一种生产依诺肝素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种控制生产依诺肝素的方法，该方法利用选自肝素酶I和肝素酶II两种肝素酶来降解肝素从而生产低分子量肝素的方法。
【背景技术】
[0002]肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1 — 4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖的重复单位的线性链状结构，其分子量在3000-37000Da之间，在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂使用。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，从而大大限制了肝素在临床上的应用。
[0003]依诺肝素(依诺肝素寡糖)(简称LMWH)的分子量通常是指在3000_8000Da之间，且分子量可以在4000Da、5000Da、6000Da、7000Da或其在3000_8000Da内的任何组合之间。与普通肝素相比，通过体内、体外实验发现，在同等剂量下，依诺肝素的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。此外，依诺肝素还具有一些其它优势，如分子量小，生物利用度高，血浆半衰期长；不与肝素结合蛋白结合，因此有更稳定的量效关系，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；较少与血小板结合，不易引起血小板减少。所以依诺肝素既能有效防止血栓形成，又能减少出血等不良反应，是一种安全有效的抗血栓药物，可作为肝素的替代物。
[0004]依诺肝素制备主要是传统的化学裂解法工艺。肝素酶法制备依诺肝素具备生产条件温和，环境友好，能耗低，效率高等优点，因此，如何开发高效清洁低成本的酶法制备低分子量肝素工艺关键在于如何降低酶的成本。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种控制生产依诺肝素的方法，使用肝素酶的混合物。
[0006]具体的，涉及一种控制生产依诺肝素的方法，利用肝素酶I和肝素酶II来降解硫酸乙酰肝素钠生产依诺肝素。具体步骤如下:
1、将硫酸乙酰肝素钠溶入水中，搅拌，将其全部溶解；
2、用盐酸溶液调PH至3.0-4.5，然后升温，升温至85-90°C，静止，搅拌；
3、将溶液降温至40°C -55 °C，用氢氧化钠溶液调PH至6.0-8.0，加入0_30g/亿单位肝素酶I和0-45g/亿单位肝素酶II，静止分层，过滤，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液；
4、清液和离心液用弱碱性离子交换树脂吸附，用氯化钠洗脱，连续洗脱两遍，静止沉淀，取沉淀物，用乙醇溶解，静置，弃去上层液，用真空栗通抽干；
5、在真空干燥箱中，烘干，得产品即为依诺肝素。
[0007]有益效果本发明用酶解法所产出的依诺肝素:重均分子量在8000Da以下，抗Xa因子大于70IU/mg,以及抗Xa/抗Ila大于1.5。
【具体实施方式】
[0008]实施例1
1、将50g硫酸乙酰肝素钠溶入水中，搅拌，将其全部溶解；
2、用盐酸溶液调PH至3.0，然后升温，升温至85°C，静止，搅拌；
3、将溶液降温至40°C，用氢氧化钠溶液调PH至6.0，加入45g/亿单位肝素酶II，静止分层，过滤，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液；
4、清液和离心液用弱碱性离子交换树脂吸附，用氯化钠洗脱，连续洗脱两遍，静止沉淀，取沉淀物，用乙醇溶解，静置，弃去上层液，用真空栗通抽干；
5、在真空干燥箱中，烘干，得依诺肝素。其重均分子量为7559Da，抗Xa因子50IU/mg，以及抗Xa/抗Ila大于1.3。
[0009]实施例2
1、将50g硫酸乙酰肝素钠溶入水中，搅拌，将其全部溶解；
2、用盐酸溶液调PH至4.5，然后升温，升温至90°C，静止，搅拌；
3、将溶液降温至55°C，用氢氧化钠溶液调PH至7.5，加入30g/亿单位肝素酶I，静止分层，过滤，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液；
4、清液和离心液用弱碱性离子交换树脂吸附，用氯化钠洗脱，连续洗脱两遍，静止沉淀，取沉淀物，用乙醇溶解，静置，弃去上层液，用真空栗通抽干；
5、在真空干燥箱中，烘干，得依诺肝素。其重均分子量为7420Da，抗Xa因子61IU/mg，以及抗Xa/抗Ila大于1.0。
[0010]实施例3
1、将50g硫酸乙酰肝素钠溶入水中，搅拌，将其全部溶解；
2、用盐酸溶液调PH至4.0，然后升温，升温至85°C，静止，搅拌；
3、将溶液降温至45°C，用氢氧化钠溶液调PH至6.5，加入加入20g/亿单位肝素酶I，25g/亿单位肝素酶II，静止分层，过滤，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液；
4、清液和离心液用弱碱性离子交换树脂吸附，用氯化钠洗脱，连续洗脱两遍，静止沉淀，取沉淀物，用乙醇溶解，静置，弃去上层液，用真空栗通抽干；
5、在真空干燥箱中，烘干，得依诺肝素。其重均分子量为6110Da，抗Xa因子85IU/mg，以及抗Xa/抗Ila大于1.6。
【主权项】
1.一种生产依诺肝素的方法，其特征在具体步骤如下: (1)将硫酸乙酰肝素钠溶入水中，搅拌，将其全部溶解； (2)用盐酸溶液调PH，然后升温，升温至85-90°C，静止，搅拌； (3)降温，用氢氧化钠溶液调PH，加入肝素酶I和肝素酶II，静止分层，过滤，留上清液待沉淀，下层沉淀放离心机离心，离心后留上层离心液； (4)清液和离心液用弱碱性离子交换树脂吸附，用氯化钠洗脱，连续洗脱两遍，静止沉淀，取沉淀物，用乙醇溶解，静置，弃去上层液，用真空栗通抽干； (5)烘干:在真空干燥箱中，烘干，得产品即为依诺肝素。2.根据权利要求1所述的方法，步骤(2)所用的盐酸的浓度为2mol/L，用盐酸调节PH的范围为3.0-4.5。3.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)中降温的温度范围为40°C_55°C，所述氢氧化钠的浓度为4mol/L，调PH的范围为6.0-8.0，肝素酶I和肝素酶II，其浓度分别为0_30g/亿单位，0_45g/亿单位。4.根据权利要求1所述的方法，所产出的依诺肝素:重均分子量在8000Da以下，抗Xa因子大于70IU/mg，以及抗Xa/抗Ila大于1.5。
【专利摘要】本发明公开一种依诺肝素的生产方法。该方法利用选自肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ（肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ是酶的名称）降解肝素从而生产依诺肝素。
【IPC分类】C12P19/26, C08B37/10
【公开号】CN105420315
【申请号】CN201510905229
【发明人】刘冠男, 周晓娜, 夏衬来
【申请人】青岛九龙生物医药有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月10日