高三尖杉酯碱的药物组合物及其在生物医药中的应用
【专利摘要】本发明公开了高三尖杉酯碱的药物组合物及其在生物医药中的应用，本发明提供的高三尖杉酯碱的药物组合物中含有高三尖杉酯碱和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，高三尖杉酯碱、化合物(Ⅰ)单独作用时，对围经期睡眠障碍具有调理作用；高三尖杉酯碱和化合物(Ⅰ)联合作用时，对围经期睡眠障碍的调理作用进一步提高，可以开发成调理围经期睡眠障碍的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
高三尖杉酯碱的药物组合物及其在生物医药中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及高三尖杉酯碱的新用途，具体涉及高三尖杉酯碱 的药物组合物及其在生物医药中的应用。
【背景技术】
[0002] 高三尖杉酯碱(HHPT)是从三尖杉属植物分离出的抗肿瘤生物碱，属细胞周期特异 性药物，对G1和G2期细胞杀伤作用最强，对S期细胞作用较小。HHPT主要抑制真核细胞蛋白 质合成，抑制氨酰基-tRNA对核糖的结合及其核糖体与肽链的形成，因此影响多聚体形成的 前的早期阶段，并使多聚核糖休解聚，干扰蛋白质核糖体功能，对细胞内DNA的合成也有抑 制作用。本品促使细胞核变性坏死过程和三尖杉酯碱相同。HHRT可促进细胞分化及凋亡。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种高三尖杉酯碱的药物组合物，该药物组合物中含有高 三尖杉酯碱和一种结构新颖的天然产物，高三尖杉酯碱和该天然产物可以协同调理围经期 睡眠障碍。
[0004] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0005] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0007] 一种高三尖杉酯碱的药物组合物，包括高三尖杉酯碱、如权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0008] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0009] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0010] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将通关藤粉碎，用65~75%乙 醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃 取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇取物用 大孔树脂除杂，先用20 %乙醇洗脱9个柱体积，再用65 %乙醇洗脱10个柱体积，收集65 %洗 脱液，减压浓缩得65%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中65%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分 离，依次用体积比为65:1、35:1、15:1和7:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步 骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1、7:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为58 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集11~15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到 化合物(I)。
[0011] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用70%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0012] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0013]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物（I)在制备调理围经期睡眠障碍的药物中的应用。
[0015] 上述高三尖杉酯碱的药物组合物在制备调理围经期睡眠障碍的药物中的应用。
[0016] 本发明的优点：
[0017]本发明提供的高三尖杉酯碱的药物组合物中含有高三尖杉酯碱和一种结构新颖 的天然产物，高三尖杉酯碱、化合物（I)单独作用时，对围经期睡眠障碍具有调理;高三尖杉 酯碱和化合物（I)联合作用时，对围经期睡眠障碍的调理作用进一步提高，可以开发成调理 围经期睡眠障碍的药物。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。
[0019] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0020]分离方法：（a)将通关藤(2kg)粉碎，用70%乙醇热回流提取（15LX3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水饱和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用20%乙醇洗脱9个柱体积，再用65%乙醇洗脱 10个柱体积，收集65%洗脱液，减压浓缩得65%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中65%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1 (9个柱体积）、35:1 (10个柱体积）、15:1 (8 个柱体积)和7:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4 用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1(6个柱体积）、7:1(7个柱体积)和1:1(6个柱 体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为58 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集11~15个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (HPLC归一化纯度大于98% )。
[0021] 结构确证:册431-]\^显示[]\?^]+为111/2 489.1916，结合核磁特征可得分子式为 C27H3Q〇7，不饱和度为 13。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，500MHz): H-4 (6 · 69，s)，H-6 (3.21，2H，m)，H-8(2.64，m)，H-9(2.19，d，J = 14.5)，H-9(2.51，d，J = 14.5)，H-ll(6.32，s)， H-17(0.76，d，J = 7.2)，H-18(4.86，s)，H-18(5.02，s)，H-3'（5.89，m)，H-4'（1.72，dq，J = 6·0，1·2)，Η-5'（1.71，s)，2-〇Me(3.81，s)，3-〇Me(3.87，s)，14-〇Me(3.81，s)，12，13-〇CH2〇 (5.83,8)，12，13-〇012〇(5.79,8) ;核磁共振碳谱数据3。(？?111，〇15〇-(16，1251抱）：142.3((：，1-C)，139.5(C，2-C)，151.6(C，3-C)，112.4(CH，4-C)，131.7(C，5-C)，42.9(CH 2,6-C)，151.6 (C，7-C)，39.6(CH，8-C)，33.1(CH2,9-C)，133.2(C，10-C)，105.3(CH，n-C)，147.5(C，12-C)，133.8(C，13-C)，151.7(C，14-C)，120.1(C，15-C)，123.9(C，16-C)，15.6(CH 3，17-C)， 108.7(CH2，18-C)，165.3(C，1'-C)，127.1(C，2'-C)，136.8(CH，3'-C)，15.1(CH3,4'-C)，20.2 (CH 3,5'-C)，59.2(CH3,2-0Me)，55.8(CH3,3-0Me)，60.3(CH 3，14-0Me)，100.4(CH2，12，13-0CH20)。红外光谱表明该化合物含有羰基（1737cnf 1)和苯环（1642和1494CHT1)基团。4和13C-NMR谱显示一个双峰甲基信号WH0.76(3H，d，J = 7.2Hz，Me-17)]，三个甲氧基[δΗ3.81(3Η， 8,2-<1^)，3.87(3!1，8,3-(1^)和3.81(3!1，8，14-(1^)]，两个苄基亚甲基[3!13.21(2!1，111，!1- 6)，2.19(1!1，(1(1，了=14.2,7.5抱，!1-9)和2.51(1!1，(1(1，了 = 14.2,2.6抱，!1-9)]，一个环外亚甲 基信号[5財.86(1!1，8，!1-18)和5.02(1!1，8，!1-18)]，一个亚甲二氧基[5!15.83(1!1，8，12，13-0CH 20)和5.79(1!1，8，12，13-00120)]，两个芳香单质子信号[5册.69(1!1，8，!1-4)和6.32(1!1， s，H-ll)]，以及一个当归酰基[δΗ5·89(1Η，πι，Η-3'），1.72(3H，dq，J = 6.0，1.2Hz，H-4'）和 1.71(3H，s，H-5'）；δ(：165·3((：-Γ )，127· l(C-2'），136.8(C-3'），15· 1(04'）和20·2(C-5 ' ） ] jMBC 谱中三个甲氧基信号 （δΗ3.81 、3.87和 3.81) 与 C-2、C-3 和C-14的交叉峰， 以及亚 甲二氧基信号（δΗ5.83和5.79)与C-12和C-13的相关性证实了这些取代基在联苯系统的位 置。通过 HMBC 谱中 Η2-6 与 C-4、C-5 和 C-16，Η2-9 与 C-10、C-11 和 C-15，Η3-17 与 C-7、C-8 和 C-9， Η2-18与C-6和C-8的相关性，以及从1Η」Η COSY谱中观察到的Η3-17/Η-8/Η2-9序列可知该化 合物含有环辛二烯环。环外亚甲基信号（SH4.86和5.02)，以及碳信号[3(：108.7((：-18)和 151.6 (C-7)]表明C-7和C-18之间存在双键。通过谱图和核磁数据分析，可知当归酰基只能 与C-1位相连。R0ESY谱中，Η-ll与Η_9α(δΗ2.19)和Me-17的相关性表明Me-17为α构型。综合 氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下 所示，立体构型进一步通过Ε⑶试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0022]该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0024] 实施例2:药理作用
[0025]本实施例使用不可预知慢性应激制备抑郁大鼠模型，观察药物提高血清E2、IL_2、 IL-6水平及降低血清FSH、LH水平等方面的抗围绝经期抑郁症睡眠障碍的作用。
[0026] 1、材料与方法
[0027] 1 · 1 动物
[0028]动物清洁级13~15月龄雌性SD大鼠，体重300~500g，由北京斯贝特动物实验中心 提供。
[0029] 1.2试剂与样品
[0030] 尚二尖杉酯喊购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例 1。大鼠 IL-2酶联免疫试剂盒(武汉华美）；大鼠 IL-6酶联免疫试剂盒(武汉华美）；大鼠 IL-Ιβ 酶联免疫试剂盒(武汉华美）。
[0031] 1.3 仪器
[0032] 奥利巴斯荧光显微镜;KH30R台式高速冷冻离心机;美国Forma公司-80 °C超低温冰 箱;美国thermo酶标仪。
[0033] 1.4大鼠分组及模型制备
[0034] 大鼠随机分为5组，每组12只，分别为正常对照组、模型对照组、高三尖杉酯碱组 (80mg · kg-i)、化合物（I)组(80mg · kg-i)、高三尖杉酯碱与化合物（I)组合物组【40mg · kg一1 高三尖杉酯碱+40mg · kg"1化合物（I)】。每组大鼠阴道涂片连续5d:抽取30yL生理盐水，重复 洗大鼠阴道口，然后吸出约20yL液体，放到装有染色剂的EP管中，弹匀，室温放置15min后在 显微镜下观察，确认动物是否处于动情间期，五天连续处于动情间期的动物已进入老（更） 年期。采用不同方法进行18d不可预知慢性应激建立抑郁模型：行为限制2h、电击足底(36V 交流电，每隔lmin刺激1次，每次刺激1 Os，共30次）、冰水游泳（4°C，5min)、热应激(45 °C， 5min)、摇晃（1次/秒，15min)、鼠笼倾斜45度24h、夹尾（lmin)、禁水(24h)、禁食(48h)、明暗 颠倒、潮湿垫料l〇h、空瓶放置lh，连续18d，接受慢性应激的大鼠单笼饲养。慢性应激后72h 剥夺睡眠测试实验后开始给药，连续21d。正常对照组与模型对照组小鼠灌胃给予纯化水； 其余组按照上述剂量灌胃给药。在末次治疗24h后，颈椎脱白法处死大鼠，迅速断头取血5~ 10mL，离心机离心血清。
[0035] 1.5放免法测定大鼠血清中E2、LH、FSH含量
[0036]末次给药24h后，腹主动脉采血8h内分离血清，放免法测定E2(雌二醇）、LH(促黄体 生成激素）、FSH(促卵泡生成激素)含量，按各药盒说明书进行操作。
[0037] 1.6 ELISA检测血清中IL-10、IL-2、IL_6含量
[0038]加样：加一定稀释的待检样品O.lmL于已包被之反应孔中，置37°C孵育lh。然后洗 涤（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）；加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释 的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1mL，37°C孵育0.5~lh，洗涤;加底物液显色:于各反应 孔中加入临时配制的TMB底物溶液0 . lmL，37 °C 10~30min;终止反应：于各反应孔中加入 2mol/L硫酸0.05mL;结果判定:在酶免疫上，于450nm测定吸光度值。
[0039] 1.7统计学方法
[0040]采用SPSS19.0软件包进行分析，数据用均数土标准差(X土s)表示，正态分布资料 使用单因素方差分析，偏态分布使用秩和检验。
[0041 ] 2、实验结果
[0042] 2.1对围绝经期抑郁症睡眠障碍模型大鼠血清性激素含量的影响
[0043]与正常对照组比较，模型对照组大鼠 E2、FSH含量下降、LH升高（P < 0.01);与模型 对照组比较，高三尖杉酯碱与化合物（I)组合物组大鼠 E2、FSH含量明显升高(P<0.01)，LH 明显降低(P<〇.01);与模型对照组比较，高三尖杉酯碱组、化合物（I)组大鼠 E2、FSH含量升 高(P<0.05)，LH 降低(Ρ<0·05)。
[0044] 试验结果见表1。
[0045] 2.2对围绝经期抑郁症睡眠障碍模型大鼠 IL-lf3、IL-2、IL-6含量的影响
[0046] 与正常对照组比，模型对照组大鼠 IL-2、IL-6、IL-li3显著降低(P<0.01)。与模型 对照组比，高三尖杉酯碱与化合物（I)组合物组大鼠 IL-2、IL-6、IL-Ιβ显著提高(P<0.01); 与模型对照组比，高三尖杉酯碱组、化合物（I)组大鼠 IL-2、IL-6、IL-Ιβ提高(P<0.05)。 [0047] 试验结果见表2。
[0048]表1对围绝经期抑郁症睡眠障碍模型大鼠血清性激素含量的影响
[0050] 表2对围绝经期抑郁症睡眠障碍模型大鼠 IL-lf3、IL-2、IL-6含量的影响
[0052] 围绝经期抑郁症睡眠障碍多数学者把它归因于卵巢功能衰退，现代医学研究表 明，雌激素除了与生殖功能相关外，还具有中枢神经系统作用，可调节雌性动物昼夜节律， 影响松果体产生褪黑素，促进昼夜节律的同步发生，当雌激素水平下降时，昼夜节律发生变 化，很可能出现失眠和睡眠中断。此外雌激素可通过影响体温调节中枢来影响睡眠，体温以 最大速率下降时最可能入睡，而且入睡时间越接近体温下降速率时，在睡眠的最初1小时里 觉醒越少，故围绝经期雌激素水平的下降可能改变了体温调节过程，从而引起相当比例的 睡眠障碍。另外雌激素对大脑皮层有抑制作用，雌激素缺乏时，大脑的抑制过程减弱，兴奋 过程相对过高，两者的平衡状态遭到破坏，便表现为失眠。由于体内雌激素水平过度下降， 免疫活性细胞不能获得生理剂量的雌激素刺激，雌激素受体随之下降。继而，免疫活性细胞 不能有效产生足够量的IL-li3、IL-2、IL-6及β-内啡肽等免疫介质，与去甲肾上腺素的比例 失调，最终导致更年期综合征临床证候群。
[0053] 上述结果表明，高三尖杉酯碱、化合物（I)单独作用时，对围经期睡眠障碍具有调 理；高三尖杉酯碱和化合物（I)联合作用时，对围经期睡眠障碍的调理作用进一步提高，可 以开发成调理围经期睡眠障碍的药物。
[0054]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物α)，2. -种高三尖杉酯碱的药物组合物，其特征在于:包括高三尖杉酯碱、如权利要求1所 述的化合物(I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的高三尖杉酯碱的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的 载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附 载体或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的高三尖杉酯碱的药物组合物，其特征在于：所述剂型包括片 剂、胶囊剂、□服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注 射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将通 关藤粉碎，用65~75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用20%乙醇洗脱9个柱体积，再用65%乙醇洗脱 10个柱体积，收集65%洗脱液，减压浓缩得65%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中65%乙醇洗 脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、35:1、15:1和7:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1、7:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为58 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集11~15个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用70%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为D101型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备调理围经期睡眠障碍的药物中的应用。10. 权利要求2~4任一所述的药物组合物在制备调理围经期睡眠障碍的药物中的应
【文档编号】A61K31/55GK105949170SQ201610335174
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】黄芳
【申请人】黄芳