前列腺癌分类的制作方法
【专利摘要】提供了用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方法，其包括测定来自所述受试者的样品中的CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、OAT、PI15、PTGS2、RHOBTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一种的表达水平。所述方法可用于预测转移的可能性。还公开了用于诊断和选择用于前列腺癌的治疗的方法，连同相应的治疗方法。还提供了用于执行所述方法的系统、试剂盒和计算机程序。
【专利说明】前列腺癌分类 发明领域
[0001] 本发明涉及前列腺癌。提供了依赖于生物标志物的用于表征和预后前列腺癌的方 法。还描述了可用于所述方法中的抗体、试剂盒和系统。
[0002] 发明背景
[0003] 前列腺癌是具有15.3%的终生发病率的男性中最常见的恶性肿瘤(Howlader 2012)。 基于1999-2006的数据，约80%的前列腺癌患者呈现临床上限于前列腺的早期疾病(Altekruse 等人2010)，其中约65%通过手术切除或放射疗法治愈(Kattan等人1999，?〇1111(1等人1999)。35% 将发展PSA复发，其中约35 %将发展局部或转移性复发，这是不可治愈的。目前，不清楚哪些具 有早期前列腺癌的患者可能发展复发，并且可能得益于更强烈的疗法。目前的预后因素诸如通 过Gleason评分测量的肿瘤分期具有预后价值，但显著数目的被认为是较低分期(7或更小)的那 些仍然复发，并且一定比例的更高分期肿瘤则没有。此外，在Gleason 7肿瘤的预后中存在显著 异质性(Makarov等人2002, Rasiah等人，2003)。此外，已经变得明显的是，Gleason评分的分期已 经改变，导致Gleason评分的分布随着时间变化(Albertsen等人2005, Smith等人，2002) 〇
[0004] 现在清楚的是，源自同一解剖部位的大多数实体瘤代表许多在分子水平不同的实 体(Perou等人2000) ANA微阵列平台允许从存档的石蜡包埋组织同时分析数以万计的转录 物，并且理想地适合于鉴定分子亚组。这种方法已经鉴定了实体瘤诸如乳腺癌(van ' t Veer 等人2002)和结肠癌(Bertucci等人2004)中的具有转移潜能的原发性癌症。
[0005] 发明描述
[0006] 本发明基于前列腺癌生物标志物的鉴定和验证。
[0007] 本发明人已经鉴定了在分子水平类似于转移性疾病的一组原发性前列腺癌。这些肿瘤 通过几个基因和限定途径的表达损失来定义;此外，该组通过导致参与有丝分裂的基因表达增加的 原癌基因 F0XM1的活化来定义。已经定义了该亚组内可以鉴定肿瘤的一系列生物标志物，其具有 多变量预后能力，并且可以用于前瞻性if价肿瘤是否处于增加的复发和/或转移发展的可能性中。
[0008] 因此，在第一个方面，本发明提供用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方 法，其包括：
[0009] 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平：
[0010] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0011] 其中测定的表达水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后。
[0012] 根据本发明的所有方面，所述前列腺癌可以是原发性前列腺癌。
[0013] 根据本发明的一个进一步方面，提供了用于诊断受试者中的具有增加的转移潜能 的前列腺癌的方法，其包括：
[0014] 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平：
[0015] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0016] 其中测定的表达水平用于鉴定受试者是否患有具有增加的转移潜能的前列腺癌。
[0017] 在又一个进一步方面，本发明涉及用于诊断受试者中的具有增加的转移潜能的前 列腺癌的方法，其包括：
[0018] 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平：
[0019] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12和PDK4
[0020] 其中测定的表达水平用于鉴定受试者是否患有具有增加的转移潜能的前列腺癌。
[0021] 本发明还涉及用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方法，其包括：
[0022] 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平：
[0023 ] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0024] 以鉴定特征在于复发和/或转移的增加可能性的细胞的存在或不存在，其中测定 的所述细胞的存在或不存在用于提供所述前列腺癌的表征/或预后。
[0025] 在一个进一步方面，本发明涉及用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方法， 其包括：
[0026] a)从所述受试者获得样品
[0027] b)将对于以下中的至少一种的蛋白产物特异性的抗体应用于来自所述受试者的样品：
[0028] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0029] c)应用检测抗体-蛋白复合物的检测试剂 [0030] d)使用所述检测试剂以测定所述蛋白的水平
[0031] d)其中测定的蛋白的水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后。
[0032] 前列腺癌的表征、预后或诊断也可用于指导治疗。
[0033] 因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于选择受试者中的前列腺癌的治疗的方 法，其包括：
[0034] (a)测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平：
[0035] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0036] 其中测定的表达水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后，和
[0037] (b)选择对于所述前列腺癌的表征和/或预后适当的治疗。
[0038] 在又一个进一步方面，本发明涉及用于选择受试者中的前列腺癌的治疗的方法， 其包括：
[0039] (a)测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平：
[0040] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0041 ]其中测定的表达水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后
[0042] (b)选择对于所述前列腺癌的表征和/或预后适当的治疗，和 [0043] (c)用选择的治疗治疗所述受试者。
[0044] 本发明还涉及治疗前列腺癌的方法，其包括向受试者施用化疗剂或放射疗法，任 选扩大的放射疗法，优选扩野放射疗法(extended-field radiotherapy)，或者对受试者实 施手术，其中基于本文所述的方法选择所述受试者用于治疗。
[0045] 在一个进一步方面，本发明涉及用于治疗受试者中的前列腺癌的化疗剂，其中基 于本文所述的方法选择所述受试者用于治疗。
[0046] 在又一个进一步方面，本发明涉及治疗前列腺癌的方法，其包括向受试者施用化疗 剂或放射疗法，任选扩大的放射疗法，优选扩野放射疗法(extended-field radiotherapy)， 或者对受试者实施手术，其中所述受试者具有HJURP、H)RG 1、TRPM3、FI 2、CENPF、RNFT2和 SSTR1中的至少一种的增加的表达水平和/或CREM、ERRFIl、SRSF5、PDK4、roE4D、ADAMTSl、 ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、 51^：1542、5(^52、5(^53、5了6641^1、了502201、乂8?1和2??36中的至少一种的降低的表达水平。
[0047] 本发明还涉及用于治疗受试者中的前列腺癌的化疗剂，其中所述受试者具有 HJURP、PDRGl、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2和SSTRl中的至少一种的增加的表达水平和/或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 OAT、P115、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和 ZFP36中的至少一种的降低的表达水平。
[0048] 在某些实施方案中，所述化疗剂包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：
[0049] a)抗激素治疗剂，优选比卡鲁胺和/或阿比特龙
[0050] b)细胞毒性剂
[0051 ] c)生物制品，优选抗体和/或疫苗，更优选Sipuleucel-T和/或 [0052] d)靶向的治疗剂。
[0053] 本文进一步详细地讨论合适的疗法和治疗剂。
[0054] 下表A进一步详细地描述和定义基因 F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、 PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRFI1、F3、HJURP、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36以及它们的蛋白产物。所述基因也可以被互换地称为生物标志物。
[0055]
[0064] 在某些实施方案中，测定以下中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45或46种的表达水平：
[0065] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和 ZFP36。在一些实施方案中，可以将 F0XM1添加至实验对象组。
[0066] 或者，测定以下中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46种 的组群中的至少一种的表达水平：
[0067] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP 1 和 ZFP36。在一些实施方案中，该组群 中可以包括F0XM1。
[0068] 在某些实施方案中，测定以下中的至少一种的表达水平：
[0069] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、PDK4、F12、F3、HJURP、CENPF、MYBPC1、SELE、CEBro和 XBPlo
[0070] 在某些实施方案中，测定以下中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种的表达 水平：
[0071 ] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、PDK4、F12、F3、HJURP、CENPF、MYBPC1、SELE、CEBro和 XBPlo
[0072] 表征意指前列腺癌的分类和/或评估。预后是指预测受试者的前列腺癌的可能后 果。诊断意指鉴定前列腺癌的存在。
[0073] 根据本发明的所有方面，前列腺癌的表征和/或预后可以包括预测复发的增加可 能性，基本上由其组成，或由其组成。前列腺癌的表征和/或预后可以包括预测减少的复发 时间，基本上由其组成，或由其组成。复发可以是临床复发或生物化学复发。生物化学复发 意指在治疗前列腺癌之后受试者中PSA的水平的上升。生物化学复发可以表明前列腺癌没 有得到有效治疗或已经复发。
[0074] 前列腺癌的表征和/或预后可以包括预测转移的增加可能性，基本上由其组成，或 由其组成。
[0075] 转移或转移性疾病，是癌症从一个器官或部分扩散到另一个不相邻的器官或部 分。因此生成的疾病的新的发生被称为转移。
[0076] 前列腺癌的表征和/或预后也可以包括确定前列腺癌是否具有不良预后，基本上 由其组成，或由其组成。不良预后可以是原因特异性（即癌症特异性)或长期存活的降低可 能性。原因或癌症特异性存活是代表在没有其它死亡原因的情况下的癌症存活的净存活量 度。癌症存活可以持续6、7、8、9、10、11、12个月或1、2、3、4、5等年。长期存活可以是诊断后存 活1年、5年、10年或20年。具有不良预后的前列腺癌可以是侵袭性的，快速生长的，和/或显 示对治疗的耐受性。
[0077] 在某些实施方案中，TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、HJURP、RNFT2和SSTR1中的至少一种 或F0XM1的增加的表达水平表明复发和/或转移和/或不良预后的增加可能性。在进一步实 施方案中，SRSF5、PDE4D、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、 ERRFI1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、 NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一种的降低的表达水平表明复发和/或转移和/或不良预后 的增加可能性。
[0078] 在某些实施方案中，本文描述的方法可以包括测定TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、 HJURP、RNFT2 和 SSTR1 中的至少一种或 F0XM1 和 SRSF5、PDE4D、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP 1 和 ZFP36 中的至少一种的表达水平。因 此，所述方法可以依赖于上调的标志物和下调的标志物的组合。
[0079] 在某些实施方案中，本文描述的方法包括将所述表达水平与参考值或与一种或多 种对照样品中的表达水平或相同样品中的一种或多种对照细胞中的表达水平进行比较。对 照细胞可以是正常细胞（即，通过独立方法表征为非癌性的细胞）。一种或多种对照样品可 以由非癌细胞组成，或者可以包括前列腺癌细胞和非癌细胞的混合物。可以将所述表达水 平与一种或多种对照样品或对照细胞中的相同基因的表达水平进行比较。
[0080] 参考值可以是通过测定来自有和没有前列腺癌的受试者的一定范围的样品中的 水平而设置的至少一种基因的表达的阈值水平。前列腺癌可以是有或没有复发和/或转移 和/或不良预后的增加可能性的前列腺癌。用于设置阈值的合适方法是本领域技术人员众 所周知的。所述阈值可以从患者数据的训练集数学推导。评分阈值因此根据特定条件的存 在或不存在分离测试样品。可以在开发或训练阶段从具有已知后果的患者集合推导出该量 (即，截止阈值）的解释。因此可以在通过本领域技术人员已知的方法从训练数据进行请求 保护的方法之前固定所述阈值。
[0081] 参考值也可以是通过测定在第一时间点来自受试者的样品中的至少一种基因的 表达水平而设置的至少一种基因的表达的阈值水平。然后将测定的相同受试者在随后时间 点的表达水平与阈值水平进行比较。因此，可以使用本发明的方法以监测受试者中的疾病 的进展，即提供受试者中的疾病的持续表征和/或预后。例如，可以使用所述方法以鉴定已 经发展为侵袭性更强或潜在的转移性形式的前列腺癌。这可以用于指导治疗决定，如本文 进一步详细讨论。
[0082]对于表达水平在正常细胞和来自不具有复发和/或转移和/或不良预后的增加可 能性的前列腺癌的细胞之间没有差异的基因，相同样品中的正常细胞中的相同基因的表达 水平可以用作对照。
[0083]因此，在具体实施方案中，将样品中的前列腺癌细胞中的TRPM3、PDRG1、SRSF5、 PDE4D、F12和TOK4中的至少一种的表达水平与相同样品中的正常细胞中的相同基因的表达 水平进行比较。
[0084] 在具体实施方案中，如果测定的样品中的前列腺癌细胞中的TRPM3、TORG1、SRSF5、 PDE4D、F12和PDK4中的至少一种的表达水平与相同样品中的正常细胞相比没有不同，则所 述前列腺癌不具有复发和/或转移和/或不良预后的增加可能性。
[0085]不同可以是统计学显著性不同的。统计学显著意指不可能仅仅偶然发生。合适的 统计学评价可以根据任何合适的方法进行。
[0086] 在具体实施方案中，如果所述基因是TRPM3JDRG1或F12且表达水平在样品中的前 列腺癌细胞中相对于相同样品中的正常细胞增加，则所述前列腺癌具有复发和/或转移和/ 或不良预后的增加可能性。
[0087] 在具体实施方案中，如果所述基因是SRSF5、PDE4D或PDK4且表达水平在样品中的 前列腺癌细胞中相对于样品中的正常细胞降低，则所述前列腺癌具有复发和/或转移和/或 不良预后的增加可能性。
[0088] 本文描述的方法可以进一步包括测定参考基因的表达水平。如果目标基因表达水 平在正常细胞和来自不具有复发和/或转移和/或不良预后的增加可能性的前列腺癌的细 胞之间不同，则可以需要参考基因。
[0089] 在某些实施方案中，将ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBro、CENPF、CREM、DKK1、 EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、 MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、 50〇52、5(^53、55了1?1、5了66六1^1、了502201、乂8?1和2??36中的至少一种的表达水平与参考基因 的表达水平进行比较。
[0090] 所述参考基因可以是在所有前列腺癌样品中具有最小表达方差的任何基因。因 此，所述参考基因可以表达水平不会随着复发和/或转移和/或不良预后的可能性变化的任 何基因。技术人员能够很好地基于这些标准鉴定合适的参考基因。具体而言，所述参考基因 可以是TPT1、RPS14或RPL37A。可以在与以下中的至少一种的表达水平相同的样品中测定所 述参考基因的表达水平：
[0091] ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRFI1、F3、 HJURP、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、 NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、 ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0092] 可以在不同的样品中测定所述参考基因的表达水平。不同的样品可以是如上所述 的对照样品。可以在样品中的正常和/或前列腺癌细胞中测定所述参考基因的表达水平。
[0093] 可以使用统计学模型分析来自受试者的样品中的至少一种基因的表达水平。在其 中测量至少2种基因的表达水平的具体实施方案中，所述基因可以被加权。如本文所使用， 术语"权重"是指统计学计算中项目的相对重要性。每种基因的权重可以使用本领域中已知 的分析方法在患者样品的数据集上来确定。可以计算总评分并将其用于提供前列腺癌的表 征和/或预后。
[0094] 本文更详细描述用于测定标志物的表达水平的方法。典型地，所述方法可以涉及 使获得自受试者的样品与检测试剂诸如对于标志物特异性的引物/探针/抗体(如本文详细 讨论)接触并检测表达产物。针对对照样品中测定的表达水平进行比较以提供前列腺癌的 表征和/或预后。
[0095] 根据本发明的所有方面，可以通过任何合适的方法测量一种或多种基因的表达水 平。在某些实施方案中，在蛋白、RNA或表观遗传修饰的水平测定表达水平。表观遗传修饰可 以是DNA甲基化。
[0096] 可以通过免疫组织化学测定表达水平。免疫组织化学意指通过使用特异性结合至 蛋白的结合剂诸如抗体或适配子而检测组织样品的细胞中的蛋白。因此，如通过免疫组织 化学测定的表达水平是蛋白水平。所述样品可以是前列腺组织样品，并且可以包含前列腺 癌（肿瘤)细胞，前列腺上皮内肿瘤(PIN)细胞，正常前列腺上皮，基质和任选的浸润性免疫 细胞。在一些实施方案中，将样品中的前列腺癌（肿瘤)细胞中的至少一种基因的表达水平 与相同样品中的正常细胞中的相同基因（和/或参考基因）的表达水平进行比较。在一些实 施方案中，将样品中的前列腺癌(肿瘤)细胞中的至少一种基因的表达水平与对照样品中的 正常细胞中的相同基因（和/或参考基因）的表达水平进行比较。正常细胞可以包含正常(非 癌）前列腺上皮细胞，基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，正常细胞不包含 PIN细胞和/或基质细胞。在某些实施方案中，前列腺癌(肿瘤)细胞不包含PIN细胞和/或基 质细胞。在进一步实施方案中，将样品中的前列腺癌（肿瘤)细胞中的至少一种基因的表达 水平(额外地)与对照样品中的相同细胞或前列腺癌细胞中的参考基因的表达水平进行比 较。所述参考基因可以是TPTURPS14或RPL37A。在又进一步实施方案中，使用基于前列腺癌 (肿瘤)细胞(不与正常细胞相比）中的表达的强度、比例和/或定位的方法对样品中的前列 腺癌(肿瘤)细胞中的至少一种基因的表达水平进行评分。可以在开发或训练阶段从具有已 知后果的患者集合推导出评分方法。
[0097]因此，在一个进一步方面，本发明涉及特异性结合至以下中的至少一种的蛋白产 物的抗体或适配子：
[0098] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0099] 所述抗体可以是单克隆或多克隆来源的。也可以利用片段和衍生物抗体，包括但 不限于Fab片段、ScFv、单结构域抗体、纳米抗体、重链抗体，适配子等，其保留肽特异性结合 功能，并且这些都包括在"抗体"的定义中。这样的抗体可用于本发明的方法中。它们可以用 于测量特定蛋白、或在一些情况下蛋白的一种或多种特定同种型的水平。技术人员完全能 够鉴定允许将特定同种型与彼此区分的表位。
[0100] 用于生成特异性抗体的方法是本领域技术人员已知的。抗体可以是人或非人来源 的（例如啮齿动物，诸如大鼠或小鼠），并且可以根据已知技术进行人源化等(Jones等人， Nature(1986)May 29-Jun · 4; 321 (6069): 522-5 ; Roguska等人，Protein Engineering， 1996,9(10) :895_904;和Studnicka等人，Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure.Protein Engineering,1994,Vo1.7,pg 805)。
[0101] 在某些实施方案中，使用与标记缀合的抗体或适配子测定表达水平。标记意指允 许直接或间接检测的组分。例如，所述标记可以是酶，任选过氧化物酶，或荧光团。
[0102] 标记是检测试剂的实例。检测试剂意指可以用于协助检测抗体-蛋白复合物的试 剂。当抗体与酶缀合时，检测试剂可以包含化学组成，使得所述酶催化化学反应以产生可检 测的产物。由适当的酶催化的反应的产物可以是，但不限于，荧光产物、发光产物或放射活 性产物，或者它们可吸收可见光或紫外线。适用于检测这样的可检测的标记的检测仪的实 例包括，但不限于，X-射线膜、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光光度 计、光度计和光密度计。在某些实施方案中，所述检测试剂可以包含二抗。然后使用未标记 的结合至目标蛋白的一抗和与标记缀合的二抗测定表达水平，其中所述第二抗体结合至所 述一抗。
[0103] 本发明还涉及如上所述的抗体用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的用途。
[0104] 用于在蛋白水平测定表达水平的额外技术包括，例如，Western印迹、免疫沉淀、免 疫细胞化学法、质谱、ELISA和其它(参见ImmunoAssay:A Practical Guide,由Brian Law编 辑，由1371<^&?瓜11(^8，1^(1.出版，2005版）。为了改进基于免疫反应性的测定方法的特异性 和灵敏度，单克隆抗体因为其特异性表位识别而经常得到使用。多克隆抗体因为它们与单 克隆抗体相比对于目标的增加亲和力而也已成功地用于许多免疫测定中。
[0105] 本发明的方法中可以使用或本发明的试剂盒中可以包括的合适的抗体列于下表B 中：
[0106]表B-结合至本发明的标志物的抗体的实例
[0111] 测量生物样品中的mRNA可用作检测生物样品中的相应蛋白水平的替代方案。因 此，本文描述的任何基因的表达水平还可通过检测适当的RNA来检测。
[0112] 因此，在具体实施方案中，通过微阵列、northern印迹、RNA_seq(RNA测序）、原位 RNA检测或核酸扩增测定表达水平。核酸扩增包括PCR及其所有变体诸如实时和终点方法和 qPCR。其它核酸扩增技术是本领域中众所周知的，并且包括方法诸如NASBA、3SR和转录介导 的扩增(TMA)。其它合适的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、目标多核苷酸序列的选择 性扩增（美国专利号6,410,276)、共有序列引发的聚合酶链式反应（美国专利号4,437， 975)、任意引发的聚合酶链式反应(W0 90/06995)、侵入者技术、链置换技术和缺口置换扩 增(W0 2004/067726)。该列表并不意欲是穷尽的；可以使用任何核酸扩增技术，条件是特异 性扩增适当的核酸产物。合适的引物和/或探针的设计在本领域技术人员的能力之内。可以 免费得到各种引物设计工具以协助该过程，诸如NCBI Primer-BLAST工具。引物和/或探针 可以是至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个(或更多个)核苷酸的长度。可以通过 逆转录定量聚合酶链式反应(RT-PCR，随后qPCR)测量mRNA的表达水平。RT-PCR用于从mRNA 生成cDNA^DNA可用于qPCR测定中以便随着DNA扩增过程进行而产生荧光。通过与标准曲线 比较，qPCR可以产生绝对测量值，诸如每个细胞的mRNA的拷贝数。Northern印迹、微阵列、侵 入测定和与毛细管电泳组合的RT-PCR均已用于测量样品中的mRNA的表达水平。参见Gene Expression Prof iling:Methods and Protocols ,Richard A. Shimkets，编辑，Humana Press,2004〇
[0113] RNA-seq使用下一代测序以测量基因表达的改变。RNA可以转化为cDNA或直接测 序。下一代测序技术包括焦磷酸测序、SOLiD测序、IonTorrent半导体测序、Illumina测序染 料、单分子实时测序或DNA纳米球测序。
[0114] 原位RNA检测涉及在不从组织和细胞提取的情况下检测RNA。原位RNA检测包括原 位杂交（ISH)，其使用标记的（例如，放射标记的，抗原标记的或焚光标记的）探针(互补DNA 或RNA链），以便将特定RNA序列定位于组织的部分或区域中，或者整个组织（整个包封的 ISH)中，或细胞中。可以分别使用放射自显影、荧光显微镜或免疫组织化学在组织中定位和 定量用放射、荧光或抗原标记的基质（例如，地高辛）标记的探针。ISH也可以使用两种或更 多种探针同时检测两种或更多种转录物。分支DNA测定也可用于具有单分子灵敏度的RNA原 位杂交测定。该方法包括ViewRNA测定。将样品（细胞，组织)是固定，然后处理，以允许RNA目 标可及(RNA未掩蔽）。目标特异性探针杂交至各目标RNA。随后的信号扩增基于相邻探针（即 在RNA目标上并排结合的个体寡核苷酸)的特异性杂交。典型的目标特异性探针将含有40个 寡核苷酸。经由一系列相继杂交步骤实现信号扩增。预扩增分子杂交至目标特异性RNA上的 各寡核苷酸对，然后多个扩增分子杂交至各预扩增分子。接下来，多个标记探针寡核苷酸 (缀合至酶诸如碱性磷酸酶或直接缀合至荧光团）杂交至各扩增分子。分开但相容的信号扩 增系统能够进行多重测定。可以通过测量根据所用的检测系统发射的荧光或光显现信号。 在一些实施方案中，检测可以涉及使用高含量成像系统，或荧光或明场显微镜。
[0115] 因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于(原位)表征和/或预后受试者中的前列 腺癌的试剂盒，其包含对于以下中的至少一种的RNA产物特异性的一种或多种寡核苷酸探 针：F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0116] 所述试剂盒可以进一步包含以下组分中的一种或多种：
[0117] a)阻断探针 [0118] b)预扩增分子
[0119] c)扩增分子和/或
[0120] d)标记分子
[0121 ] 所述试剂盒的组分可以适合于进行viewRNA测定（https ://www.panomics · com/ products/rna-in-situ-analysis/view_rna-〇verview)〇
[0122] 所述试剂盒的组分可以是基于核酸的分子，任选DNA(或RNA)。阻断探针是起作用 以通过结合至目标上不被目标特异性探针(对于本发明的至少一种基因的RNA产物特异性 的探针）结合的位点而减少背景信号的分子。预扩增分子是当目标结合时能够结合至（一 对）目标特异性探针的分子。扩增分子是能够结合至预扩增分子的分子。或者，预扩增分子 当目标结合时能够直接结合至(一对）目标特异性探针。扩增分子具有用于多个标记分子的 结合位点（其可以是标记探针）。
[0123] 本发明还涉及所述试剂盒用于表征和/或预后前列腺癌的用途。
[0124] 可以通过RNA与一组探针的杂交测定RNA表达。该探针可以排列于阵列中。微阵列 平台包括由公司诸如4€€}〇1161：1^1、11111111；[仙和48；[16111:制造的平台。由4€€501161：1^1制造的微 阵列平台的实例包括U133Plus2阵列、Almac专有Xcel?阵列和Almac专有癌症DSAs? ,包 括前列腺癌DSA?。
[0125] 在具体实施方案中，可以使用选自下表C中的探针的一种或多种探针来测定至少 一种基因的表达：
[0126] 表C-用于测量阵列上的基因的表达水平的探针列表。
[0132] 这些探针还可以并入本发明的试剂盒。还可以使用探针序列，以便设计用于例如 通过RT-PCR检测表达的引物。这样的引物也可包括于本发明的试剂盒中。
[0133] 已经显示启动子处或附近的DNA甲基化的增加率与降低的基因表达水平相关。DNA 甲基化是人中的主要表观遗传修饰。它是由被称为甲基转移酶的酶进行的DNA的化学修饰， 其中将甲基(m)添加至DNA中的特定胞嘧啶(C)残基。在哺乳动物中，甲基化仅在邻近于鸟苷 残基的胞嘧啶残基处，即，在序列CG处或在CpG二核苷酸处，发生。
[0134] 因此，在又一个进一步方面，本发明涉及用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌 的方法，其包括：
[0135] 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的甲基化状态：
[0136] ADAMTS9、EMP1、F3、LDLR、LGALS3、MALAT1、MTUS1、NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、 S0CS3和TSC22D1
[0137] 其中测定的甲基化状态用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后。
[0138] 在某些实施方案中，如果ADAMTS9、EMP1、F3、LDLR、LGALS3、MALAT1、MTUS1、NR4A3、 PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3和TSC22D1中的至少一种被(过度）甲基化，则复发和/或转移的 可能性增加。
[0139] 可以通过任何合适的方式来实现甲基化状态的测定。合适的实例包括亚硫酸氢盐 基因组测序和/或通过甲基化特异性PCR。用于评价甲基化状态的各种技术是本领域中已知 的，并且可以与本发明结合使用:测序，甲基化特异性PCR(MS-PCR)，熔解曲线甲基化特异性 PCR(McMS-PCR)，有或没有亚硫酸氢盐处理的MLPA，QAMA(Zeschnigk等人，2004)，MSRE-PCR (]\^1]1丨1?)￥等人，2005)，]\^1:1171^8111:化&(18等人，2000)，&3111^8111：-]\^?(1^11(1等人，2002)，亚 硫酸氢盐转化特异性的甲基化特异性PCR(BS-MSP)( Sasaki等人，2003)，COBRA(依赖于使用 限制性酶以揭示亚硫酸氢钠-处理的DNA的PCR产物的甲基化依赖性序列差异），甲基化敏感 的单核苷酸引物延伸验证(MS-SNuPE)，甲基化敏感的单链验证分析(MS-SSCA)，熔解曲线组 合的亚硫酸氢盐限制性分析（McCOBRA) (Akey等人，2002)，PyroMethA，HeavyMethyl (Cottrell等人2004)，MALDI-TOF，MassARRAY，甲基化的等位基因的定量分析(QAMA)，酶促 区域甲基化检测(ERMA)，QBSUPT，MethylQuant，定量PCR测序和基于寡核苷酸的微阵列系 统，焦磷酸测序，Me th-DOP-PCR。一些可用于DNA甲基化分析的技术的综述提供于Nuc 1 e i c acids research,1998,Vol.26,No.10,2255-2264,Nature Reviews,2003,Vol.3,253-266； Oral Oncology,2006,Vol.42,5-13〇
[0140] 用于评价甲基化状态的技术基于不同的方法。一些包括使用核酸内切酶。这样的 内切核酸酶可以相对于未甲基化的识别位点优先切割甲基化的识别位点，或者相对于甲基 化的识别位点优先切割未甲基化的识别位点。前者的一些实例是Acc III、Ban I、BstN I、 Msp I和Xma I。后者的实例是Acc II、Ava I、BssH II、BstU I、Hpa II和Not I。切割模式的 差异表明甲基化的CpG二核苷酸的存在或不存在。切割模式可以直接检测，或者在生成可容 易区分的产物的进一步反应之后进行检测。检测改变的大小和/或电荷的方式可以用于检 测修饰的产物，包括但不限于电泳、色谱和质谱。
[0141] 或者，甲基化的CpG二核苷酸的鉴定可以利用MeCP2蛋白的甲基结合结构域(MBD) 选择性结合至甲基化DNA序列的能力（Cross等人，1994;Shiraishi等人，1999) JBD还可以 从1??、冊?2、1??4、聚-1?0(加找61^11等人，2006)或试剂诸如结合至甲基化核酸的抗体获 得。可以将MBD固定至固相基质，且用于制备型柱层析来分离高度甲基化的DNA序列。变体形 式诸如表达的His标记的甲基化-CpG结合结构域可以用来选择性结合至甲基化的DNA序列。 最终，使限制性内切核酸酶消化的基因组DNA与表达的His标记的甲基-CpG结合结构域接 触。其它方法是本领域中众所周知的，且尤其包括甲基化的CpG岛回收测定(MIRA)。另一种 方法，MB-PCR，使用固定化于PCR容器的壁上以捕获甲基化的DNA的重组的二价甲基-CpG-结 合多肽和随后通过PCR检测结合的甲基化DNA。
[0142] 用于检测甲基化的CpG二核苷酸基序的进一步方法使用选择性修饰CpG二核苷酸 基序的甲基化或未甲基化的形式的化学试剂。合适的化学试剂包括肼和亚硫酸氢根离子。 在某些实施方案中，本发明的方法可以使用亚硫酸氢根离子。亚硫酸氢盐转化依赖于用亚 硫酸氢钠处理DNA样品，其将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶得到保持 (Furuichi等人，1970)。该转化最终导致初始DNA的序列的变化。众所周知，所得尿嘧啶具有 胸腺嘧啶的碱基配对行为，这不同于胞嘧啶碱基配对行为。这使得甲基化和未甲基化的胞 嘧啶之间的区分变得可能。用于评价序列差异的分子生物学和核酸化学的有用常规技术是 本领域中众所周知的并在文献中解释。参见，例如，Sambrook，J .，等人，Molecular cloning:A laboratory Manual ,(2001)第3版，Cold Spring Harbor,NY;Gait，M.J.(编 辑），01igonucleotide Synthesis , A Practical Approach,IRL Press(1984)；Hames B.D.，和Higgins,S.J.(编辑），Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press(1985);和系列，Methods in Enzymology,Academic Press,Inc〇
[0143] -些技术使用用于评价在CpG二核苷酸的甲基化状态的引物。两种引物设计的方 法是可能的。首先，可以设计本身不覆盖DNA甲基化的任何潜在位点的引物。在差异甲基化 位点处的序列变异位于两个引物之间，并且序列变异的显现需要进一步的测定步骤。这样 的引物用于亚硫酸氢盐基因组测序、C0BRA、Ms-SnuPE和几种其他技术中。其次，可以设计与 初始处理的序列的甲基化或未甲基化版本特异性杂交的引物。杂交之后，可进行扩增反应， 使用本领域已知的任何检测系统测定扩增产物。扩增产物的存在表明所述样品与引物杂 交。所述引物的特异性表明DNA是否已经修饰或未经修饰，其进而表明DNA是否已被甲基化。 如果与目标具有足够的互补区域，例如12、15、18或20个核苷酸，则所述引物还可含有不干 扰杂交但可用于其它操作的额外核苷酸残基。这样的其它残基的实例可以是限制性内切核 酸酶切割位点，配体结合位点或者因子结合或接头或重复。寡核苷酸引物可以使得或者可 以不使得它们对于修饰的甲基化残基是特异性的。
[0144] 区分修饰和未修饰的核酸的进一步方式是使用寡核苷酸探针。这样的探针可以直 接杂交至修饰的核酸或修饰的核酸的进一步产物，诸如通过扩增获得的产物。基于探针的 测定利用寡核苷酸与特异性序列的杂交以及随后对该杂交物的检测。也可以在检测扩增产 物之前存在进一步的纯化步骤，例如沉淀步骤。可以使用任何本领域中已知的检测系统标 记寡核苷酸探针。这些包括但不限于:荧光部分、放射性同位素标记部分、生物发光部分、发 光部分、化学发光部分、酶、底物、受体或配体。
[0145] 在MSP方法中，可以使用引物对扩增DNA，所述引物对经设计通过利用由于钠亚硫 酸氢处理导致的序列差异来区分甲基化DNA与未甲基化DNA(W0 97/46705)。例如，亚硫酸氢 根离子修饰未甲基化的胞嘧啶碱基，将它们变为尿嘧啶碱基。在杂交条件下，尿嘧啶碱基与 腺嘌呤碱基杂交。因此，包含替代鸟嘌呤碱基的腺嘌呤碱基的寡核苷酸引物会与亚硫酸氢 根修饰的DNA杂交，而含有鸟嘌呤碱基的寡核苷酸引物会与DNA中未修饰的（甲基化的)胞嘧 啶残基杂交。使用DNA聚合酶和第二引物的扩增得到扩增产物，所述扩增产物可以容易观察 到，这进而表明DNA是否已经被甲基化。尽管PCR是优选的扩增方法，本发明的范围内也包括 该基本技术的变体，诸如巢式PCR和多重PCR。
[0146] 如前所提及，用于评价相关基因的甲基化状态的一个实施方案需要扩增以产生扩 增产物。扩增产物的存在可以使用本领域中众所周知的方法直接评价。它们可以简单地在 合适的凝胶诸如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上显现。检测可以涉及，例如，特定染料(诸如插 入双链DNA的溴化乙锭）的结合和在UV照射器下DNA条带的显现。用于检测扩增产物的另一 种方式包含与寡核苷酸探针杂交。或者，可以测量荧光或能量转移以测定甲基化DNA的存 在。
[0147] MSP技术的一个特定实例被称为实时定量MSP(QMSP)，并且允许实时或在端点可靠 定量甲基化的DNA。实时方法一般是基于连续光学监测扩增程序，并且利用荧光标记的试 剂，所述试剂在产物中的掺入可以进行定量，并且其定量表明模板中该序列的拷贝数。一种 这样的试剂是荧光染料，被称为SYBR Green I，其优先结合双链DNA，且双链DNA的结合大大 增强了其荧光。或者，标记的引物和/或标记的探针可用于定量。它们代表了众所周知的市 售实时扩增技术的具体应用，诸如TACJMAN?、molecularBEACONS?、 AMPLIFLUOR?和 SCORPION?、DzyNA?、pi exorTM 等。在实时pcr系统中，可 以在指数期过程中监测PCR反应，在所述指数期过程中，PCR产物的量的首先显著增加与目 标模板的初始量相关。
[0148] 实时PCR检测反应过程中扩增子的积累。然而，不需要利用实时方法。许多应用不 需要定量，且实时PCR技术仅用作获得便利的结果呈现和储存且同时避免PCR后处理的工 具。因此，可以仅进行分析以证实目标DNA是否存在于样品中。在扩增反应已经完成之后进 行这样的终点验证。
[0149] 根据本发明的所有方面，测定以下中的至少一种的表达水平
[0150] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0151] 可以涉及测定从所述基因产生的转录物和/或蛋白同种型的所有或选择物的水 平。对于各基因可以检测的转录物和相应的蛋白同种型的实例显示于下表D:
[0152] 表D-本发明中可以检测的代表性转录物和相应的蛋白同种型
[0161] 本文所述的方法可以进一步包括从样品提取总核酸或RNA。合适的方法是本领域 中已知的，并且包括使用商业可得的试剂盒诸如Rneasy和GeneJET RNA纯化试剂盒。
[0162] 在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括从受试者获得样品。典型地，所述方 法是在分离的样品上进行的体外方法。
[0163] 根据本发明的所有方面，样品可以是任何合适的形式。所述样品可以包含前列腺 细胞，基本上由其组成，或由其组成，且经常是前列腺组织样品。前列腺细胞或组织可以包 含前列腺癌细胞。在具体实施方案中，所述样品包含福尔马林固定的石蜡包埋的活检样品， 基本上由其组成，或由其组成。组织样品可以通过任何合适的技术获得。实例包括活检程 序，任选细针抽吸活检程序。也可以利用体液样品。合适的样品类型包括血液，以涵盖全血、 血清和血浆样品、尿液和精液。
[0164] 本发明的方法可以包括选择受试者中的前列腺癌的治疗和任选进行所述治疗。在 某些实施方案中，如果前列腺癌的表征和/或预后结果是复发和/或转移和/或不良预后的 增加可能性，则选择的治疗是以下中的一种或多种：
[0165] a)抗激素治疗
[0166] b)细胞毒性剂
[0167] c)生物制品
[0168] d)放射疗法
[0169] e)靶向疗法
[0170] f)手术
[0171] 抗激素治疗(或激素疗法)意指降低选择的激素(特别是睾酮)的水平和/或活性的 治疗形式。所述激素可以促进肿瘤生长和/或转移。抗激素治疗可以包含促黄体激素阻断 剂，诸如戈舍瑞林（也称为Zoladex)、布舍瑞林、亮丙瑞林（也称为Pros tap)、组氨瑞林 (Vantas)和曲普瑞林(也称为Decapeptyl)。所述抗激素治疗可以包含促性腺激素释放激素 (GnRH)阻滞剂，诸如地加瑞克(Firmagon)，或抗雄激素诸如氟他胺(也称为Drogenil)和比 卡鲁胺(也称为Casodex)。在具体实施方案中，所述抗激素治疗可以是比卡鲁胺和/或阿比 特龙。
[0172]所述细胞毒性剂可以是基于铂的药剂和/或紫杉烷。在具体实施方案中，所述基于 铂的药剂选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。所述紫杉烷可以是紫杉醇、卡巴他赛或多西他赛。所 述细胞毒性剂也可以是长春花生物碱，诸如长春瑞滨或长春花碱。所述细胞毒性剂可以是 拓扑异构酶抑制剂，诸如依托泊苷或蒽环霉素(抗生素），诸如阿霉素。所述细胞毒性剂可以 是烷基化剂，诸如雌莫司汀。
[0173] 生物制品意指由生物过程生成的医药产品。生物制品可以是，例如，疫苗、血液或 血液组分、细胞、基因疗法、组织或重组治疗性蛋白。任选地，所述生物制品是抗体和/或疫 苗。所述生物制品可以是Sipuleucel-T。
[0174] 在某些实施方案中，所述放射疗法是扩大的放射疗法，优选扩野放射疗法 (extended-field radiotherapy)。
[0175] 手术可以包括根治性前列腺切除术。根治性前列腺切除术意指去除整个前列腺、 精囊和输精管。在进一步实施方案中，手术包括肿瘤切除，即去除所有或部分肿瘤。
[0176] 靶向疗法意指使用针对特定药物目标的靶向治疗剂用于治疗前列腺癌的治疗。在 具体实施方案中，这可意指针对目标诸如PARP、AKT、MET、VEGFR等的抑制剂。PARP抑制剂是 酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)的一组药理学抑制剂。几种形式的癌症比普通细胞更依赖于 PARP，使得PARP成为癌症疗法的有吸引力的目标。（临床试验中的)实例包括iniparib、奥拉 帕尼、rucaparib、veliparib、CEP 9722、MK 4827、BMN-673和3-氨基苯甲酰胺。AKT，也称为 蛋白激酶B(PKB)，是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其在多种细胞过程诸如葡萄糖代谢、 凋亡、细胞增殖、转录和细胞迀移中发挥关键作用。AKT与肿瘤细胞存活、增殖和侵袭相关。 AKT抑制剂的实例包括VQD-002、哌立福辛、米替福新和AZD5363JET是原癌基因，其编码肝 细胞生长因子受体(HGFR)。所述肝细胞生长因子受体蛋白具有酪氨酸-激酶活性。用于抑制 MET的激酶抑制剂的实例包括1(2523、51]11274、？似-66752、41^197、？〇代衍11丨13、56乂523和 MP470。也可以通过抑制与HGF的相互作用来阻断MET活性。许多合适的拮抗剂，包括截短的 HGF，抗HGF抗体和不可切割的HGF，是已知的。VEGF受体是血管内皮生长因子(VEGF)的受体。 各种抑制剂是已知的，诸如1 envat i n i b、莫替沙尼、帕唑帕尼和瑞格非尼。
[0177] 本发明的方法可以指导疗法选择，以及新颖治疗剂的临床试验评估过程中选择患 者群体用于富集策略。例如，当评估推定的抗癌剂或治疗方案时，本文公开的方法可用于选 择个体用于临床试验，其具有被表征为具有复发和/或转移和/或不良预后的增加可能性的 前列腺癌。
[0178] 本发明还涉及用于执行如本文所述的方法的系统或装置。
[0179] 在一个进一步方面，本发明涉及用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的系统 或测试试剂盒，其包含：
[0180] a)-种或多种测试装置，其用于测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种 的表达水平：
[0181] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0182] b)处理器;和
[0183] c)包含计算机应用的存储介质，当由所述处理器执行时，所述计算机应用被配置 为：
[0184] (i)在一种或多种测试装置上访问和/或计算所述样品中以下中的至少一种的测 定的表达水平：
[0185] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36
[0186] (ii)计算所述样品中以下中的至少一种的水平是增加还是降低：
[0187] F0XM1、TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、 LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、 RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和
[0188] (iii)从所述处理器输出前列腺癌的表征和/或预后。
[0189] 测试装置意指允许测定基因的表达水平的组分(件）的组合。所述组分(件)可以包 括上面关于在蛋白、RNA或表观遗传修饰的水平测定表达水平的方法描述的任何组件。例 如，所述组分可以是抗体、引物、检测剂等等。组分(件)还可以包括以下中的一种或多种：显 微镜、显微镜载片、X-光片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度 计和密度计。
[0190] 在某些实施方案中，所述系统或测试试剂盒进一步包含用于从所述处理器输出的 显示器。
[0191] 本发明还涉及计算机应用或包含如上定义的计算机应用的存储介质。
[0192] 在某些示例性实施方案中，提供了用于根据本文描述的方法表征和/或预后受试 者中的前列腺癌的计算机执行的方法、系统和计算机程序产品。例如，所述计算机程序产品 可以包含具有在其上实施的计算机可读程序指令的非临时性计算机可读存储装置，当由计 算机执行时，其引起所述计算机如本文所述表征和/或预后受试者中的前列腺癌。例如，计 算机可执行指令可以引起所述计算机：
[0193] (i)在一种或多种测试装置上访问和/或计算所述样品中以下中的至少一种的测 定的表达水平：F0XM1、TRPM3、PDRG 1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS 1、ADAMTS9、B3GNT5、 CD3 8、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、 LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、 RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;
[0194] (ii)计算所述样品中以下中的至少一种的水平是增加还是降低:F0XM1、TRPM3、 PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、CREM、DKK1、 EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、 MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、 S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和，
[0195] (iii)提供关于所述前列腺癌的表征和/或预后的输出。
[0196] 在某些示例性实施方案中，所述计算机执行的方法、系统和计算机程序产品可以 在计算机应用中实施，所述计算机应用，例如，在计算机器和模块上操作和执行。当执行时， 所述应用可以根据本文所述的示例性实施方案表征和/或预后受试者中的前列腺癌。
[0197] 如本文所使用，计算机器可以对应于任何计算机、服务器、嵌入式系统或计算系 统。模块可以包含一个或多个硬件或软件元件，其被配置为便于计算机器执行本文呈现的 各种方法和处理功能。计算机器可以包括各种内部或所附组件，诸如处理器、系统总线、系 统存储器、存储介质、输入/输出接口和用于与例如网络通信的网络接口。
[0198] 计算机器可以被实现为常规计算机系统、嵌入式控制器、膝上型计算机、服务器、 定制机器、任何其它硬件平台、诸如例如实验室计算机或装置或其任何组合。计算机器可以 是被配置成使用例如经由数据网络或总线系统互连的多个计算机器工作的分布式系统。
[0199] 处理器可以被配置成执行代码或指令以执行本文所述的操作和功能，管理请求流 和地址映射，和执行计算和生成命令。处理器可以被配置成监视和控制计算机器中的组件 的操作。处理器可以是通用处理器、处理器核心、多处理器、可再配置处理器、微控制器、数 字信号处理器（"DSP"）、专用集成电路（"ASIO、图形处理单元（"GPU"）、现场可编程门阵列 ("FPGA"）、可编程逻辑器件（"PLD"）、控制器、状态机、门控逻辑、离散硬件组件、任何其它处 理单元、或者其任何组合或多样性。处理器可以是单个处理单元、多个处理单元、单个处理 核心、多个处理核心、专用处理核心、协同处理器、或者其任何组合。根据特定实例实施方 案，处理器连同计算机器的其它组件可以是在一个或多个计算机器内执行的虚拟化的计算 机器。
[0200] 系统存储器可以包括非易失性存储器，诸如只读存储器（"ROM"）、可编程只读存储 器（"PR0M"）、可擦除可编程只读存储器（"EPROM"）、闪存、或能够在有或没有施加的电力的 情况下存储程序指令或数据的任何其它设备。系统存储器还可以包括易失性存储器，诸如 随机存取存储器（"RAM"）、静态随机存取存储器（"SRAM"）、动态随机存取存储器（"DRAM"）和 同步动态随机存取存储器（"SDRAM"）。其它类型的RAM还可以用于实现系统存储器。系统存 储器可以使用单个存储器模块或多个存储器模块来实现。尽管系统存储器可以是计算机器 的一部分，但本领域技术人员将认识到，系统存储器可以与计算机器分离而不偏离主题技 术的范围。还应该认识到，系统存储器可以包括非易失性存储设备诸如存储介质，或者与其 结合操作。
[0201] 存储介质可以包括硬盘、软盘、压缩盘只读存储器（"CD-ROM"）、数字通用盘 ("DVD"）、蓝光盘、磁带、闪存、其它非易失性存储设备、固态驱动器（"SSD"）、任何磁存储设 备、任何光存储设备、任何电存储设备、任何半导体存储设备、任何基于实体的存储设备、任 何其它数据存储设备、或者其任何组合或多样性。存储介质可以存储一个或多个操作系统、 应用程序和程序模块诸如模块、数据或任何其它信息。存储介质可以是计算机器的一部分 或连接到计算机器。存储介质还可以是与计算机器诸如服务器、数据库服务器、云存储、连 接网络的存储器等等通信的一个或多个其它计算机器的一部分。
[0202]模块可以包含一个或多个硬件或软件元件，其被配置成便于计算机器来执行本文 呈现的各种方法和处理功能。模块可以包括与系统存储器、存储介质或两者相关的存储为 软件或固件的一个或多个指令序列。存储介质可以因此代表机器或计算机可读介质的实 例，在其上可以存储指令或代码用于由处理器执行。机器或计算机可读介质可以通常是指 用于提供指令给处理器的任何一种或多种介质。这样的与模块相关的机器或计算机可读介 质可以包含计算机软件产品。应该认识到，包含模块的计算机软件产品还可以与经由网络、 任何信号承载介质、或任何其它通信或递送技术来递送模块给计算机器的一个或多个处理 或方法相关。模块还可以包含硬件电路或用于配置硬件电路的信息，诸如微代码或用于 FPGA或其它PLD的配置信息。
[0203]输入/输出（"I/O"）接口可以被配置为耦合至一个或多个外部设备，以从一个或多 个外部设备接收数据，以及发送数据到一个或多个外部设备。这样的外部设备连同各种内 部设备一起还被称为外围设备。I/O接口可以包括电和物理连接，用于可操作地将各种外围 设备耦合至计算机器或处理器。I/O接口可以被配置成在外围设备、计算机器或处理器之间 传送数据、地址和控制信号。I/O接口可以被配置成实现任何标准接口，诸如小型计算机系 统接口（ "SCSI"）、串行附连的SCSI ( "SAS"）、光纤通道、外围组件互连（"PCI"）、PCI express (PCIe)、串行总线、并行总线、先进技术连接（"ATA"）、串行ATA( "SATA"）、通用串行总线 ("USB"）、Thunderbolt、FireWire、各种视频总线等。I/O接口可以被配置成仅实现一个接口 或总线技术。
[0204]或者，I/O接口可以被配置成实现多个接口或总线技术。I/O接口可以被配置成系 统总线的一部分、全部，或与其结合操作。I/O接口可以包括一个或多个缓冲器，用于缓冲一 个或多个外部设备、内部设备、计算机器或处理器之间的传输。
[0205] I/O接口可以将计算机器2000耦合到各种输入设备，包括鼠标、触摸屏、扫描仪、电 子数字转换器、传感器、接收机、触摸板、轨迹球、相机、麦克风、键盘、任何其它指示设备、或 者其任何组合。I/O接口可以将计算机器耦合至各种输出设备，包括视频显示器、扬声器、打 印机、投影仪、触觉反馈设备、自动控制、机器人组件、致动器、电机、风扇、螺线管、阀门、栗、 发射器、信号发射器、光源等等。
[0206] 计算机器可以使用通过网络接口到跨越网络的一个或多个其它系统或计算机器 的逻辑连接而在联网环境中操作。网络可以包括广域网（WAN)、局域网（LAN)、内联网、互联 网、无线接入网络、有线网络、移动网络、电话网络、光学网络、或其组合。网络可以是任何拓 扑的分组交换、电路交换、并且可以使用任何通信协议。网络内的通信链路可以包括各种数 字或模拟通信介质，诸如光纤电缆、自由空间光学、波导、电导器、无线链接、天线、射频通信 等等。
[0207] 处理器可以通过系统总线连接到计算机器的其它元件或本文讨论的各种外围设 备。应该认识到，系统总线可以在处理器内部，在处理器外部，或两者都有。根据一些实施方 案，处理器、计算机器的其它元件或本文讨论的各种外围中的任一个可以被集成到单个设 备诸如芯片上系统（"S0C")、封装上系统（"S0P"）或者ASIC设备中。
[0208] 实施方案可以包括计算机程序，其实现本文描述和说明的功能，其中计算机程序 在包含存储在机器可读媒介的指令和执行指令的处理器的计算机系统中实现。然而，应该 显然的是，可以存在许多不同的在计算机编程中实现实施方案的方式，且所述实施方案不 应该理解为限定为任何一组计算机程序指令。进一步，本领域编程人员将能够写出这样的 计算机程序来实现所公开的本文所述的实施方案。因此，不考虑充分理解如何做出和使用 实施方案所必需的特定程序代码指令集合的公开。进一步，本领域技术人员将理解，本文描 述的实施方案的一个或多个方面可以由硬件、软件或其组合来执行，如可以在一个或多个 计算系统中实现的那样。而且，对由计算机执行的动作的任何引用不应该被理解为由单个 计算机执行，因为多于一个计算机可以执行该动作。
[0209] 本文描述的实例实施方案可以通过执行先前所述的方法和处理功能的计算机硬 件和软件来使用。本文所述的系统、方法和程序可以在可编程计算机、计算机可执行软件、 或数字电路中实现。软件可以存储在计算机可读介质上。例如，计算机可读介质可以包括软 盘、RAM、R0M、硬盘、可移动介质、闪存、记忆棒、光介质、磁光介质、CD-ROM等等。数字电路可 以包括集成电路、门阵列、构造模块逻辑、现场可编程门阵列(FPGA)等等。
[0210] 试剂盒中可以提供用于执行本文所述的方法的试剂、工具和/或指令。这样的试剂 盒可以包括用于从患者(诸如通过活检）收集组织样品的试剂，和用于处理该组织的试剂。 该试剂盒还可包括用于进行表达水平分析的一种或多种试剂，例如用于进行核酸扩增，包 括RT-PCR和qPCR、NGS、northern印迹、蛋白质组分析或免疫组织化学以测定患者的样品中 的生物标志物的表达水平的试剂。例如，这样的试剂盒中可包括用于进行RT-PCR的引物，用 于进行northern印迹分析的探针，和/或如本文讨论用于进行蛋白质组分析诸如Western印 迹、免疫组织化学和ELISA分析的抗体或适配子。还可包括用于测定的适当的缓冲液。还可 包括这些测定中的任一种所需的检测试剂。所述试剂盒可以是例如基于阵列或PCR的试剂 盒，并且可以包括例如额外的试剂，诸如聚合酶和/或dNTP。本文特征的试剂盒还可以包括 描述如何执行用于测量表达水平的测定的说明单。
[0211 ]所述试剂盒可以包括与以下中的至少一种互补的一种或多种引物对：
[0212] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0213]所述试剂盒还可以包括与参考基因互补的一种或多种引物对，例如与TPT1、RPS14 或RPL37A中的至少一种互补的引物。
[0214] 这样的试剂盒还可以包括与以下中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45或46互补的引物对：
[0215] TRPM3、PDRG1、SRSF5、PDE4D、F12、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CENPF、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、HJURP、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。
[0216] 所述试剂盒可以包括与TRPM3、roRGl、F12、CENPF、HJURP、RNFT2和SSTRl中的至少 一种互补的一种或多种引物对和与 SRSF5、roE4D、roK4、ADAMTSl、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、 MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、 50〇52、50053、5了66六1^1、了502201、乂8?1和2??36中的至少一种互补的一种或多种引物对。
[0217] 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的试剂盒可以允许测定ADAMTS9、EMP1、 F3、LDLR、LGALS3、MALAT 1、MTUS 1、NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3 和 TSC22D1 中的至少一 种的甲基化状态。测定的甲基化状态，其可以是过度甲基化，用于提供所述前列腺癌的表征 和/或预后。这样的试剂盒可以包括用于直接测定一种或多种基因的甲基化状态的引物和/ 或探针。因此，它们可以包含通过杂交区分DNA的甲基化和未甲基化形式的甲基化特异性引 物和/或探针。这样的试剂盒通常还含有选择性修饰CpG二核苷酸基序的甲基化或未甲基化 形式的试剂。合适的化学试剂包含肼和亚硫酸氢根离子。实例是亚硫酸氢钠。然而，所述试 剂盒可以含有如上文所讨论测定甲基化状态的其它试剂，诸如限制性内切酶。
[0218] 因此，本发明还涉及用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的试剂盒，其包含如 上所述的一种或多种抗体或适配子。
[0219] 如上所讨论，在某些实施方案中，TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、HJURP、RNFT2和SSTR1 中的至少一种或F0XM1的增加的表达水平表明复发和/或转移和/或不良预后的增加可能 性。在进一步实施方案中，SRSF5、PDE4D、PDK4、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、 CREM、DKK1、EMP1、ERRF11、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、 MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、 30〇33、3了66六1^1、了302201、乂8?1和2??36中的至少一种的降低的表达水平表明复发和/或转 移和/或不良预后的增加可能性。
[0220] 因此，本文所述的试剂盒可以包含用于测定TRPM3、PDRG1、F12、CENPF、HJURP、 1?^12、和55了1?1中的至少一种或卩(^]\11和51?卩5、^^40、？01(4、厶0厶1?'51、厶0厶1?'59、836阶5、 CD3 8、CEBPD、CREM、DKK1、EMP1、ERRFI1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、 51^：15厶2、5(^52、5(^53、5了66厶1^1、了502201、父8?1和2卩?36中的至少一种的表达水平的引物、 探针或抗体/适配子。因此，所述试剂盒可以并入测定上调的标志物和下调的标志物的组合 的表达水平的试剂。合适的抗体和/或引物/探针可以源自本文的表B、C和D。
[0221] 试剂盒中包括的信息材料可以是涉及本文描述的方法和/或用于本文描述的方法 的试剂的用途的描述性的、指导性的、销售的或其它的材料。例如，试剂盒的信息材料可含 有联系信息，例如，物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中试剂盒的用户可获得关 于进行基因表达分析和解析结果的大量信息。
[0222] 所述试剂盒可以进一步包含如上所述的计算机应用或存储介质。
[0223] 先前呈现的实施方案中所述的实例系统、方法和动作是说明性的，并且，在替代实 施方案中，某些动作可以以不同次序、相互并行、整体忽略和/或在不同实例实施方案之间 组合来执行，和/或可以执行某些额外动作，而不偏离各个实施方案的范围和精神。因此，这 样的替代实施方案包括于本文所述的实例中。
[0224] 尽管上面已经详细描述了特定实施方案，但该描述仅仅用于说明目的。因此，应该 理解，上述许多方面不意欲作为必需或重要元素，除非另有明确陈述。
[0225] 实例实施方案的公开方面的修改或与之对应的等效组分或动作，除了上述那些之 外，可以由受益于本公开内容的本领域普通技术人员做出，而不偏离以下权利要求中限定 的实施方案的精神和范围，其范围应符合最宽泛的解释，从而涵盖这样的修改和等效结构。
[0226] 附图描述
[0227] 图 1
[0228] 包含70个原发性前列腺癌、20个具有伴随转移性疾病的原发性癌症、11个转移性 疾病和25个正常前列腺样品FFPE的FFPE前列腺癌样品集合的无监督的分层聚类分析。
[0229] A.使用数据集间变化最大的基因鉴定了与转移性疾病应用聚类的原发性肿瘤的 子集(卡方 2.77xl〇-1〇)。
[0230] Β.使用从Taylor和同事公开的数据集的内部数据集的鉴定的1083个差异表达的 基因的半监督的分层聚类分析鉴定了与转移性疾病应用聚类的原发性肿瘤的类似亚簇(卡 方2.78x10- 6)。
[0231] C.如果患者是或不是转移性生物学组的一部分，他们在手术之后保持无病的概率 的Kaplan-Meier分析，风险比通过对数秩检验进行测定。
[0232] 图2
[0233] A.83个过表达的基因与来自出版物的F0XM1CHIP-Seq命中重叠，重叠 p-值 9.269x10-5的超几何检验。
[0234] B ·与FOXMlCHIP-seq命中重叠且仍然是过表达目标的39个过表达目标的Pearson 相关性评分的盒形图。T-检验(p-值〈0.0001)。
[0235] 图3
[0236] A. GREAT (http://be jerano.stanford.edu/great/public/html/)功能分析，其中 甲基化探针位于的基因组区域的分子功能。
[0237] B.表明低表达基因与EZH2和H3K27me3的CHIP-SEQ鉴定的目标重叠的维恩图，重叠 的超几何检验。
[0238] C.表明低表达基因与过度甲基化的且H3K27me 3修饰重叠的维恩图。
[0239] 图 4
[0240] 显示在排序靠前的10,000个探针组之间的重叠，包括至少在转移性生物学亚组和 非转移性生物学亚组之间相关的重叠（"列表1和2"）和在非转移性生物学亚组和良性组之 间高度相关的重叠（"表3"），的维恩图。
[0241] 图5
[0242] 内部数据集中鉴定的样品簇的GAP分析。
[0243] 图 6
[0244] 使用Toppfun(http: //toppgene · cchmc · org/)差异表达的1182个独特基因的功能 分析。
[0245] A.低表达的基因的重要分子过程
[0246] B.过表达的基因的重要分子过程。
[0247] 图7
[0248] 筛选潜在IHC抗体的研究概述 实施例
[0249] 通过引用以下实验实施例将进一步理解本发明。
[0250] 结果
[0251] 无监督分层聚类分析鉴定通过转移性生物学定义的前列腺癌中的不同分子亚型
[0252] 我们假设，具有转移潜能的原发性前列腺癌与转移性疾病和具有已知伴随转移的 原发性疾病在转录上是类似的。为了鉴定该转移性亚组，我们采取无监督分层聚类分析方 法，其使用70个切割的临床上限于前列腺的原发性前列腺癌、20个具有已知伴随转移性疾 病的原发性前列腺癌、11个具有转移性疾病的淋巴结和25个正常前列腺样品。使用整个数 据集中的最可变的探针组进行聚类分析。GAP统计学检验(Tibshirani等人，2001)鉴定了 2 个具有统计学意义的主要样品簇(图1A，图5)。
[0253]这些分子亚组之一对于转移性疾病和具有已知伴随转移的原发性肿瘤具有显著 富集(卡方P = 2.77xl(T1())。重要的是，在该组中还发现29个原发性前列腺样品，其没有呈现 转移性疾病，但共享类似的转录生物学。该组肿瘤在此被称为"转移性生物学亚组"，且第二 亚组被称为"非转移性亚组"。
[0254] 接下来，我们在转移性和非转移性亚组中的原发性肿瘤之间进行基因表达分析， 并且鉴定了 1182个差异表达的转录物。这些转录物中的大多数在转移性亚组中低表达 (1099个低表达相比于83个过表达）。
[0255] 为了鉴定1182个差异表达的基因在第二数据集中是否是预后的，我们使用所述基 因以聚类分析由Taylor和同事(Taylor等人，2010)公开的前列腺癌数据集，该数据集表示 PSA随访可用的由手术管理的前列腺癌。与我们的内部培训集合一致，我们发现2个稳健的 样品簇，其中一个表明对于转移性样品的富集(卡方P = 2.78xl(T6(图1B)。重要的是，该组还 含有63个在呈现时无已知转移性疾病的原发性肿瘤样品。Kaplan Meier分析表明，转移性 生物学组内的原发肿瘤在手术后具有较短的疾病复发时间（图1C)(风险比(HR)2.377和p值 0.0351)。样品簇的临床和病理特征详述于表1中。重要的是，在其它预后临床因素诸如治疗 前的分期、分级或PSA水平中没有差异。
[0256] 作为转移性生物学组基础的分子途径
[0257] 为了确定哪些分子途径导致转移性表型和不良预后，我们使用1182个在转移性和 非转移性亚组之间差异表达的基因进行途径分析。这在转移性亚组中鉴定了 10个显著过表 达的途径和20个低表达的途径(表2i和2ii)。有趣的是，转移性亚组中过表达的大多数途径 与有丝分裂进程相关(表2i)，而低表达的分子途径参与细胞粘附、形态学、ATF2和p53转录。
[0258] 为了确定这些分子途径中的哪些负责不良预后，我们使用代表每个途径的基因来 聚类分析Taylor数据集以及Sun和同事(Sun等人，2009)公开的第二数据集。该后面的数据 集代表具有PSA随访的用手术管理的原发性前列腺癌。复发时间的Kaplan Meier分析用于 每个观察簇(表2i和2ii)。
[0259] 在过表达的分子途径中，只有F0XM1转录因子网络在Taylor数据集中是显著预后 的(HR 2.755p = 0.0134)。此外，F0XM1本身在我们的内部训练数据集中的转移性生物亚组 中是过表达的(FC 2.13)。为了确定增加的F0XM1是否负责有丝分裂基因在转移生物学组中 的过表达，我们研究了 Sander和同事以及Chen和同事(Chen等人2013，Sander等人2013)公 开的2个公共FoxMl CHIP-Seq数据。我们重叠了鉴定的F0XM1 CHIP-Seq目标与转移生物学 组中过表达的基因。明显地，转移性亚组中的83个过表达的基因中的39个被任一数据集中 的F0XM1结合，其中20个是两者共同的。该重叠是高度显著的（9.269xl〇- 5)。此外，我们进行 了内部数据集中所有过表达转录物针对F0XM1水平的相关性分析(补充表3)。通过CHIP-Seq 数据的分析鉴定的39个F0XM1与非CHIP目标的相关性的比较表明，与CHIP-Seq目标的F0XM1 不结合的那些相比，对于F0XM1目标的相关性评分高度显著增加（t检验p-值〈0.0001)(图 2B)。总之，该数据强烈地表明，FoxMl过表达负责转移性亚组中被检测为过表达的83个基因 的大子集的转录活化。
[0260]在Taylor和Sun两者的数据集中显著预后的低表达分子途径是肌肉收缩、脂肪形 成和ATF2转录目标。地尔硫卓途径在Taylor数据集中是显著预后的，而整联蛋白信号传导 和P53的转录目标(尽管在Taylor数据集中损失)仅在Sun数据集中达到预后意义。
[0261 ]基因表达的表观遗传沉默发生于转移性生物学亚组中
[0262] 转移性生物学亚组中的大多数差异表达的基因下调。接下来，我们询问哪些潜在 机制可以负责转移性生物学组中的基因表达的该显著损失。分子过程的分析鉴定了参与染 色质结合的基因过表达（图6)，重要的是，我们注意到，已知参与表观遗传基因调控的几个 基因上调，包括AR、EZH2、HELLS和UHRF1)(表3)。
[0263] UHRF1在转移性生物学亚组中过表达(2.375倍）。该蛋白近来已显示促进并维持前 列腺癌中的表观遗传沉默(Babbio等人2012)。1]!11^1可以结合至半甲基化的CpG，并且可以 招募DNMT1以维持DNA甲基化模式(Bostick等人2007，Sharif等人2007)。启动子处或附近的 DNA甲基化的增加率已经显示与降低的基因表达相关，这最可能与转录因子对基因启动子 的可及性相关。
[0264] 因此，我们使用高含量DNA甲基化阵列(样品详见补充表3中）测量来自我们的临时 训练集(每个亚组11个）的22个肿瘤的子集中的DNA甲基化水平。转移性亚组中的1098个低 表达基因的整体分析表明，418个具有增加率的DNA甲基化(重叠的p值1.546xl(T 34)(表4)。 此外，过表达的基因集的分析显示没有显著的超或低甲基化状态，由此表明改变的甲基化 状态在过表达基因集中是不重要的。
[0265] 超甲基化的基因组区域的GREAT (http : //be jerano .stanford.edu/great/ public/html/)分析表明许多富集的分子过程（图3A)，特别是DNA结合和转录因子功能。这 表明甲基化不仅直接沉默转移性生物学组中的基因，而且可负责参与转录的基因的损失， 引起基因表达的进一步损失。
[0266] 参与表观遗传沉默的另一种基因 EZH2在转移性生物学组中超过2倍过表达(表3)。 EZH2是PRC2 (多梳抑制复合物2)(两类多梳家族蛋白或(PcG)之一）的组分。该复合物具有组 蛋白甲基转移酶活性，且EZH2是催化亚基。事实上，EZH2表达是组蛋白甲基转移酶活性的关 键决定因素。PRC2复合物在赖氨酸27上使组蛋白H3三甲基化（即H3K27me3)，该位点是转录 沉默染色质的标志。为了确定EZH2功能是否可以负责转移性亚组中的基因表达的至少部分 损失，我们使用了公共CHIP-Seq(W U等人2012)前列腺癌细胞系数据集。具体地，我们将已知 结合EZH2和H3K27me3的基因与转移性生物学亚组中被抑制的基因进行比较（图3B)。显著数 目的低表达基因被EZH2、H3K27me3或两者结合(p-值2.597xl0- 12)，由此强烈暗示经由EZH2 介导的组蛋白修饰的染色质沉默为转移性亚组内的基因子集沉默的关键机制。
[0267] 有趣的是，只有一定比例的表观遗传沉默的目标（123/602)具有增加率的超甲基 化（图3C)，并且被预测具有H3K27me3相关的组蛋白修饰，由此表明两种机制可能在很大程 度上独立地工作以沉默基因表达。
[0268] 用于检测转移性生物学亚组的方法
[0269] 分层聚类分析是来自许多样品的基因表达数据的有用分析方法，然而它不能用于 前瞻性分类个别肿瘤。此外，在先前研究中，我们已经表明，前列腺癌中的肿瘤异质性引起 肿瘤活检样品和从同一患者切割的肿瘤的概况之间显著不一致。因此，我们决定开发适合 于免疫组织化学(IHC)的标志物，其将前瞻性分类肿瘤与转移性生物学亚组是否是类似的。
[0270] 为了实现这一点，我们采用2种方法，首先我们鉴定在转移性生物学亚组和非转移 性生物学亚组之间差异表达、但在非转移性生物学亚组和正常之间几乎没有表达差异的转 录物。该方法使用2-样品t检验法鉴定了 393个探针组，这些探针组中的~75%在非转移性 生物学亚组中与转移性生物学亚组中相比过表达。我们将该方法称为靶向性的，因为测试 例内的正常前列腺可以用作参考。
[0271] 对于第二种方法，我们评价了 1182个在转移性生物学亚组和非转移性亚组之间差 异表达的基因，在该情况下，因为非转移性生物学组和良性/正常之间可能存在表达差异， 要求参考目标，为了鉴定合适的参考，我们鉴定了无论亚组而在所有前列腺癌样品中具有 最小表达方差的基因（最好的3个基因概述于表7中）。
[0272] IHC目标的预后效用
[0273] 对于第一种方法，将393个探针组映射至基因水平，以协助外部数据集(Taylor等 人2010)的独立评估。在该数据集中，检测总共349个基因。我们使用生物化学复发时间以针 对年龄、分级和分期校正的Cox比例风险在Taylor中进行这些349个基因的多变量分析，这 导致产生7个具有显著多变量预测功能(p-值〈0.05.)的基因，这些是TRPM3、PDRG1、SRSF5、 PDE4D、CNPY4、F12和PDK4。（表5)还进行单变量存活分析，其中52个基因是显著的，？-值〈 0.05。在这些排序靠前的探针组中存在3个基因的重叠;这些是SRSF5、TOE4D和TOK4。还使用 anova检验评价393个探针组，以确定它们与临床因素、即病理学Gleason评分(和Gleason评 分1和2)是否是显著相关的。
[0274] 对于第二种方法，在相同的多变量分析中测试1182个差异表达的基因，这鉴定了 56个具有显著多变量预后功能(p-值〈0.05 .)的基因，（表6)。还进行单变量存活分析，其中 304个独特基因是显著的，p-值〈0.05。在这些排序靠前的探针组中存在41个基因的重叠。具 有显著多变量预后功能的目标的数目在验证的范围之外，因此，我们通过交叉参考预后途 径(表2i和2ii)、F0XMlCHIP-Seq命中和选择的文献综述而进一步改善列表。来自聚焦、途径 和文献比较的最佳14个基因概述于表7中。F0XM1本身和表明显著多变量预后能力的差异表 达的F0XM1CHIP-Seq目标概述于表9中。
[0275] 讨论
[0276] 由于大多数发展早期前列腺癌的男性不会死于该疾病，所以明确要求更好地理解 作为转移扩散的基础的生物学。这可允许适当选择高风险患者用于侵袭性更强的主要疗 法，且使低风险患者免去不必要的副作用。
[0277] 在本研究中，我们已经鉴定了在分子水平类似于转移性疾病的一组原发性前列腺 癌。这些肿瘤通过几个基因和限定途径的表达损失来定义;此外，该组通过导致参与有丝分 裂的基因表达增加的原癌基因 F0XM1的活化来定义。
[0278]我们已经定义了一系列具有多变量预后能力且高度适合于IHC开发的标志物，以 前瞻性评价肿瘤是否具有复发和转移发展的增加可能性。
[0279]表 1
[0281] Taylor数据集中的转移性生物学肿瘤和非转移性生物学组的临床和病理标准。
[0282] 表2i
[0285] 如使用Toppfun检测的显著过表达的途径，指明途径p-值，Kaplan meier存活分析 结果使用途径来聚类分析和定义类别标记iTaylor和Sun数据集。
[0286]表2ii
[0289] 如使用Toppfun检测的显著低表达的途径，指明途径p-值，Kaplan meier存活分析 结果使用途径来聚类分析和定义类别标记i Taylor和Sun数据集。
[0290] 表 3
[0292] 注释为染色质结合的基因，转移性生物学组相比于未校正和FDR校正的p-值的倍 数变化表达。注明公开的转录抑制中的作用。
[0293] 表 4
[0295] 转移性生物学组中具有增加的过度甲基化的过表达或低表达的基因，检验重叠的 显著性的超几何检验。
[0296] 表 5
[0298] 基于Taylor数据集中的多变量存活分析的排序靠前的预后标志物。[0299] 表 6
[0303] 基于在转移性生物学亚组和非转移性生物学亚组之间差异表达的基因的Taylor 数据集中的多变量存活分析的排序靠前的预后标志物。
[0306] 概述的IHC目标与参考基因。
[0307]表 8
[0309] 具有增加的过度甲基化水平的最佳低表达标志物。
[0310] 表9
[0314] 在转移性生物学组中差异表达的F0XM1和FOXMICHIP-Seq目标。
[0315] 方法 [0316]患者样品
[0317] Addenbrookes医院和Karolinska研究所遵循当地伦理批准提供126个样品（70个 切割的临床上限于前列腺的原发性前列腺癌、20个具有已知伴随转移性疾病的原发性前列 腺癌、11个具有转移性疾病的淋巴结和25个正常前列腺）。
[0318] 在Taylor等人公开的含有179个样品（131个原发性肿瘤、29个正常和19个转移性 疾病）的数据集中验证和测试亚组和预后意义。手术后的生物化学复发时间和复发状态用 于测试预后意义，5个样品因为（手术类型PCA0056,和新辅助治疗，PCA0050、PCA0103、 PCA119和PCA0176)而从分析中排除。
[0319] Sun等人(79个肿瘤样品），样品为手术后，79例，其中39例被分类为具有疾病复发。
[0320] 基因表达谱分析
[0321] 使用如前所述（Kennedy RD，Bylesjo M, Kerr P 等人.Development and independent validation of a prognostic assay for stage II colon cancer using formalin-fixed paraffin-embedded tissue .J Clin Oncol 2011;29:4620-4626)的 Roche高纯RNA石錯试剂盒(Roche Diagnostics Ltd.)从肉眼切割的FFPE肿瘤样品提取总 RNA。如前所述，使用NuGEN WT-〇vation?FFPE系统（NuGEN)扩增总RNA，并且使其与Almac前 列腺癌
[0322]统计学分析方法
[0323]单因素 AN0VA分析使用abs(FC)>2的倍数变化(FC)阈值和针对错误发现率(FDR)调 整的显著性P-值阈值(P-值roR〈0.05)鉴定29个原发性转移性生物学组肿瘤和41个原发性 非转移性生物学肿瘤组对照之间差异表达的探针组。独特基因被确定为与比对的至少6探 针处于有义方向的基因。
[0324] 将组合的背景和方差过滤器应用于数据矩阵，以便使用内部开发的特征选择程序 鉴定最可变的基因。首先，应用背景过滤器以去除表达值太低而无法与背景噪声区分的基 因。高阈值用于去除大量探针，并确保这些探针高表达（阈值:〈=1〇_ 16)。其次，将强度依赖 性方差过滤器应用于数据矩阵，以去除在所有样品间具有低方差的探针组（阈值:〈=5.10 1)。特征选择导致产生1651个变化最大的探针。
[0325] 将分层聚类分析(Pearson相关距离和Ward氏联系）分别应用于来自每个数据集的 探针和样品。使用缺口统计学确定子簇的数目。
[0326] IHC目标鉴定
[0327] 感兴趣的IHC目标是至少在转移性和非转移性组之间相关的那些(列表1和2)和在 非转移性和良性组之间高度相关的那些(表3)。
[0328] 根据这些标准将三个列表各自中的探针组的相关性p-值进行排序。每个列表中排 序靠前的10,000个探针组中观察到的口-值的范围，对于列表1为[0-6.62 6-05]，对于列表2 为[1 · 03e-19-6 · 17e-04]，且对于列表3为[0 · 99-0 · 82]。
[0329] 三个列表中的排序靠前的10,000个探针组的交叉点揭示512个共同探针（图4)。去 除反义探针组和少于6个探针与探针组比对的那些，留下393个。Partek?基因组 Suite?6.6版用于生成倍数变化值。
[0330] 甲基化
[0331] 对于22个患者，11个转移性生物学亚组和11个非转移性生物学亚组，使用 Recoverall(Life technologies)提取DNA。使用Zymo EZ DNA甲基化试剂盒TM(Zymo Research,Orange，CA,USA)，根据制造商的程序，用当使用IIlumina Infinium甲基化测定 时推荐的替代孵育条件，用亚硫酸氢钠处理基因组DNA(800ng)。根据Infinium HD甲基化测 定方案以50ngAU对4μ1亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行甲基化测定。根据制造商的程序 将样品处理至Illumina 450k阵列上。用相同软件提取未校正的b-值。使用微阵列的显著性 分析（SAM) (Tusher等人2001)评价具有统计学显著的双值(bi values)变化的探针组。使用 〇. 05的错误发现率(FDR)，在阵列上的235，526个探针组中，32，286个被低甲基化(相当于7， 222个独特的基因）且9，184个探针组(4003个独特的基因）。
[0332] 参考文献
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[0355] 补充表1
[0357] 内部样品集的患者特征。
[0358] 补充表2F0XM1相关性
[0370] 整个内部数据集中的过表达的目标与F0XM1水平的Pearson相关性。
[0371] 补充表3
[0372]用于甲基化分析的样品
[0375] 前列腺IHC开发
[0376] 越
[0377] 为了鉴定合适的抗体，我们针对来自生物标志物阳性(通过微阵列概况分析证实） 前列腺癌样品的4uM全断面切片对于选择的目标进行每个目标3种抗体的分析。使用3种抗 原修复方法使用3种稀释度测试每种抗体(图7)。
[0378] 每个全断面切片含有肿瘤、前列腺上皮内瘤(PIN)、正常前列腺上皮、基质和在一 些切片中浸润性免疫细胞的区域。
[0379] 该方法允许鉴定检测感兴趣的目标的抗体、抗原修复方案和稀释度。
[0380]
[0381] 使用前列腺肿瘤的全断面FFPE切片(4μπι)。
[0382] 测试样品：
[0383] 前列腺肿瘤(DI 20052):年龄58:男性。病理-前列腺的腺癌。肿瘤分期:3+4 = 7。
[0384] 前列腺肿瘤(DI 20054):年龄70:男性:病理-前列腺的腺癌。肿瘤分期:3+4 = 7。
[0385] JIM
[0386] 除非另有说明，所有孵育都在室温实施。
[0387] 1.目标修复(FFPE):
[0388] 抗原修复 1-Dako PT Link和3-in_lpH6· 1 目标修复(TR)溶液。
[0389] · _在自动加热和冷却下，97°C20min。
[0390] 抗原修复2-Dako PT Link和3-in_lpH9目标修复（TR)溶液。
[0391] · _在自动加热和冷却下，97°C20min。
[0392] 抗原修复3-Microwave Vector朽1檬酸盐ρΗ6 · 1热诱导的抗原修复(HIER) 〇
[0393] ?将载片脱石蜡和水化，然后用设置为全功率的微波煮沸(3X5min)。
[0394] 所有载片用PBS清洗-lOmin
[0395] 2.测定步骤(DAKO Envision Flex plus)
[0396] · _EnVision过氧化物酶封闭_5min
[0397] · j青洗
[0398] · _Dako CSAII无血清蛋白封闭-lOmin
[0399] ?-空气去除
[0400] · _-抗-30min
[0401 ] · _清洗X2
[0402] · _EnVision Flex/HRP_20min
[0403] · j青洗X2
[0404] · _DAB-10min
[0405] 3.复染和盖片
[0406] Mayer的苏木精复染
[0407] 在递呈系列的乙醇中脱水
[0408] ?在二甲苯中澄清(x3)
[0409] ?在DePeX下的盖片
[0410] 试剂-一抗
[0411] CREM-抗cAMP响应性元件调节剂
[0412] 1 )Abcam 目录号:AB64832，以4、2和lμg/ml测试
[0413] 2)Novus biomedical 目录号:NBP1_81760，以4、2和lμg/ml测试
[0414] 3)Sigma Aldrich 目录号：HPA001818-100UL，以0·8、0·4和0.2μg/ml测试（推荐浓 度0·16μg/ml)
[0415] · R-IgG-兔多克隆IgG(兔同种型对照)Alere目录号:X0936
[0416] ERRFI1 -抗-ERBB受体反馈抑制剂1
[0417] 1 )Abcam 目录号：ab50272，以4、2和lμg/ml测试
[0418] 2) Insight biotechnology 目录号：SC-137154，以4、2和lμg/ml测试（Santa Cruz Biotechnology, Inc.)
[0419] 3)Sigma Aldrich 目录号：HPA027206-100UL，以4、2和lμg/ml测试
[0420] · M-IgGl-小鼠单克隆IgGl(小鼠同种型对照)Alere目录号:X0931
[0421] · R-IgGl-兔多克隆IgG(兔同种型对照)Alere目录号:X0936
[0422] HJURP抗-Hoi 1 iday连结体识别蛋白
[0423] 1 )Abcam目录号:AB100800，以4、2和lμg/ml测试，兔多克隆
[0424] 2)Abcam目录号:AB175577,以4、2和lμg/ml测试，小鼠单克隆
[0425] 3)Biorbyt 目录号:0RB140157,以4、2和lμg/ml测试兔多克隆
[0426] ?兔同种型对照Alere目录号:X0936
[0427] ?小鼠 IgGl对照Alere 目录号:X0931
[0428] PDK4-抗丙酮酸脱氢酶激酶，同工酶4
[0429] l)Sigma Aldrich 目录号：HPA056731-100UL，以4、2和lμg/ml测试
[0430] 2)LifeSpan BioSciences 目录号：LS_B3459，以4、2和lμg/ml测试
[0431] 3)Thermo scientific 目录号：PA5_13778，以4、2和lμg/ml测试
[0432] · R-IgG-兔多克隆IgG(兔同种型对照)Alere目录号:X0936
[0433] · SRSF5-抗-富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子5
[0434] l)Novus Biomedical 目录号：H00006430-B01P，以4、2和lμg/ml测试
[0435] 2)Sigma Aldrich 目录号：HPA043484-100UL，以4、2和lμg/ml测试
[0436] 3)LifeSpan BioSciences 目录号：LS_B3091，以4、2和lμg/ml测试
[0437] · R-IgGl-兔多克隆IgG(兔同种型对照)Alere目录号:X0936
[0438] · Sigma Aldrich目录号：F3520-1ML
[0439] ?多小鼠 IgG(M_IgGl、2a、2b)
[0440] · M-IgGl-Alere 目录号：X0931
[0441] · M-IgG2a_Alere 目录号：X0943
[0442] · M-IgG2b_Alere 目录号：X0944
[0443] PDRG1-抗-p53和DNA损伤-调节的蛋白1
[0444] 1 )Abcam 目录号:AB175965，以4、2和lμg/ml测试
[0445] 2)Biorbyt 目录号：0RB162334,以4、2和lμg/ml测试
[0446] 3)Novus Biomedical 目录号:NBP2_01854,以4、2和lμg/ml测试
[0447] · Μ-IgGl-小鼠单克隆IgGl(小鼠同种型对照)Alere目录号:X0931
[0448] · R-IgGl-兔多克隆IgG(兔同种型对照)Alere目录号:X0936
[0449] 结果
[0450]在概览所有数据之后，以下目标已经表明特定性且灵敏的IHC测定法，并且可用于 前列腺癌分类或预后。
[0453] 本发明的范围不限于本文描述的具体实施方案。事实上，除了本文描述的那些以 外，本发明的各种改变对于本领域技术人员而言，从前面的描述和附图将是显而易见的。这 样的改变意欲落入所附权利要求的范围之内。此外，本文描述的所有实施方案都被认为是 广泛适用的且适当时可以与任何和所有其它一致实施方案组合。
[0454] 本文引用各种出版物，其公开内容以其整体通过引用并入。
【主权项】
1. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方法，其包括:测定来自所述受试者的样 品中以下中的至少一种的表达水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中测定的表达水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后。2. 权利要求1的方法，其包括测定以下中的至少一种的表达水平： SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、F3、CENPF、MYBPC1、SELE、CEBPD和XBP1。3. 权利要求1或2的方法，其中所述前列腺癌的表征和/或预后包括预测复发的增加可 能性和/或预测转移的增加可能性，基本上由其组成，或由其组成。4. 权利要求1或2的方法，其中所述前列腺癌的表征和/或预后包括确定所述前列腺癌 是否具有不良预后，基本上由其组成，或由其组成。5. 任一前述权利要求的方法，其包括将所述表达水平与参考值或一个或多个对照样品 中的表达水平进行比较。6. 任一前述权利要求的方法，其中将所述表达水平与一个或多个对照样品中的相同基 因的表达水平进行比较。7. 任一前述权利要求的方法，其中将样品中的前列腺癌细胞中的SRSF5、PDK4、PDRG1、 TRPM3、PDE4D和F12中的至少一种的表达水平与相同样品中的正常细胞中的相同基因的表 达水平进行比较。8. 任一前述权利要求的方法，其进一步包括测定参考基因的表达水平。9. 任一前述权利要求的方法，其中将以下中的至少一种的表达水平与参考基因的表达 水平进行比较： CREM、ERRFI1、HJURP、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36。10. 权利要求8或权利要求9的方法，其中所述参考基因是TPT1、RPS14或RPL37A。11. 任一前述权利要求的方法，其中HJURP、PDRG1、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2 和 SSTR1 中 的至少一种的增加的表达水平表明复发和/或转移和/或不良预后的增加可能性，和/或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、 IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS 3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、 OAT、P115、PTGS2、RHOBTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、SOCS2、SOCS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和 ZFP36中的至少一种的降低的表达水平表明复发和/或转移和/或不良预后的降低可能性。12. 任一前述权利要求的方法，其中在蛋白质、RNA或表观遗传修饰的水平测定所述表 达水平。13. 权利要求12的方法，其中所述表观遗传修饰是DNA甲基化。14. 任一前述权利要求的方法，其中通过免疫组织化学测定所述表达水平。15. 任一前述权利要求的方法，其中使用与标记缀合的抗体测定所述表达水平。16. 任一前述权利要求的方法，其中通过微阵列、northern印迹、RNA-seq(RNA测序）、原 位RNA检测或核酸扩增测定所述表达水平。17. 任一前述权利要求的方法，其进一步包括从所述样品提取总RNA。18. 任一前述权利要求的方法，其进一步包括从所述受试者获得样品。19. 任一前述权利要求的方法，其中所述样品包含前列腺组织，基本上由其组成，或由 其组成。20. 任一前述权利要求的方法，其中所述样品包含福尔马林固定的石蜡包埋的活检样 品，基本上由其组成，或由其组成。21. 任一前述权利要求的方法，其包括测定HJURP、roRGl、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2、和 SSTR1和CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、 EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、 NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、 TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一种的表达水平。22. 用于选择受试者中的前列腺癌的治疗的方法，其包括： (a) 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中测定的表达水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后，和 (b) 选择对于所述前列腺癌的表征和/或预后适当的治疗。23. 用于选择受试者中的前列腺癌的治疗的方法，其包括： (a) 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中测定的表达水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后 (b) 选择对于所述前列腺癌的表征和/或预后适当的治疗，和 (c) 用选择的治疗来治疗所述受试者。24. 权利要求22或23的方法，其中如果所述前列腺癌的表征和/或预后结果是复发和/ 或转移和/或不良预后的增加可能性，则选择的治疗是以下中的一种或多种： a) 抗激素治疗剂，优选比卡鲁胺和/或阿比特龙 b) 细胞毒性剂 c) 生物制品，优选抗体和/或疫苗，更优选Sipuleucel-T d) 放射疗法，任选扩大的放射疗法，优选扩野放射疗法 e) 靶向疗法 f) 手术。25. 治疗前列腺癌的方法，其包括向受试者施用化疗剂或放射疗法，任选扩大的放射疗 法，优选扩野放射疗法，或者对受试者实施手术，其中基于如权利要求22至24中任一项中请 求保护的方法选择所述受试者用于治疗。26. 用于治疗受试者中的前列腺癌的化疗剂， 其中基于如权利要求22至24中任一项中请求保护的方法选择所述受试者用于治疗。27. 治疗前列腺癌的方法，其包括： 向受试者施用化疗剂或放射疗法，任选扩大的放射疗法，优选扩野放射疗法，或者对受 试者实施手术，其中所述受试者具有HJURP、roRGl、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2和SSTRl中的至 少一种的增加的表达水平和 / 或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、DKK1、EMP1、F3、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、 MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、 S0CS2、S0CS3、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一种的降低的表达水平。28. 用于治疗受试者中的前列腺癌的化疗剂， 其中所述受试者具有HJURP、PDRG1、TRPM3、F12、CENPF、RNFT2和SSTR1中的至少一种的 增加的表达水平和 / 或 CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、PDE4D、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、 CEBPD、DKK1、EMP1、F3、IL1R1、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、 MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、 ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36中的至少一种的降低的表达水平。29. 权利要求25或27的方法，或权利要求26或28的用于治疗受试者中的前列腺癌的化 疗剂， 其中所述化疗剂包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成： a) 抗激素治疗剂，优选比卡鲁胺和/或阿比特龙 b) 细胞毒性剂 c) 生物制品，优选抗体和/或疫苗，更优选Sipuleucel-T和/或 d) 靶向的治疗剂。30. 权利要求24或29的方法，其中所述细胞毒性剂是基于铂的药剂和/或紫杉烷。31. 权利要求30的方法，其中所述基于铂的药剂选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。32. 权利要求30的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他赛。33. 抗体，其特异性结合至以下中的至少一种的蛋白质产物： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36。34. 权利要求33的抗体，其与标记缀合。35. 权利要求33或34的抗体用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的用途。36. 用于诊断受试者中的具有增加的转移潜能的前列腺癌的方法，其包括： 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 其中测定的表达水平用于鉴定受试者是否患有具有增加的转移潜能的前列腺癌。37. 用于诊断受试者中的具有增加的转移潜能的前列腺癌的方法，其包括： 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表达水平： SRSF5、PDK4、TRPM3、PDRG1、PDE4D和F12 其中测定的表达水平用于鉴定受试者是否患有具有增加的转移潜能的前列腺癌。38. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方法，其包括:测定来自所述受试者的 样品中以下中的至少一种的表达水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36或 以鉴定特征在于复发和/或转移的增加可能性的细胞的存在或不存在，其中测定的所 述细胞的存在或不存在用于提供所述前列腺癌的表征/或预后。39. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方法，其包括： a) 从所述受试者获得样品 b) 将对于以下中的至少一种的蛋白质产物特异性的抗体应用于来自所述受试者的样 品： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 c) 应用检测抗体-蛋白质复合物的检测试剂 d) 使用所述检测试剂以测定所述蛋白质的水平 d)其中测定的蛋白质的水平用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后。40. 用于执行任一前述权利要求的方法的系统或装置。41. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的系统或测试试剂盒，其包含： a) -种或多种测试装置，其用于测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的表 达水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、SOCS2、SOCS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 b) 处理器;和 c) 包含计算机应用的存储介质，当由所述处理器执行时，所述计算机应用被配置为： (i)在一种或多种测试装置上访问和/或计算所述样品中以下中的至少一种的测定的 表达水平： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 (ii) 计算所述样品中以下中的至少一种的水平是增加还是降低： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和 (iii) 从所述处理器输出所述前列腺癌的表征和/或预后。42. 权利要求41的系统或测试试剂盒，其进一步包含用于从所述处理器输出的显示器。43. 计算机应用或包含如权利要求41或42中定义的计算机应用的存储介质。44. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的方法，其包括： 测定来自所述受试者的样品中以下中的至少一种的甲基化状态： ADAMTS9、EMP1、F3、LDLR、LGALS3、MALAT1、MTUS1、NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3和 TSC22D1 其中测定的甲基化状态用于提供所述前列腺癌的表征和/或预后。45. 权利要求44的方法，其中如果八0厶10^94]\031、卩3、1^1^、0^1^3、]\^1^1!、]\0'1]51、 NR4A3、PTGS2、RIN2、SLC15A2、S0CS3和TSC22D1中的至少一种被过度甲基化，则复发和/或转 移的可能性增加。46. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的试剂盒，其包含一种或多种权利要求33 或34的抗体。47. 权利要求46的试剂盒，其进一步包含权利要求43的计算机应用或存储介质。48. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的计算机程序产品，其包含具有在其上实 施的计算机可读程序指令的非临时性计算机可读存储装置，所述计算机可读程序指令引起 所述计算机： (i) 在一种或多种测试装置上访问和/或计算样品中以下中的至少一种的测定的表达 水平：CREM、ERRF11、SRSF5、PDK4、H JURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36; (ii) 计算所述样品中以下中的至少一种的水平是增加还是降低:CREM、ERRFI 1、SRSF5、 PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、FI2、ADAMTS1、ADAMTS9、B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、 DKK1、EMP1、F3、IL1Rl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、 NFIL3、NR4A3、OAT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RlN2、RNFT2、SELE、SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、 ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36;和 (iii) 提供关于所述前列腺癌的表征和/或预后的输出。49. 用于表征和/或预后受试者中的前列腺癌的试剂盒，其包含一种或多种对于以下中 的至少一种的RNA产物特异性的寡核苷酸探针： CREM、ERRFI1、SRSF5、PDK4、HJURP、PDRG1、TRPM3、PDE4D、F12、ADAMTS1、ADAMTS9、 B3GNT5、CD38、CEBPD、CENPF、DKK1、EMP1、F3、ILIRl、IL8、JUNB、KLF10、KLF4、LDLR、LGALS3、 LPAR1、MALAT1、MTUS1、MYBPC1、NFIL3、NR4A3、0AT、PI15、PTGS2、RH0BTB3、RIN2、RNFT2、SELE、 SLC15A2、S0CS2、S0CS3、SSTR1、ST6GAL1、TSC22D1、XBP1和ZFP36 且进一步包含以下组分中的一种或多种： a) 阻断探针 b) 预扩增分子 c) 扩增分子和/或 d) 标记分子。
【文档编号】G01N33/574GK105940117SQ201480074318
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2014年12月12日
【发明人】S·沃克尔, A·麦卡维干, T·达维森, R·肯尼迪, P·哈金, L·希尔
【申请人】阿尔玛克诊断有限公司