一种上转换发光纳米探针的制备方法及其在测定物质抗氧化活性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种上转换发光纳米探针的制备方法，包括将掺有Yb和Er的NaYF4、NaGdF4或CaF2的一种上转换发光纳米颗粒用赖氨酸、聚乙烯亚胺或聚丙烯酰胺进行氨基化表面修饰，再用胭脂红酸的羧基进行酰胺化表面耦联。用本发明制备而成的探针可用于测定药物抗氧化活性，通过测定待测药物与羟基自由基的混合液在加入上转换发光纳米探针水溶液前后的发光强度变化来测定药物的抗氧化活性高低。本发明测定方法具有操作简单方便，灵敏，快速有效，抗自发信号干扰的优点，克服了现有方法存在的技术问题，为药物评价提供了一种全新的检测方法，可用于快速筛选抗氧化活性高的药物，以及快速比较不同药物之间的抗氧化活性高低，从而为抗氧化性药物研发提供了有效的技术支持。
【专利说明】一种上转换发光纳米探针的制备方法及其在测定物质抗氧化活性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于上转换发光材料及其应用的【技术领域】，特别涉及一种上转换发光纳米探针及其在测定物质抗氧化活性中的应用。
【背景技术】
[0002]镧系掺杂的上转换发光纳米材料利用低能量的近红外光子激发，发射出高能量的可见光，具有很多显著的优点，例如大的反斯托克斯位移，样品本身自发荧光干扰小等，因此在生物传感、生物成像和光动力学治疗领域有广泛的应用。例如Liu X.G.等人在《J.Am.Chem.Soc.》杂志上报道的利用二氧化锰纳米片猝灭上转换发光纳米颗粒的发光后，再加入谷胱甘肽来恢复上转换发光纳米颗粒的发光，实现谷胱甘肽的超灵敏检测；Li F.Y.等人在《J.Am.Chem.Soc.》杂志上报道的用上转换发光纳米颗粒进行细胞内氰离子的成像分析。迄今为止，利用上转换发光纳米颗粒进行药效评价的技术还是很少被报道的。
[0003]氧自由基由于在信号传输、缺血-再关注、炎症和神经组织损伤等生理和病理过程中所起的重要作用而越来越受到人们的重视。其中，羟基自由基具有很强的氧化能力，并能与很多生物基质发生反应，从而引起蛋白质和憐脂的氧化性损伤，DNA序列的变异、重组，调节细胞的增殖和凋亡等生理病变。抗氧化剂由于能清除自由基从而预防或者阻止这些过量自由基引起的疾病，因此大量的研究工作都致力于抗氧化性药物的研发，并且对其抗氧化活性进行评估。例如利用电子自旋共振光谱(Magalhaes L.M.，Segundo M.A.，Reis
S.，Lima J.L.F.C.，Estela J.Μ.，Cerda V.，Anal.Chem.2007，79，3933-3939)，紫外-可见吸收光谱(Li H.,Ma X.Y.,Dong J.，Qian W.P.，Anal.Chem.2009，81，8916-8922)，化学发光光谱(Jiang H.，Ju H.X.，Anal.Chem.2007, 79，6690-6696)等方法来进行抗氧化能力评价。然而，这些方法通常都是需要依赖大型仪器，是十分耗时和昂贵的，并且容易受到实际样品自发信号的干扰。因此，发展一种敏感的，快速有效的，简便的方法来实现药物抗氧化活性评估是十分有必要的。目前，基于这种上转换发光猝灭-恢复模式来评价药物抗氧化活性的工作尚未被报道过。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种上转换发光纳米探针的制备方法，用本发明方法制得的上转换发光纳米探针可应用于测定物质抗氧化活性，该测定方法具有操作简单方便，灵敏，快速有效，抗自发信号干 扰的优点，克服了现有技术存在的技术问题，为药物评价提供了一种全新的检测方法，可用于快速筛选抗氧化活性高的药物，以及快速比较不同药物之间的抗氧化活性高低，从而为抗氧化性药物研发提供了有效的技术支持。
[0005]本发明利用胭脂红酸通过发光共振能量转移的机理猝灭上转换发光纳米颗粒的发光，然后加入羟基自由基使胭脂红酸被降解成小的有机分子从而打断能量转移途径，恢复纳米颗粒的发光，如果将待测样品与羟基自由基混合反应后，由于具有抗氧化活性的待测样品可清除羟基自由基，从而使得上转换发光纳米颗粒发光的恢复将会被抑制，从而根据抑制程度的高低来判断药物抗氧化活性的高低。
[0006]本发明测定方法基于上转换发光猝灭-恢复模式，所述的发光猝灭就是将胭脂红酸通过生物脱水试剂耦联到上转换发光纳米颗粒表面，通过发光共振能量转移途径猝灭其发光，在980nm的激发光下明亮的绿色发光逐渐减弱，直至肉眼看不到颜色的存在；所述的发光恢复，就是将羟基自由基水溶液加入发光猝灭的上转换发光纳米颗粒溶液中，随着浓度的增加，绿色发光开始出现并逐渐由弱到强。本发明抗氧化活性测定是指待测样品与羟基自由基混合后，加入发光猝灭的上转换发光纳米颗粒溶液中，由于具有抗氧化活性的待测样品可清除羟基自由基，从而使得发光增强将会被抑制，样品抗氧化活性越高，抑制程度将越大。
[0007]为实现本发明目的采用如下技术方案:
[0008]一种上转换发光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0009](I)制备绿色发光的上转换发光纳米颗粒，所述上转换发光纳米颗粒的激发波长为980nm，发射波长520~560nm ；
[0010](2)将所述上转换发光纳米颗粒进行氨基化表面修饰，得到氨基修饰的上转换发光纳米颗粒；
[0011](3)将所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒进行酰胺化表面耦联，制得所述上转换发光纳米探针。
[0012]本发明特征还在于:
[0013]所述绿色发光的上`转换发光纳米颗粒选自Yb和Er掺杂的NaYF4或NaGdF4或CaF2 ；所述氨基化表面修饰是指在所述上转换发光纳米颗粒表面修饰分子中含有2个以上氨基的有机分子；所述酰胺化表面耦联是指用胭脂红酸的羧基与所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒表面的氨基之间通过生物脱水试剂形成酰胺来实现耦联。
[0014]所述步骤(1)中上转换发光纳米颗粒的制备方法如下:
[0015]A)将X成分、Yb (CH3CO2) 3、Er (CH3CO2) 3按照摩尔比为80:18:2的量分散在油酸和十八烯的混合溶液中，抽真空100~150°C反应I~2个小时，得稀土离子的前驱液；其中X成分是指 Y (CH3CO2) 3 或 Gd (CH3CO2) 3 或 Ca (CH3CO2) 3 ；
[0016]B)将NaOH和NH4F混合后超声分散在甲醇中，随后逐滴加入所述稀土离子的前驱液中，NaOH、NH4F、所述稀土离子的前驱液的量按照总摩尔数比为1:4:1，搅拌反应0.5~I小时后，加热到80~100°C抽真空10分钟，然后升温到250~300°C在氮气保护下反应I~2个小时，冷却至室温后加入丙酮，离心，去上清液，取沉淀物用乙醇洗涤后真空干燥，即得所述上转换发光纳米颗粒。
[0017]所述步骤(2)中氨基化表面修饰包括以下步骤:取所述上转换发光纳米颗粒超声分散在去离子水中，加入质量分数10%的盐酸调节pH至4.0~5.0，搅拌反应I~2个小时后，用无水乙醚萃取，分离得到的水相，离心，洗涤，将洗涤后的固体分散于赖氨酸的水溶液中，搅拌反应24~48小时，离心，洗涤，即得所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒。
[0018]所述步骤(3)中酰胺化表面耦联包括以下步骤:将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺依次加入胭脂红酸水溶液中反应I~2小时；再加入所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒的水溶液反应12~24小时，离心，洗涤，即得所述上转换发光纳米探针。
[0019]本发明还提供了上述方法制备而成的一种上转换发光纳米探针在测定物质抗氧化活性中的应用。
[0020]所述应用，其特征还在于，所述测定包括以下步骤:
[0021]A)将羟基自由基水溶液加入到所述上转换发光纳米探针的水溶液中进行发光强度的测定，测得发光增强倍数为Etl ；
[0022]B)将羟基自由基水溶液分别与梯度浓度待测物质混合10~30分钟后，分别加入到I~3mL的所述上转换发光纳米探针的水溶液中进行发光强度的测定，测得发光增强倍数为E ；
[0023]C)根据公式Se= (E0-E) /E0计算待测物质对羟基自由基的清除效率，所述羟基自由基的清除效率即用来表示为待测物质的抗氧化活性。
[0024]所述的待测物质包括有机化合物或中药的提取物。
[0025]所述的羟基自由基是由二价铁的乙二胺四乙酸螯合物和双氧水之间的Fenton反应制得。
[0026]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:
[0027]1、本发明上转换发光纳米探针的制备方法具有方法简单、成本低、在一般化学实验室均能完成、易于推广 等优点。
[0028]2、本发明首次利用上转换发光纳米材料来进行物质抗氧化活性测定，为药物评价提供了一种全新的检测方法，本发明方法制备而成的上转换发光纳米探针可用于快速筛选抗氧化活性高的药物，以及快速比较不同药物之间的抗氧化活性高低，从而为抗氧化性药物研发提供了有效的技术支持。
[0029]3、本发明利用上转换发光纳米探针可以有效地避免待测物质自发荧光信号的干扰，极大地提高了技术的灵敏度和准确性。
[0030]4、本发明可以避免使用大型仪器，仅需一个手持式980nm的小型激光器就可进行可视化检测，操作简单，方便快速。
[0031]5、本发明方法样品预处理过程简单快速，较其他技术容易实现。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是上转换发光纳米颗粒的发光光谱图。
[0033]图2是上转换发光纳米颗粒的透射电镜形貌图。
[0034]图3是上转换发光纳米探针的制备过程示意图。
[0035]图4是三种有机化合物的羟基自由基清除效率比较图。
[0036]图5是五种中药的羟基自由基清除效率效率比较图。
【具体实施方式】
[0037]下面结合附图和本发明的【具体实施方式】对本发明作进一步说明:
[0038]1、上转换发光纳米颗粒的制备:
[0039]将207.4mg Y (CH3CO2) 3，70mg Yb (CH3CO2) 3 和 6.9mg Er (CH3CO2) 3 分散在 6mL 油酸和14mL十八烯的混合溶液中，抽真空150°C反应I个小时，得稀土离子的前驱液；[0040]将IOOmg NaOH和148mg NH4F混合后超声分散在IOmL甲醇中，随后逐滴加入所述稀土离子的前驱液中，搅拌反应30分钟后，加热到80°C抽真空10分钟，然后升温到300°C在氮气保护下反应I个小时，冷却至室温后加入丙酮20~40mL，离心，去上清液，取沉淀物用乙醇洗涤3次后真空干燥，得到Yb和Er掺杂的NaYF4纳米颗粒，即为上转换发光纳米颗粒。
[0041]将上述的Y(CH3CO2)3等摩尔替换为Gd(CH3CO2)3或Ca (CH3CO2) 3按上述步骤制备则得到Yb和Er掺杂的NaGdF4或CaF2纳米颗粒，即为上转换发光纳米颗粒。
[0042]所制备出上转换发光纳米颗粒能发射绿色荧光，其激发波长为980nm，发射波长520~560nm。上转换发光纳米颗粒的发光光谱图见图1，上转换发光纳米颗粒的透射电镜形貌图见图2。
[0043]2、上转换发光纳米探针的制备:
[0044](I)对上转换发光纳米颗粒进行氨基化表面修饰:取IOOmg上述干燥的纳米颗粒超声分散在IOmL去离子水中，加入质量分数10%的盐酸调节pH至4.0，室温搅拌反应I个小时后，用无水乙醚萃取，分离得到的水相，离心，用水洗涤3次，将洗涤后的固体分散于IOmL赖氨酸的水溶液中，室温搅拌反应24小时，离心，洗涤，即得所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒。
[0045]本发明也可以用分子中含有2个以上氨基的其它有机分子比如聚乙烯亚胺 或者聚丙烯酰胺进行氨基化表面修饰。
[0046](2)对氨基修饰的上转换发光纳米颗粒进行酰胺化表面耦联:将0.2mL的IOmMl-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亚胺和0.2ml的IOmM N-羟基琥珀酰亚胺依次加入IOml的胭脂红酸水溶液中反应I小时；再加入IOmL的lmg/ml氨基修饰的上转换发光纳米颗粒的的水溶液反应12~24小时，离心，用水洗涤3次，即得上转换发光纳米探针。1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺是生物脱水试剂。
[0047]图3是上转换发光纳米探针的制备过程示意图。
[0048]3、药物抗氧化活性的测定:
[0049]羟基自由基的制备:由二价铁的乙二胺四乙酸螯合物和双氧水之间的Fenton反应制得。Fenton反应:Fe2++H202——>Fe3++0r+^0H (室温下即可反应，^OH即为羟基自由基)
[0050]将待检测的物质配制成水溶液，取10 μ L的0.1mM羟基自由基水溶液与10 μ L梯度浓度的待测物质水溶液充分混合10分钟后，加入到上述ImL的lmg/ml上转换发光纳米探针的水溶液(即由上转换发光纳米探针配制成lmg/mL的水溶液)中进行发光检测。用980nm的小型激光器激发，用普通的荧光光谱仪检测。当加入的待测液中如果没有抗氧化药物，只有羟基自由基时上转换发光纳米探针的发光将迅速恢复；如果有抗氧化药物存在，上转换发光纳米探针的发光增强将会被抑制，并随着抗氧化药物量逐渐加大，发光增强抑制程度就越大，甚至不再增强，据此来确定药物的抗氧化活性高低。
[0051]其中羟基自由基水溶液和上转换发光纳米探针的水溶液的量和/或浓度可以同比增加。
[0052]( I)有机化合物的抗氧化活性测定:
[0053]以4个待测样品(丹宁酸、抗坏血酸、阿魏酸、没食子酸)为例:
[0054]将丹宁酸、抗坏血酸、阿魏酸、没食子酸分别配制成标准浓度的水溶液，取IOyL的0.1mM羟基自由基水溶液与10 μ L梯度浓度丹宁酸或抗坏血酸、阿魏酸、没食子酸水溶液充分混合10分钟后，加入到ImL的lmg/ml上述上转换发光纳米探针水溶液中进行发光检测。当加入的待测液中如果没有抗氧化药物，只有羟基自由基时上转换发光纳米探针的发光将会打开，发光增强倍数为Etl ;如果有抗氧化药物存在，上转换发光纳米探针的发光增强将会被抑制，并随着丹宁酸、抗坏血酸、阿魏酸、没食子酸浓度的逐渐加大，发光增强抑制程度就越大，甚至不再增强，发光增强倍数为E ;那么丹宁酸或抗坏血酸、阿魏酸、没食子酸的自由基清除效率Se= (Etl-E)/Etl，羟基自由基的清除效率即用来表示为待测物质的抗氧化活性高低。3种有机化合物的羟基自由基的清除效率比较见图4。
[0055]图4中的3条曲线表示3个样品的浓度分别为2、4、6、8、10、12X10_4M时的样品
羟基自由基的清除效率。由图4示出丹宁酸、抗坏血酸和阿魏酸具有抗氧化活性，随着丹宁酸、抗坏血酸和阿魏酸用量的加大，体系的羟基自由基清除效率逐渐变大。另一方面，相同量的丹宁酸、抗坏血酸和阿魏酸，丹宁酸表现出最大的羟基自由基清除效率，抗坏血酸次之，阿魏酸最弱。这和丹宁酸、抗坏血酸、阿魏酸的结构是密切相关的，因为丹宁酸结构中具有大量的能和羟基自由基反应的酚羟基，所以就表现出最高的抗氧化活性。
[0056]( 2 )中药的抗氧化活性测定:
[0057]以5个待测样品(地榆、黄芪、当归、大黄、五倍子)为例:
[0058]分别取IOg的地榆、黄芪、当归、大黄、五倍子中药材加入IOOmL的去离子水中，800C回流3个小时，过滤得到的提取液将其配制成梯度浓度的水溶液，取10 μ L的0.1mM羟基自由基水溶液与分别与10 μ L梯度浓度地榆、黄芪、当归、大黄、五倍子水提取液充分混合10分钟后，加入到ImL的lmg/mL上述上转换发光纳米探针水溶液中进行发光检测。当加入的待测液中如果没有抗氧化药物，只有羟基自由基时上转换发光纳米探针的发光将会迅速打开，发光增强倍数为Etl ;如果有抗氧化药物存在，上转换发光纳米探针的发光增强将会被抑制，并随着地榆、黄芪`、当归、大黄、五倍子水提取物浓度的逐渐加大，发光增强抑制程度就越大，甚至不再增强，发光增强倍数为E ;那么地榆的自由基清除效率Se=(Ec1-E)ZEq,梯度浓度地榆的清除效率见附图5，羟基自由基的清除效率即对应为待测物质的抗氧化活性高低。5个中药的羟基自由基的清除效率比较见图5。
[0059]图5中的立柱表不5个样品的浓度分别为1.2、2.4、3.6、4.5mg/mL时的样品羟基自由基的清除效率。在本实施例中样品浓度mg/mL中的mg是指中药提取物的干重。由图5示出在相同浓度的中药水提取物中，地榆的抗氧化活性是最高的，五倍子和大黄次之，黄芪和当归的抗氧化活性最低。另外，4.8mg/mL的地榆和五倍子基本上能清除90~100%的羟基自由基，表现出很高的抗氧化活性，这是因为他们的水提取物中含有大量的没食子酸和丹宁酸，而这两种物质是具有非常高的抗氧化活性的。
[0060]需要说明的是，上述中药的预处理可以采用现有技术中的其它提取方法和除杂分离方法。当本发明用于同一中药不同提取方法的抗氧化活性物质提出率比较时，样品浓度mg/mL中的mg是指中药材的干重。本发明用于复方中药的抗氧化活性比较时，更具有明显的优势，因为中药复方提取物成分十分复杂，而本发明对样品预处理要求不高，只需对提取物进行简单的除杂分离处理，用本发明测定中药的抗氧化活性快速简便、反应敏感、高效，可用于中药的处方筛选等。
[0061]上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。本发明技术方案中的步骤、方法除特别说明外，均为本领域常规公知技术手 段。
【权利要求】
1.一种上转换发光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)制备绿色发光的上转换发光纳米颗粒，所述上转换发光纳米颗粒的激发波长为980nm,发射波长520~560nm ； (2)将所述上转换发光纳米颗粒进行氨基化表面修饰，得到氨基修饰的上转换发光纳米颗粒； (3)将所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒进行酰胺化表面耦联，制得所述上转换发光纳米探针。
2.根据权利要求1所述的一种上转换发光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述绿色发光的上转换发光纳米颗粒选自Yb和Er掺杂的NaYF4或NaGdF4或CaF2 ;所述氨基化表面修饰是指在所述上转换发光纳米颗粒表面修饰分子中含有2个以上氨基的有机分子；所述酰胺化表面耦联是指用胭脂红酸的羧基与所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒表面的氨基之间通过生物脱水试剂形成酰胺来实现耦联。
3.根据权利要求1或2所述的一种上转换发光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中上转换发光纳米颗粒的制备方法如下: A)将X成分、Yb(CH3CO2) 3、Er (CH3CO2) 3按照摩尔比为80:18:2的量分散在油酸和十八烯的混合溶液中，抽真空100~150°C反应I~2个小时，得稀土离子的前驱液；其中X成分是指 Y (CH3CO2) 3 或 Gd (CH3CO2) 3 或 Ca (CH3CO2) 3 ； B)将NaOH和NH4F混合后超声分散在甲醇中，随后逐滴加入所述稀土离子的前驱液中，NaOH, NH4F、所述稀土离子的前驱液的量按照总摩尔数比为1:4:1，搅拌反应0.5~I小时后，加热到80~100°C抽真空10分钟，然后升温到250~300°C在氮气保护下反应I~2个小时，冷却至室温后加入丙酮，离心，去上清液，取沉淀物用乙醇洗涤后真空干燥，即得所述上转换发光纳米颗粒。
4.根据权利要求2所述的一种上转换发光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中氨基化表面修饰包括以下步骤:取所述上转换发光纳米颗粒超声分散在去离子水中，加入质量分数10%的盐酸调节pH至4.0~5.0，搅拌反应I~2个小时后，用无水乙醚萃取，分离得到的水相，离心，洗涤，将洗涤后的固体分散于赖氨酸的水溶液中，搅拌反应24~48小时，离心，洗涤，即得所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒。
5.根据权利要求2所述的一种上转换发光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中酰胺化表面耦联包括以下步骤:将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺依次加入胭脂红酸水溶液中反应I~2小时；再加入所述氨基修饰的上转换发光纳米颗粒的水溶液反应12~24小时，离心，洗涤，即得所述上转换发光纳米探针。
6.根据权利要求1~5中任一项所述方法制备而成的一种上转换发光纳米探针在测定物质抗氧化活性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述测定包括以下步骤: A)将羟基自由基水溶液加入到所述上转换发光纳米探针的水溶液中进行发光强度的测定，测得发光增强倍数为Etl; B)将羟基自由基水溶液分别与梯度浓度待测物质混合10~30分钟后，分别加入到I~3mL的所述上转换发光纳米探针的水溶液中进行发光强度的测定，测得发光增强倍数为E ；C)根据公式Se= (E0-E) /E0计算待测物质对羟基自由基的清除效率，所述羟基自由基的清除效率即用来表示为待测物质的抗氧化活性。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的待测物质包括有机化合物或中药的提取物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的羟基自由基是由二价铁的乙二胺四乙酸螯合物和双 氧水之间的Fenton反应制得。
【文档编号】C09K11/85GK103865519SQ201410120052
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】梅青松, 李炳南, 张勇 申请人:合肥工业大学