40 微升浓度分别为 0、1. 121、5. 605、11. 21、33. 62、56. 04、77. 47、112. 1、 242. 2nmol/L的硝酸铺醜离子溶液、200微升二次蒸觸水(重蒸水）混匀，于15-25C(优选 20°C)反应5-15分钟(优选10分钟）；
[005引2)终止催化灯标与硝酸铺醜离子相互作用；加入100微升50mmol/LH轻甲基氨 基甲焼（Tris)缓冲溶液（P服.0,终止缓冲液）终止反应；
[0059] 3)反应结束后，在F-7000英光分光光度计上设定W下参数：激发波长；525nm，发 射波长；550-700皿，电压；700V，狭缝；10皿，测定英光光谱。
[0060] 测得各溶液英光光谱如图1 (横坐标表示；波长，纵坐标表示：英光强度；1为催化 灯标对照，2为催化灯标+1. 121nmo