一种以内标为基础的苹果锈果类病毒rt-pcr检测技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术。
【背景技术】
[0002]苹果锈果病又名花脸病或裂果病，是对苹果危害较重的非潜隐性病毒之一，也是中国苹果病毒的重要检疫对象，广泛分布于东北、西北、华北各苹果产区，发病严重的果园病株率高达30 %以上，有扩大蔓延的趋势；当今技术水平下，尚无有效的防治药剂，采用脱毒方法繁殖无病毒苗木是目前最为有效的防治手段，准确、灵敏、快速的检测技术是果树无毒化栽培的关键环节和基本保障；但因病毒在树体内含量低、分布不均、受外界因素影响大、组织富含多糖、多酚等特点，在检测过程中易出现假阴性现象，目前，国内外已有ASSVdPCR检测的报道，但尚未见以内标为基础的ASSVd RT-PCR检测技术的报道；本发明开发了含有nad 5内标基因的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术，成功克服了假阴性现象，为该病毒的准确检测、无毒苗木的高效繁育奠定基础，为今后苹果病毒病的有效防治提供理论依据。
【发明内容】
[0003]本发明建立了一种以内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术，本发明所采用的技术方案:提取苹果组织总RNA，以苹果锈果类病毒及一种苹果内源基因为引物，通过RT-PCR方法扩增苹果锈果类病毒及苹果内源基因的特异性序列，苹果内源基因起到排除假阴性对照的作用，最后通过凝胶电泳观察扩增产物，判定组织中是否含苹果锈果类病毒，本发明的具体内容，即以内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术的具体方法如下:
(1)苹果组织总RNA的提取以带有叶芽一年生枝条顶端0~5cm皮层组织为试材，采用针对富含多糖多酚组织的RNA提取改良法提取总RNA，定容于20 μ L除RNase水中，-80°C保存备用；
(2)病毒特异性基因序列的扩增以步骤(I)获得的总RNA为模板，进行RT-PCR得到扩增产物。以ASSVdQCxin和nad 5为引物，M-MLV反转录酶进行cDNA合成，两对引物分别为:苹果锈果类病毒引物:ASSVdQCxin-3’:CACCAGTTCCGCTGTGGGTTC，ASSVdQCxin-5’:GCCTACAAGAACGTACGGTGTTGA G，第 2 对苹果内源基因引物-,nad 5-3;:CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA，/?ai/ 5~W:GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测取5UL PCR扩增产物(苹果锈果类病毒特异性片段大小为330 bp，苹果内源基因rmd 5#异性片段大小为181 bp), 1.5%琼脂糖凝胶在I XTAE缓冲液中进行电泳分析，100V电泳40分钟，EB染色后，观察结果，根据电泳条带有无及大小判断是否带毒；
本发明专利的有益效果是，通过设计苹果锈果类病毒特异性引物及能够排除假阴性现象的苹果内源基因引物，进行检测体系及程序的优化，建立了一种利用内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术体系，避免了常规PCR的假阴性结果，检测稳定性好，特异性强，可用于田间样本及组培苗带毒情况的快速检测，为苹果无毒苗木的繁育提供技术支持，为苹果锈果类病毒病害防控奠定基础，减少病害造成的损失。
【附图说明】
[0004]图1是田间果树携带苹果锈果类病毒情况的RT-PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0005]以带有叶芽苹果一年生枝条顶端0~5 cm皮层组织为试材，取100 mg组织，在液氮中迅速研磨，加0.5 mL提取试剂(400 yL RNA提取试剂+100 μ?β-巯基乙醇)进行提取，最后加入20 μ L DEPC水充分溶解RNA。然后以特异性引物ASSVdQCxin和nad 5为引物，M-MLV反转录酶进行cDNA合成，以合成的cDNA为模板，配制以下PCR反应体系:cDNA模板 3.0 yL，ASSVdQCxin-3’(20 pmol/^L) I μ L，ASSVdQCxin-5’(20 pmol/^L) I μ L，nad 5~?> (20 pmol/M-L)0.1 μ L, nad 5^5，(20 pmol/M-L) 0.1 μ L，2 X ES Taq Mastermix12.5 μ L，用ddH20补足25 μ L ;PCR程序为:预变性94°C 3 min ;35个循环:94°C变性Imin，6L 0°C退火 45 s，72°C延伸 30 s ;72°C终延伸 10 min ;取 5 μ L PCR 扩增产物，L 5%琼脂糖凝胶在IXTAE缓冲液中进行电泳分析，100V电泳40分钟，EB染色后，观察结果，根据电泳条带有无及大小判断是否带毒(ASSVd特异性片段大小为330 b^,nad 5#异性片段大小为181 bp)。
【主权项】
1.一种以内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术，其特征在于通过提取苹果组织总RNA，采用苹果锈果类病毒及一种苹果内源基因的特异性引物，通过RT-PCR方法扩增锈果类病毒及苹果内源基因特异性序列，凝胶电泳观察扩增产物有无及大小，判定组织是否带毒。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)苹果组织总RNA的提取以带有叶芽一年生枝条顶端0~5cm皮层组织，采用针对富含多糖多酚组织的RNA提取改良法提取总RNA，定容于20 μ L除RNase水中，_80°C保存备用; (2)病毒特异性基因序列的扩增以步骤(I)获得的总RNA为模板，以ASSVdQCxin和irnd 5"为引物，以M-MLV反转录酶合成cDNA，两种引物为:苹果锈果类病毒引物:ASSVdQCxin-3’:CACCAGTTCCGCTGTGGGTTC ;ASSVdQCxin_5’:G C C TACAAGAACGTACGGTGTTGA G，苹果内源基因引物-,rmd 5~?>':C T C C AGTCACCAACATTGGCATAA ；nad 5-5':GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGT T，以合成的cDNA为模板，配制以下反应体系进行PCR扩增:cDNA模板3.0μ L，ASSVdQCxin-3’(20 pmol/^L) I μ L，ASSVdQCxin-5’(20 pmol/^L) I μ L, nad 5^3'(20 pmol/M-L)0.1 μ L, nad ?5^5' (20 pmol/M-L) 0.1 μ L, 2 X ES Taq Mastermix 12.5 μ L,用ddH20补足25 yL ;PCR程序为:预变性94°C 3 min ;35个循环:94°C变性I min，61.0°C退火 45 s，72°C延伸 30 s ;72°C终延伸 10 min ； (3)琼脂糖凝胶电泳检测及判断标准取5UL PCR扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶在IXTAE缓冲液中进行电泳分析，100V电泳40分钟，EB染色后，观察结果，根据电泳条带有无及大小判断是否带毒；苹果锈果类病毒330 bp，苹果内源基因Z7ai/ 5#异性片段大小为.181 bp ;判断标准为:未扩增出内源基因特异性片段即代表实验失败；扩增出内源基因特异性片段即代表实验有效；扩增出内源基因特异性片段及锈果类病毒特异性片段即代表苹果组织中带有锈果类病毒；扩增出内源基因特异性片段，未扩增出锈果类病毒特异性片段即代表组织中不带有锈果类病毒。
【专利摘要】本发明涉及一种以内标为基础的苹果锈果类病毒RT-PCR检测技术。以带有叶芽苹果一年生枝条顶端0~5cm皮层组织为试材，采用RNA提取改良法提取组织总RNA，以总RNA为模板，苹果锈果类病毒特异性引物和苹果内源基因引物进行RT-PCR反应，根据琼脂糖凝胶电泳中扩增产物的有无和大小判断苹果组织是否携带苹果锈果类病毒。判断标准为：未扩增出内源基因特异性片段即代表实验失败；扩增出内源基因特异性片段即代表实验有效；扩增出内源基因特异性片段及苹果锈果类病毒特异性片段即代表苹果组织中携苹果带锈果类病毒；扩增出内源基因特异性片段，未扩增出苹果锈果类病毒特异性片段即代表组织中不携带苹果锈果类病毒。
【IPC分类】C12R1/94, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN104962662
【申请号】CN201510449388
【发明人】王亚南, 杨金凤, 曹克强
【申请人】河北农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月29日