本发明涉及菁染料，具体为一类连接有稳定氮氧自由基的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料及其制备方法，该化合物具较长的三重激发态寿命和高的单线态氧生成能力，可作为优良的近红外光敏剂应用于肿瘤、癌症的光动力学治疗。
背景技术：
癌症已成为威胁人类生命和健康的主要疾病之一,如何有效治疗癌症是全世界一直关注的重要课题。传统的癌症治疗方案包括手术、放疗和化疗3种。然而，手术切除肿瘤往往伴随着较高的复发率，放射治疗受到辐射剂量以及损害正常组织的限制，而化疗极易诱发全身毒副作用。相比传统癌症治疗方法，光动力治疗(photodynamictherapy，pdt)具有抗癌谱广、微创性、对非肿瘤组织伤害小，可重复性等诸多优点、是一种安全有效的癌症治疗新手段，具有广阔的应用前景。
光动力治疗过程依赖的是光敏剂分子在吸收特定波段光能量后，从基态经历一个短暂的单重激发态后经系间窜越(isc)过程转变为存在期相对较长的三重激发态，三重激发态能量直接转移到三线态氧分子上，形成强细胞毒性的单线态氧分子1o2，可直接杀死癌细胞、造成脉管系统损伤或免疫系统响应而根除肿瘤细胞及组织。
光动力治疗用光敏剂包括卟啉类、改性卟啉类以及二氢卟吩类、菌绿素类和酞菁类等。迄今，已提取或合成的光敏剂约15000个，其中有药理学研究报道的光敏剂只有数百个，而已批准临床应用和临床试验的光敏剂仅有十几个。然而传统光敏剂分子多为疏水性分子，易团聚，且暗毒性高，受激发光限制而组织深度低等缺点，造成光动力治疗效果较低，限制了其临床应用与推广。所以，理想的pdt光敏剂应具备1o2量子产率高、在近红外区(700-1000nm)有较强吸收、暗毒性小等特性。由此可见，提高光敏剂的1o2量子产率、研发近红外吸收与发射、低暗毒性的光敏剂至关重要。
吲哚菁绿(icg)是目前唯一被美国食品药物管理局(fda)批准用于临床的近红外成像试剂。可应用于对血容量、心输出量、肝功能、视网膜、脉络膜的脉管系统进行辅助诊断。近年来的研究发现，icg还具有作为光敏剂应用于pdt的潜力，在激光诱导下，icg对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，已被美国fda正式批准应用于局部肿瘤食管癌的治疗(ylee,edbaron.photodynamictherapy:currentevidenceandapplicationsindermatology.seminarsincutaneousmedicine&surgery,2011,30(4),199-209)。icg作为光敏剂用于光动力治疗有如下几例：第一例是icg应用于人黑色素瘤的治疗，在788nm激光照射60分钟后，经icg共同孵育的人黑色素瘤细胞因膜损伤而致死率为71％。因为icg的三重激发态存在时间极短，低浓度时不能产生较高浓度的1o2以达到预期的肿瘤杀灭效果，但是icg细胞暗毒性低(ic50＝949.4μm)，所以采用的icg使用浓度为150μm，这就增加了光动力治疗成本。(abdel-megidmamoon,amiram.gamal-eldeen,meghane.ruppel,randyj.smith,thomastsang,lisam.millermsphd.photodiagnosisandphotodynamictherapy,2009,6,105-116)。第二例是icg用于肝癌细胞的光动力抑制作用，在较低浓度时(0.00625mgml-1和0.0125mgml-1)对肝癌细胞的抑制作用未达到50％。(chikarashirata,junichikaneko,yoshinoriinagaki,takashikokudo,masumitsusato,shokiritani,nobuhisaakamatsu,junichiarita,yoshihirosakamoto,kiyoshihasegawa&norihirokokudo.near-infraredphotothermal/photodynamictherapywithindocyaninegreeninducesapoptosisofhepatocellularcarcinomacellsthroughoxidativestress.scientificreports,2017,7(1):13958)。虽然研究发现icg应用于pdt中具有一定的肿瘤抑制作用，但是icg的isc过程效率低、三重激发态寿命短，这导致其1o2量子产率很低，需要提高使用剂量以达到肿瘤的抑制作用，这极大限制了其作为近红外光敏剂在光动力治疗领域的应用。
在近红外花菁染料分子结构中引入碘、溴等原子，根据重原子效应，可以有效提高isc过程，一定程度上可以提高1o2量子产率，但重原子改性后的近红外花菁染料分子的1o2量子产率仍提升不大，且重原子修饰后的花菁染料细胞毒性较大。此外，如icg等商品化近红外花菁染料的斯托克斯位移较小。以上这些因素都极大限制了其作为光敏剂在生物、环境、医学等领域的进一步应用。
因此合成具有高1o2量子产率、水溶性良好、大斯托克斯位移、低生物毒性的近红外花菁染料具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了一类具有较长寿命三重激发态、高单线态氧量子产率的近红外氨基菁染料的合成方法，该方法是在七甲川花菁染料分子上引入稳定的氮氧自由基单元，使其具备了大斯托克斯位移(＞70nm)，在微酸至弱碱性条件下荧光性能稳定，以及水溶性良好(例如磺酸基团的引入可显著提高水溶性)等诸多优点。尤其重要的是，首次实现了经氮氧自由基修饰后的近红外氨基菁染料具有较长寿命的三重激发态(＞10μs)，极大提升了isc过程效率，使得相对单线态氧量子产率远高于商品化染料icg。因此，本发明提供的一类具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料具有更广泛的应用前景。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一类具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料合成方法，该氨基菁染料具有如下结构式ⅰ：
其中：
x选自c(ch3)2、o、s或se；
r1和r2分别独立选自c1-18烷基、苄基，或所述苄基的苯环上还可以包含下列取代基：h、c1-18烷基、cn、cooh、nh2、no2、oh、sh、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、c1-6酰氨基、卤素或c1-6卤代烷基；
r3选自h、so3r5、co2r6或ncs；r4分别独立选自h、so3r5、co2r6或ncs；r5,r6分别独立选自h、li、k、na、cs；
y-选自卤素离子、clo4-、pf6-、bf4-、ch3coo-或ots-。
本发明还提供一种制备所述的化合物ⅰ的方法，所述方法包括以下步骤：
如结构通式ⅰ所示近红外氨基菁染料，是以结构稳定的氮氧自由基化合物(4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基)作为亲核试剂，在七甲川花菁染料对称结构的中位进行亲核取代获得，通式ⅰ所示结构的染料具有较长寿命的三重激发态，及优良的单线态氧生成能力。
(5)在0-5℃冰浴条件下，以n,n-二甲基甲酰胺作为反应溶剂，用时约1小时将一定量的三氯氧磷用恒压滴液漏斗逐滴滴入反应烧瓶中。然后常温搅拌1小时，再加入一定量环己酮，反应液加热到回流，反应1小时。反应完全后，将得到的反应混合物倒入大量的冰水中，保存在4℃冰箱中。静置过夜后，大量黄色固体析出，将其进行抽滤得黄色粗产品ⅱ，于氮气保护下置于冰箱中保存，备用。
(6)将化合物ⅲ溶解在邻二氯苯溶剂中，然后向其中加入ry，在氮气保护下加热回流5-10h，得到粉红色固体ⅳ，冷却至室温，抽滤，并用丙酮清洗数次，真空干燥，于氮气保护下室温保存，备用；其中r为权利要求1中的r1或r2，r'为r3或r4，式ⅲ化合物与ry化合物的投料摩尔比为1:1-1:10；
(7)向乙酸酐中加入季铵盐ⅳ，升温至35℃；再加入一定量乙酸钠，升温至40℃并保持温和搅拌15min；再加入缩合剂ⅱ，40℃反应10min；升高反应温度至80℃，反应1h；冷却静置，将反应液加入到激烈搅拌中的乙醚中，乙醚的使用量为乙酸酐用量的2-3倍，析出绿色固体；过滤得到粗产品ⅴ，干燥后用高效液相色谱进行提纯；
(8)染料ⅴ预先在50-60℃下真空干燥8h；所用玻璃仪器预先在120℃下干燥3h，在氮气氛下冷却后，加入染料ⅴ和亲核试剂ⅵ；氮气氛下加入无水dmf；反应混合物在氮气保护下保温80℃搅拌4h；反应液倒入快速搅拌的乙醚中，大量蓝色固体沉淀生成；用g6砂芯漏斗进行过滤，得到染料粗品ⅰ后用高效液相色谱进行提纯；
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。
下述实施例中，如无特殊说明，所用试剂均可由常规方法制备或由商业途径购买。
实施例1
含氯桥环母体cy7染料ⅴa的合成路线
(1)中间体2,3,3-三甲基-3h-吲哚啉-5-磺酸钾的合成
1000ml三口烧瓶中，依次加入30ml冰醋酸，17ml(0.16mol)3-甲基-2-丁酮和0.05mol对肼基苯磺酸。混合物加热回流3h，反应物倒入大量丙酮中，冰浴静置后有粉红色固体析出。过滤，真空干燥。使用50ml甲醇溶解上述粉红色固体得溶液a，50ml异丙醇溶解2gkoh(0.036mol)得溶液b，超声条件下将溶液a缓慢滴加到溶液b中，大量黄色固体析出，过滤，乙醚清洗数次，得到黄色的2,3,3-三甲基-3h-吲哚啉-5-磺酸钾固体，真空干燥，产率80％。
(2)中间体n-乙基-2，3，3-三甲基-3h-吲哚啉-5-磺酸钾的合成
在100ml圆底烧瓶中，依次加入7.86g(0.028mol)2,3,3-三甲基-3h-吲哚啉-5-磺酸钾，8.8g(0.15mol)碘乙烷，邻二氯苯20ml，在氮气保护下加热回流反应5h，得到粉红色固体，冷却至室温，抽滤，并用丙酮清洗数次，真空干燥。
(3)缩合剂2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环已烯的合成
在0-5℃冰浴条件下，用时1小时将30ml的三氯氧磷用恒压滴液漏斗逐滴滴入装有40mln,n-二甲基甲酰胺的反应烧瓶中。然后常温搅拌1小时，再加入10g环己酮，撤下冰浴，将反应液加热到回流，反应1h，用冰水浴冷却，然后分批倒入200g碎冰中。放置过夜，得到红色固体，过滤，固体以冰冻的丙醇分批少量洗涤至黄色。产品于氮气保护下置于冰箱中保存，备用。
(4)含氯桥环母体cy7染料ⅴa的合成
在100ml圆底烧瓶中依次加入10mmol季铵盐和15ml乙酸酐，升温至35℃；再加入10mmol乙酸钠，升温至40℃并保持温和搅拌15min；再加入5mmol缩合剂，40℃反应10min；升高反应温度至80℃，反应1h；冷却静置，将反应液加入到激烈搅拌的乙醚中，乙醚的使用量为乙酸酐用量的2-3倍，立即有大量的绿色固体析出，用g6砂芯漏斗过滤，乙醚洗涤，粗产品用高效液相色谱进行提纯。
实施例2
具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅶa的合成
染料ⅴa预先在50-60℃下真空干燥8h。所用玻璃仪器预先在120℃下干燥3h，所用的三口圆底烧瓶在氮气氛下冷却后，加入0.3mmol染料ⅴa和0.9mmol亲核试剂ⅵ。氮气氛下用注射器加入约20ml无水dmf做溶剂。反应混合物在氮气保护下保温50-80℃搅拌4h。反应液倒入快速搅拌的60ml乙醚中，大量蓝色固体沉淀生成。用g6砂芯漏斗过滤掉滤液，得到固体用甲醇从漏斗上溶解下来，蒸干甲醇，得到粗品ⅶa后用高效液相色谱提纯。
对实施例2所得染料ⅶa检测结果如下：
图1染料ⅶa的质谱图。为实施例2合成的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅶa的质谱表征图。
图2染料ⅶa的核磁共振氢谱图。为实施例2合成的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅶa的核磁共振氢谱表征图。
图3染料ⅶa在甲醇和pbs(ph＝7.4)中的归一化(a)吸收和(b)发射光谱。为实施例2合成的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅶa的吸收和发射光谱图。通过紫外与荧光光谱测试，发现近红外氨基菁染料ⅶa在pbs(ph＝7.4)中的最大吸收波长与最大发射波长分别为674nm和763nm，斯托克斯位移达到89nm；甲醇中的最大吸收波长与最大发射波长分别为677nm和753nm，斯托克斯位移达到76nm。
图4染料ⅶa在不同ph值的pbs溶液中的化学稳定性。为实施例2中合成的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅷa的不同ph值下的化学稳定性。实验结果可以看出，染料ⅶa在ph为4-9之间具有较好的荧光稳定性，这是其光物理性能否应用于细胞、活体等生理环境ph值的基础。
图5染料ⅶa的纳秒时间分辨瞬态吸收光谱。为实施例2中合成的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅶa的纳秒时间分辨瞬态吸收光谱。采用lp920k型激光闪光光解/瞬态吸收光谱仪，激发波长为532nm，监测范围600-900nm，染料ⅶa在氩气除氧乙醇中的浓度10μm。结果显示在600-900nm之间的瞬态吸收光谱带能观察到两处明显的衰减，630-750nm处的衰减是染料ⅶa基态的漂白，而从微秒级别的光漂白过程可以推测出750-820nm处的衰减是染料ⅶa三重态的漂白。
图6染料ⅶa在波长800nm处三重激发态寿命拟合曲线。为实施例2中合成的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅶa在波长800nm处的三重激发态寿命拟合曲线。对800nm处的瞬态物种寿命衰减进行监测，发现在氩气除氧乙醇中800nm处的瞬态物种寿命长达11.83μs，而氧气会淬灭染料的三重态，所以监测未除氧乙醇中800nm处的瞬态物种寿命仅为312ns。由此可见，稳定氮氧自由基基团修饰后的近红外氨基菁染料ⅶa极大提高了isc过程效率，导致较长寿命的三重激发态的存在，这是其具有高的单线态氧产生能力的直接原因。
图7染料ⅶa和商品化染料icg在乙醇中单线态氧产生速率对比。(a)染料ⅶa存在下dpbf的衰减曲线，(b)商品化染料icg存在下dpbf的衰减曲线，(c)染料ⅶa和icg单线态氧生成速率对比；为实施例2中合成的具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料ⅶa以及商品化染料icg的单线态氧产生能力对比图。选用1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)作为1o2捕捉剂，dpbf因被1o2氧化而消耗，导致其在410nm处的强吸收减弱，以此监测dpbf在410nm处吸收强度的变化来评价染料ⅶa和商品化染料icg的单线态氧的产生能力。实验采用功率为12w、激发波长660nm的近红外led光源，测试时样品表面光密度为0.8mw/cm2,调整染料ⅷa和商品化染料icg在乙醇中660nm处吸光度值一致并不超过0.2、dpbf在410nm处的吸光度值约1.0。结果表明：染料ⅶa在42s内产生的1o2就使得dpbf在410nm处出现明显的漂白消耗，相比之下，商品化染料icg在720s后才出现明显的dpbf漂白消耗；经计算，染料ⅶa的相对单线态氧量子产率φδ为0.20(参比为methyleneblue，mb；在乙醇中的φδ为0.52)，是商品化染料icg的34倍。