一种基于肥大细胞-巨噬细胞共培养微流控芯片的构建及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于肥大细胞-巨噬细胞共培养微流控芯片的构建及其应用，属于食品质量分析检测领域。
【背景技术】
[0002]食物过敏原是指食物中能引起机体免疫反应的抗原分子，水产品作为人类重要的食源性蛋白质的主要来源，其中虾、蟹等甲壳类水产品所引起的过敏症在临床反应中最为常见。食品过敏症是在全世界范围内广泛流行的一类常见变态反应性疾病，其具有症状种类繁多、病症情况复杂、危害广泛、难以彻底根治的特点，长期以来一直都是困扰医学界的一大难题。近年来，在全世界范围内，随着食品过敏症的发病率不断上升，对食物过敏的预防和检测已经成为一项迫切的需求，但由于目前尚无有效治疗食物过敏症的方法，而避免进食含有致敏原的食物是唯一的预防手段，因此建立一种或多种灵敏检测过敏原的分析方法显得尤为重要。
[0003]现有检测过敏病症的方法主要分为以下两大类:体内检测和体外检测。虽然体内检测对医生或是病人来说都是最方便可靠的方法，但是其潜在的风险无法忽视，需要谨慎对待。在我国，对过敏原的体外检测尚未得到大力重视，传统的诊断模式依旧在使用，这不但不利于对过敏疾病的及时确诊和治疗，也会给病人带来额外的身心痛苦。由于过敏原种类众多，且因同个体而多变化，因此建立多种快速灵检测过敏原的方法来取代体内试验成为迫切需要。
[0004]细胞是形成有机体形态和功能的基本组成单位，对研究机体结构和探索生命活动具有重要意义。细胞传感技术以活细胞作为探测元件，通过对活细胞的基本生理性质或细胞对被测物的响应进行检测，从而定性定量地确定细胞的生理状态或被检物的含量。因此，细胞传感技术对于研究细胞的结构和功能、探索生命的活动和规律、疾病的诊断和治疗、药物的设计和筛选、食品安全的监督和检测等都具有十分重大的意义。随着生命工程技术的发展与信息技术的飞跃，各学科间的交叉融合，使得细胞传感检测研究得到了飞速发展，新型的纳米材料、荧光及电化学细胞传感器不断问世，极大推动了生物传感技术地迅猛发展。
[0005]近年来，微流控细胞芯片己被广泛运用于临床检测和疾病治疗领域，通过在微型芯片上集成多种功能单元，可实现对被检样品的完整检测，包括进样、反应、分离、输出等操作。早在1998年，Whitesides等就提出了采用软光刻技术在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基础上制备微流控芯片的想法，并开发了多层微流通道实现了微流栗、阀等对微流体的良好控制。相比传统的分析方法，微流控芯片具有样品量需求量少，污染小，响应时间短，分析效率高的特点。此外PDMS材料透明便于观察，有利于精确控制实验过程，满足批量化生产和高通量的需求。固定有细胞的微流控芯片能在细胞和分子水平上对细胞活动(如细胞增殖生长、固定迀移、内吞外排、药物作用)等进行分析。
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的上述不足，本发明建立了肥大细胞与巨噬细胞共培养体系(二维细胞)的PDMS微流控芯片平台，成功应用于食品过敏原识别评价研究。本发明实现肥了大细胞与巨噬细胞共培养体系(二维细胞)的PDMS微流控芯片平台。采用特殊流道设计，采用“张力阀道”实现了对两种细胞的非直接接触共培养，从而能够精确控制两种细胞共培养过程，从而有效的研究细胞旁分泌机制，以及通过在PDMS基底表面电镀金电极，借助电化学阻抗信号对共培养中细胞的生理活动实时监测。通过以上设计，构建了用于食品过敏原识别评价研究的细胞共培养微流控芯片平台。
[0007]本发明的第一个目的是提供一种PDMS微流控芯片，所述TOMS微流控芯片的主要结构一 PDMS流道层，由两条平行等长的主通道构成，通道两端设有插槽以便注入液体;两条主通道通过一条毛细管道垂直联通。
[0008]所述PDMS微流控芯片是将电化学技术与微流控芯片相结合设计得到的，由PDMS流道层和镀金硅片层这两部分组成;所述毛细管道的两端设计有插孔，用于插入微型参比电极;每一条主通道底面电镀一枚金电极;所述I3DMS微流控芯片还包括键合在PDMS流道层下的镀金硅片层，镀金硅片层表面电镀四组金电极(如图2)，每个工作电极的引导线将工作电极和芯片边缘的金手指(供电极夹固定)相连接，在工作电极的前方是半圈电镀金层作为对电极，其也由电镀导线连接到芯片边缘的金手指上;所述微流控芯片的TOMS流道层与镀金硅片层键合在一起构成完整芯片。
[0009]所述?015流道层全长44670.83口111、宽3120(^111、厚4111111，由2条宽100(^111，长31673.16μπι的平行主通道构成;每条主通道的两端是直径为2500μπι的插槽，通过该插槽细胞悬液、培养液、以及致敏药物能够由此注入两条主流道中；两条主通道中间是有一条直径为ΙΟΟμπι、长ΙΟΟΟΟμπι的张力阀道，即毛细管道。
[0010]所述PDMS微流控芯片是将电化学技术与微流控芯片相结合设计得到的；在毛细管道两端设计出直径为2000μπι的插孔，用于插入微型Ag/AgCl参比电极;每一条主通道底面电镀一枚金电极;在PDMS流道层下键合有镀金硅片层，镀金硅片层电镀四组金电极，每个工作电极的直径为ΙΟΟΟμπι，直径为500μπι引导线将工作电极和芯片边缘宽为4000μπι的金手指相连接，在工作电极的前方是半圈宽为100ym的电镀金层作为对电极，对电极也由宽500μπι的电镀导线连接到芯片边缘的金手指上;将PDMS流道层与镀金硅片层键合在一起构成完整得到PDMS微流控芯片。
[0011 ]所述PDMS微流控芯片中，当两条主通道内同时同向等速流动细胞悬液或者培养液时，毛细管道的两端因为压力相同，使平行的两条主通道连通;而当平行主通道的其中一个主通道停止栗入流体，则另一个主通道内的液体就会通过毛细管道流入该通道内，从而实现两平行主通道的联通。即当压力相同时，两条主通道自己连通;而压力不同时，一条主通道的液体通过压力差流过毛细管通道流入另一个通道。
[0012]本发明的第二个目的是提供一种细胞共培养的方法，是利用所述PDMS微流控芯片进行共培养。
[0013]在本发明的一种实施方式中，所述细胞共培养，是指共培养肥大细胞和巨噬细胞。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述细胞共培养，是将RBL-2H3肥大细胞和ANA-1巨噬细胞先在培养皿中培养2-3天，使细胞处于对数生长期，然后再用于芯片上培养。
[0015]在本发明的一种实施方式中，所述芯片上的培养，是使用注射器分别吸取肥大细胞悬液和巨噬细胞悬液、拍气泡，然后定速控制(速度一般控制在200yL/h?0.lmL/h)，使两个注射器中的细胞悬液以相同流速注入芯片中，当芯片两条通道内注满两种细胞悬液后，同时停止两台注射栗的运作，将芯片放入CO2培养箱中孵育6小时(保证细胞的贴壁，防止培养基的流动冲刷对细胞生长的影响)，然后将注射器更换为不含细胞的新鲜培养液(用于肥大细胞的为DMEM、巨噬细胞的为RPM1-1640)，再使注射器中培养液同时启动两台注射栗持续栗入(端口不封闭)，以相同流速继续培养细胞。
[0016]在本发明的一种实施方式中，所述芯片上的培养，当需要研究巨噬细胞与肥大细胞的相互作用时，在培养箱中孵育后，只启动两台栗中的一台(另一端封闭)，即研究巨噬细胞对肥大细胞影响时只启动巨噬细胞一端的栗，反之则只启动肥大细胞一端的栗，从而使一条流道内的细胞代谢物随着液体通过张力阀流入另一条细胞流道内，达到共培养的目的。
[0017]在本发明的一种实施方式中，所述PDMS微流控芯片进行共培养，指经高压灭菌和紫外照射后的微流控芯片，用5ml注射器吸取细胞悬液后并架设在XSPOl注射栗上，采用安装在笔记本上的操作程序控制栗的运作，调节栗的流速将细胞悬液注入到微通道中；待注射栗将细胞悬液把细胞芯片的流道充满时，停止栗的流速，将芯片放置于CO2培养箱中孵育6小时，保证细胞的贴壁，防止培养基的流动冲刷对细胞生长的影响。待细胞完全贴壁之后，将内装不含细胞的新鲜培养液的注射器栗连接芯片一端的进口，并使用电脑软件调节一定的流速，向芯片内连续不断的供给培养液，从而达到连续培养的目的。
[0018]本发明的第三个目的是提供所述PDMS微流控芯片在食品过敏原检测方面的应用。
[0019]所述应用，是在PDMS微流控芯片中的巨噬细胞和肥大细胞共培养体系、巨