Dna聚合酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA聚合酶及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] DNA聚合酶是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶，以DNA为复制模板，将DNA由 5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、 dNTP等的情况下)及其相辅的活性。
[0003] 耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中。各种耐热DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活 性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除错配，切平末端； 5 ' _3 '外切酶活性可以消除合成障碍。
[0004] 超嗜热古菌PalaecoccuspacificusDY20341分离自东太平洋洋中脊热液区，其 基因组测序已经完成。预测一共有2001个开放阅读框，其中78.11%没有确定的生物学功 能。
[0005] 尽管商业化的DNA聚合酶多种多样，针对不同扩增目的片段所需的特异DNA聚合酶 体系仍然是必要的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种DNA聚合酶。
[0007] 本发明所提供的DNA聚合酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种编码DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如序列表 中序列3所示。
[0009] 本发明的又一个目的是提供一种重组表达载体，其多克隆位点上插入有所述的编 码DNA聚合酶的基因。
[0010] 本发明的再一个目的是提供一种重组菌，其含有所述的重组表达载体。
[0011] 其中，所述重组菌为大肠杆菌。
[0012] 所述的DNA聚合酶可在PCR中应用。
[0013] 本发明的又一个目的是提供一种获得目的基因的方法，所述方法包括如下步骤：
[0014] 根据目的基因的序列设计引物，
[0015]以含有目的基因的DNA片段或基因组DNA为模板，利用所设计的引物和所述的DNA聚合酶进行PCR，
[0016] 分离PCR产物获得目的基因。
[0017] 其中，卩〇?的缓冲液包括1^8(口!18.8)2〇111]\1，]\^5〇42111]\1，1((：11〇111]\1，（順4)23〇41〇111]\1， TritonX-100 0.5mg/L，dNTP0.2mM。
[0018] 本发明的又一个目的是提供一种PCR反应试剂盒，所述试剂盒包括所述的DNA聚合 酶。
[0019] 其中，所述试剂盒还包括PCR的缓冲液，所述PCR的缓冲液包括Tris(pH8 · 8)20mM， MgS〇42mM，KCl 10mM，（NH4)2S04l0mM，TritonX-100 0.5mg/L，dNTP 0.2mM。
[0020] 本发明的DNA聚合酶，来自超噬热广古菌PalaeococcuspacificusDY20341，具有 DNA聚合酶活性。利用本发明的DNA聚合酶，成功扩增出了古菌Thermococcussp.4557的大 小不同的基因。此外，使用本发明的DNA聚合酶成功扩增出了商业化的PfuDNA聚合酶所不 能扩增的Thermococcussp· 4557的GQS-01815基因。
【附图说明】
[0021 ] 图1显示PalaeococcuspacificusDNA聚合酶编码基因片段敲除示意图。
[0022] 图2显不PalaeococcuspacificusDNA聚合酶基因的克隆；
[0023] 其中，M:DNA分子量标准，1:Ρο1Β-片段1，2:Ρο1Β-片段2,3:PolB基因。
[0024] 图3显示SDS-PAGE电泳分析PolB聚合酶纯化后的蛋白；
[0025] 其中，M:蛋白分子量标准，l:PolBDNA聚合酶。
[0026] 图4显示了利用PolB聚合酶PCR扩增出不同的DNA片段。
[0027]图5显示了PCR扩增Thermococcussp.4557中GQS_01815基因的结果。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] 1.获取目的基因（PolB基因）
[0030] PalaeococcuspacificusDY20341 基因组序列如GenBankAssembly:GCA_ 000725425.1所示。根据生物信息学方面的基因组和蛋白组分析，获得假定的Palaeococcus pacificusDY20341耐热DNA聚合酶(PolB)序列，如序列表中序列1所示。然而，体外无法获 得可溶性的耐热DNA聚合酶。针对编码假定的PalaeococcuspacificusDY20341耐热DNA聚 合酶的DNA序列(如序列2所示)进行分析，发现该序列可能包含内含子。
[0031 ] 因此，针对编码假定的PalaeococcuspacificusDY20341耐热DNA聚合酶的DNA序 列设计引物，通过缺失突变的方法(如图1)将内含子敲除。
[0032]引物序列如下：
[0033] FI: 5 ' -GATATACATATGATTCTCGACACTGATTAC-3 '（下划线为Nde頂每切位点）；
[0034] R1:5 '-CGATTATGGATGGGTAAAGCGACCTGAAATCTAAATAAACG-3 '；
[0035] F2:5 '-CGTTTATTTAGATTTCAGGTCGCTTTACCCATCCATAATCG-3 '
[0036]R2:5 ' -GCTGTAGTCGACACTTTTTGGCTTCAACCAAGC-3 '（下划线为Sal頂每切位点）。
[0037] 首先，以PalaeococcuspacificusDY20341基因组DNA为模板分别使用F1和R1引 物对以及F2和R2引物对，将被假定的内含子隔开的2个PolB的片段(片段1和片段2)分别扩 增出来。然后将2个扩增出的片段等比例混合作为进一步扩增的模板，使用F1和R2引物对， 将假定的PolB基因扩增出来。
[0038] ?〇?反应体系为5(^1，包括1^8(?!18.8)2〇1111，]\%5〇421111，1((：11〇111]\1，（顺4)23〇41〇1111， TritonX-100 0.5mg/L，dNTP0.2mM，上下游引物各50ymol/L，模板DNA100ng，lylPfuDNA 聚合酶ΙμL。
[0039] PCR反应条件：预变性 94°C3min，变性 94°C30s，退火 55°C30s，延伸 72°Cl_2min，30 个循环，后延伸72°C10min，4°C终止反应。
[0040]琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，分别获得了 1241bp的片段1和1131bp的片段2以 及2341bp的PolB基因。
[0041 ] 2.原核重组表达载体构建
[0042]利用酶切连接的方法进行重组表达载体的构建，使用NdeI和SalI双酶切克隆载 体pET-15b(Novagen)，参照说明书使用T4连接酶在16°C下将NdeI和SalI双酶切的PolB基 因与线性化的PET-15bΜ连接，构建出原核重组表达载体，将原核重组表达载体转化到 E.coliTop10感受态细胞中，挑取氨苄抗性筛选为阳性的菌落，进行菌落PCR验证，验证阳 性的结果送上海美吉生物测序。测序结果如序列表中序列3所示，其编码的蛋白序列如序列 表中序列4所示。
[0043] 3.重组蛋白的原核表达及体外纯化
[0044]将构建的原核重组表达载体转化进入表达性的大肠杆菌体内，通过调节IPTG浓度 以及表达温度对目的基因