一种果胶酯酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种果胶酯酶及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 天然木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，主要由纤维素、半纤维素和木质 素组成，还有少量果胶、树胶、藻胶、蛋白、琼脂和金属离子等成分，结构非常复杂。木质纤维 素结构组成复杂，是植物对抗外界侵扰的天然屏障，同时也制约了降解利用这一生物资源 相关技术的开发。
[0003]果胶是植物初级细胞壁的重要组分。果胶等组分的存在对于木质纤维素的抗降解 特性起到了不可忽视的作用。因此，高效降解木质纤维素不仅需要纤维素降解酶的作用，其 他一些辅助酶类如果胶酶的添加有利于促进木质纤维素的降解。
[0004]果胶酯酶是果胶酶的一种，该酶可以脱去果胶的半乳糖醛酸聚糖主链上的甲氧 基，形成果胶酸，从而破坏细胞壁的紧密结构，使细胞壁及胞层间结构发生局部松散，因此 具有重要的木质纤维素降解功能。
[0005]细菌来源的果胶酯酶具有易于异源表达、可以交底成本大量获取、随时pH及最适 反应温度范围较广的优点。目前果胶酯酶绝大多数来自于植物，其次是来自真菌，来自细菌 的果胶酯酶较少，且对细菌来源的果胶酯酶的克隆表达多来自菊欧文氏杆菌，产品性状单 一、降解能力较低、热稳定性交底、不利于工业应用。因此有必要开发一种新的具有强果胶 降解能力的果胶酯酶，从而与现有的果胶酯酶和/或纤维素酶复配使用，提高果胶的降解效 果进而促进木质纤维素的降解利用效率。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新的细菌来源的具有强果胶降解能力的果胶酯酶及 其编码基因和它们在生物降解中的应用；以及含有所述果胶酯酶基因的表达载体和工程 菌。
[0007]为了达到以上目的，本发明的发明人从一个高效降解纤维素的混合菌群中成功克 隆表达了与克雷伯氏杆菌果胶酯酶具有同源性的果胶酯酶，所述果胶酯酶由SEQIDNO. 1 所示的氨基酸序列组成。
[0008] 应当理解的是，本领域技术人员可以根据SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列在不影 响其活性的条件下，对该序列进行取代、缺失或插入一个或几个氨基酸序列以获得具有同 等活性的果胶酯酶。
[0009] 本发明还提供了所述果胶质酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0010] 本发明所提供的基因包括为所述果胶酯酶编码的核酸序列。应当理解的是，由于 密码子具有简并性以及不同物种密码子所具有的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使 用适合特定物种表达的密码子，在本发明中，所述核苷酸序列采用了细菌偏爱性密码子。
[0011] 本发明还提供了含有所述基因的表达载体。
[0012] 本发明还提供了含有所述基因的工程菌。
[0013] 本发明还提供了所述工程菌在生物降解中的应用。
[0014] 进一步的，所述应用为秸杆降解。
[0015] 进一步的，所述应用包括将所述果胶酯酶与纤维素酶复配使用，应用于生物降解。
[0016] 进一步的，所述果胶酯酶与纤维素酶的重量比为1:0.8-1.2。
[0017] 相对于100g的秸杆，所述果胶酯酶的用量为800-1200mg。
[0018] 本发明所提供的果胶酯酶具有降解能力强、纯化工艺简便、对原料的利用率高的 优点。本发明提供的果胶酯酶、编码基因、表达载体和工程菌，可以应用于生物降解机理特 别是果胶和木质纤维素降解的研究，并可以进行商业化利用，获得商业价值。
【附图说明】
[0019] 图1为PCR产物胶回收纯化检测电泳图；
[0020] 图2表达载体物理图谱；
[0021] 图3为重组蛋白SDS-PAGE分析电泳图；
[0022] 图4为果胶酯酶与纤维素酶协同降解菊芋秸杆还原糖产量统计图。
【具体实施方式】
[0023] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。
[0024] 实施例1
[0025] (1)文库来源和质粒
[0026] 菌群EMSD5宏基因组fosmid克隆文库和pET-22b
[0027] (2)主要试剂
[0028] StarPrep快速DNA胶回收试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司，DNA柱纯化 试剂盒购自ZymoResearch公司，EcoRI和XhoI购自大连TaKaRa公司。
[0029] (3)方法
[0030] 1)基因的克隆分离、测序、表达载体构建。
[0031] 以菌群EMSD5宏基因组fosmid克隆文库为模板，以SEQIDN0:3所示的序列为上游 引物，SEQIDN0:4所示的序列为下游引物。采用50yL反应体系进行PCR反应，
[0032] 反应体系为：5Xbuffer10yL，dNTP4yL，正反向引物各2yL，DNA模板lyL，Phusion 酶0.25yL，补水至50yL。
[0033] PCR条件：98°Clmin; 98°C10s，60°C20s，72°Clmin，10 个循环；98°C10s，65°C20s，72 °〇1111；[11，20个循环;72°010111；[11。
[0034] PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收分子量约为1300bp的片段后进行测序验 证，测序结果显示为SEQIDN0:2所示的核苷酸序列（如图1所示，其中Μ为Marker; 1为果胶 酯酶PCR产物）。
[0035] 将测序验证正确的核苷酸片段用EcoRI和XhoI进行双酶切，之后与同样经双酶 切的pET-22b进行连接，连接体系为：2Xbuffer5yL，T4连接酶lyL，双酶切后的PCR产物和pET-22b共4yL，4°C连接过夜。用连接液转化E.coliDH5a，在含Amp的LB平板上挑取单克隆 菌落，接种于含Amp的LB液体培养基，抽提质粒进行双酶切鉴定和测序验证，获得含有果胶 酯酶基因的表达载体pET-22b-pme，表达载体物理图谱如图2所示。
[0036] 2)E.coliBL21(DE3)的转化和果胶酯酶基因的诱导表达
[0037] 将鉴定正确的表达载体转化E.coliBL21(DE3)，取150yL转化菌液涂布于LB平板 上，37°C培养至出现单克隆菌落，并用含有空载体pET-22b的菌株作为空白对照;从转化平 板上挑取单克隆菌落至3mL含Amp的LB液体培养基中，37°C，150rpm振荡培养至0D6Q() = 0.5， 取lmL菌液接种于100mL含Amp的LB液体培养基，37°C，200rpm振荡培养至0D6q() = 0.5~1.0。 将上述培养液分成2份50mL，其中一份加入终浓度为lmmol/L的IPTG，另一份作为未诱导对 照，25°C，200rpm诱导培养20h左右，以含有空载体pET-22b的菌株作为空白对照，通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现。
[0038] 3)重组工程菌酶液提取
[0039] 将培养诱导所得菌液10000g离心5min，取菌体沉淀悬浮于1Xlysisbuffer(50mmol/LNaH2P〇4,300mmol/LNaCl，pH8.0)，超声波破碎细胞，离心取上清液即得粗酶 液，将粗酶液利用NiSepharose?6FastFlow纯化系统进行纯化得到纯酶，将细胞提取物 和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白表达情况和纯化效果（结果如图3所示，Μ为 Marker;1为未诱导的细胞提取物、2为诱导后细胞提取物、3-4为纯化后的酶）。
[0040] 实施例2
[0041] 实施例2用于说明果胶酯酶与纤维素酶协同降解菊芋秸杆的情况。
[0042] 反应在lmL的50mmol/L，pH5.0的柠檬酸盐缓冲液中进行，反应温度为45°C，添加 2 %的菊芋猜杆粉末作为底物，加入10mg/g(蛋白/底物)纯化的果胶酯酶和10mg/g(蛋白/底 物）的纤维素酶Cellulase'Onzuka'R10，以单独添加纤维素酶Cellulase'Onzuka'R10为对 照，反应48h后取样于沸水浴加热20min使酶失活，利用3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原 糖含量(单独添加纤维素酶的还原糖产量为2.llmg/ml，添加纤维素酶和果胶酯酶的还原糖 产量为2.60mg/ml。），发现添加果胶酯酶可以使纤维素酶水解底物产生的还原糖含量提高 23%，结果参见图4，48小时后还原糖产量，CEL为纤维素酶，PME为果胶酯酶。
[0043] 实施例3
[0044] 实施例3用于说明利用本发明所述的工程菌中果胶酯酶活力情况。
[0045] 将实施例1诱导培养的菌液于4°C，10000g离心5min，弃去上清，取菌体沉淀悬浮于 1XlysisbufTer(50mmol/LNaH2P〇4,300mmol/LNaCl，pH8 · 0)，超声波破碎细胞，4°C， lOOOOg离心5min，收集上清液即得到粗酶液。
[0046] 酶活测定方法:取100yL粗酶液，加至900yL预热的0.5%果胶溶液(pH5.0)，45°C反 应60min，沸水浴加热20min使酶失活。
[0047] 取 50yL酶解产物与 100yL1^8-!1(：1(10〇111111〇1/14!17.5)，4(^1^酚试剂]\?1'!1(311^/ mL)和10yL乙醇氧化酶AO(l.OUAxL)混匀后，30°C孵育20min，之后加入200yL硫酸铁铵-氨基 磺酸(各5mg/mL)，室温静置20min后，用去离子水将体积补至lmL，分光光度计测定A62〇nm值， 根据甲醇标准曲线计算甲醇产量和酶活力。
[0048] 粗酶液中果胶酯酶的活力为0·075U/mL。
[0049] 对比例1
[0050] 利用Chakiath等在2009年报道的方法以甜菜渣为底物，利用3,5_二硝基水杨酸比 色法测定单独添加商品果胶酶PectinexUltraSPL的还原糖产量和同时添加Pectinex UltraSPL及经改造提高了热稳定性的来自菊欧文氏杆菌的果胶酯酶PMEA的还原糖产量， 结果发现水解72小时后，单独添加PectinexUltraSPL的还原糖产量为39g/L，添加 PectinexUltraSPL和PMEA的还原糖产量为47g/L，果胶酯酶提高还原糖产量的比例为 20% 〇
[0051] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种果胶酯酶，其特征在于： 1) 由SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列组成，或 2) 在SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或几个氨基酸序列所 获得的具有同等活性的酶。2. 权利要求1所述的果胶质酶的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDN0:2所 不。3. 含有权利要求2所述基因的表达载体。4. 含有权利要求2所述基因的工程菌。5. 权利要求1所述的果胶酯酶或者权利要求4所述的工程菌在生物降解中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为秸杆降解。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将所述果胶酯酶与纤维素酶复配使用， 应用于生物降解。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述果胶酯酶与纤维素酶的重量比为1: 0.8~1.2 〇9. 根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于，相对于100g的秸杆，所述果胶酯酶的用 量为800-1200mg。
【专利摘要】本发明涉及一种新的果胶酯酶及其编码基因和应用，本发明所提供的果胶酯酶具有降解能力强、纯化工艺简便、对原料的利用率高的优点。本发明提供的果胶酯酶、编码基因、表达载体和工程菌，可以应用于生物降解机理特别是果胶和木质纤维素降解的研究，并可以进行商业化利用，获得商业价值。
【IPC分类】C12N15/74, C12N9/18, C12P19/02, C12N1/21
【公开号】CN105462944
【申请号】CN201510945876
【发明人】袁红莉, 林宇剑, 杨金水, 李宝珍
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月16日