一种近红外碳罗丹明荧光染料及其合成方法与流程

本发明属于荧光染料技术领域，具体涉及一种近红外碳罗丹明荧光染料及其合成方法。

背景技术

在各种各样传统的荧光染料中，罗丹明系列荧光染料因具有高的摩尔吸收系数、高的荧光量子产率、良好的光稳定性以及良好的细胞膜穿透性而备受关注，被广泛应用于荧光探针和生物分子标记等研究领域。然而，典型的罗丹明染料，如罗丹明b、罗丹明6g、罗丹明110，其吸收与发射波长位于可见区（500－600nm）。由于生物体的一些组分（如黑色素、血红蛋白、细胞色素等）对可见光有较高的吸收以及可见光在生物组织中较大的散射作用，这些被可见光激发而发射荧光的染料在影像应用时具有组织穿透性差的缺点，尤其在活体影像时，情况更为严重。不仅如此，由于一些生物分子，如还原型辅酶、核黄素、叶酸，能被可见光激发而发射荧光，染料在影像应用时还会遭受这些生物分子自发荧光的干扰。相比之下，血液和组织对近红外光（650－950nm）的吸收和散射较低，所以近红外光更容易透过生物组织，并且在近红外区域，生物分子自发荧光也显著地降低，因此近红外荧光染料的使用能大大提高组织或活体荧光成像的时空分辨率。

近年来，通过对传统罗丹明染料结构的改造，一系列罗丹明衍生物，如“硅－罗丹明”、“磷－罗丹明”、“砜－罗丹明”等被相继开发，这些罗丹明衍生物不仅具有良好的水溶性、光稳定性、生物兼容性，而且其激发和发射波长位于更适合生物影像应用的近红外区域，在生物及医学荧光影像领域显示出巨大的应用潜力。然而，从荧光量子收率角度考虑，这些罗丹明衍生物仍不够理想，其量子产率在0.1－0.3范围。相比之下，“碳-罗丹明”具有更大的荧光量子收率，可达0.6左右，但该类染料的合成极其繁琐，仅局限于部分结构简单的衍生物合成且不利于大量制备（eur.j.org.chem.2010,3593−3610），因此在一定程度上限制了其在荧光探针与影像领域的应用。此外，“碳－罗丹明”的激发和发射波长与其它罗丹明衍生物相比较短，尽管通过括大共轭可以使“碳-罗丹明”的发射波长延伸至650nm以上，但是其合成难度大，仅仅适用于实验室少量制备，不利于商品化。

技术实现要素：

本发明针对现有碳罗丹明的合成难度大的问题，提供一种近红外碳罗丹明荧光染料及其合成方法，该合成方法原料便宜，操作简单，产物易于纯化，产率高，通过该方法合成的碳罗丹明荧光染料具有良好的水溶性、近红外区的荧光发射以及高的荧光量子产率。

本发明采用如下技术方案：

一种近红外碳罗丹明荧光染料，其结构式如下：

，其中，r1为c1-c10的直链烷基或支链烷基或苄基；r2为c1-c10的直链或支链烷基或芳基或取代芳基或杂芳基；r3为h或甲基；r4为h或c1-c10的直链或支链烷基或羧基或酯基或烷氧基或芳基或取代芳基；阴离子x^-为f^-或cl^-或br^-或i^-或clo4^-或so4^2-或ch3coo^-或po4^3-。

一种近红外碳罗丹明荧光染料的合成方法，包括如下步骤：

第一步，2,7-二硝基蒽-9,10-二酮（中间体1）的合成

冰浴下，将蒽酮溶于发烟硝酸中搅拌反应2小时，然后升至室温（25℃），继续反应2小时后，将反应液倒入冰醋酸中，静置过夜（12h）后析出亮黄色固体，过滤，收集固体并用冰醋酸重结晶得到2,7-二硝基蒽-9,10-二酮的中间体1；

其中：蒽酮、发烟硝酸、冰醋酸的质量比为1:9:20；

第二步，2,7-二氨基蒽-9,10-二酮（中间体2）的合成

将氢氧化钠溶于水中，再加入硫化钠搅拌溶解制得还原剂；将2,7-二硝基蒽-9,10-二酮加入无水乙醇中制得悬浮液，然后将还原剂加入该悬浮液，100℃加热搅拌12小时，冷却后过滤得到2,7-二氨基蒽-9,10-二酮的中间体2；

其中：2,7-二硝基蒽-9,10-二酮、氢氧化钠、硫化钠的摩尔比为1:10.7:4.5；氢氧化钠与水的质量比为1:37；2,7-二硝基蒽-9,10-二酮和乙醇的质量比为1:30；

第三步，2,7-双（二烷基氨基）蒽-9,10-二酮（中间体3）的合成

将2,7-二氨基蒽-9,10-二酮溶于n,n-二甲基甲酰胺中，然后加入氢化钠，搅拌30分钟后加入卤代烃，升温至90℃搅拌12小时，冷却后，将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥浓缩后用柱层析分离，流动相为二氯甲烷；

其中2,7-二氨基蒽-9,10-二酮、氢化钠、卤代烃的摩尔比为1:5:5；

2,7-二氨基蒽-9,10-二酮与n,n-二甲基甲酰胺的质量比为1:20；

第四步，中间体4的合成

将2,7-双（二烷基氨基）蒽-9,10-二酮溶于无水四氢呋喃中，滴加格氏试剂，常温（25℃）反应30分钟；停止反应后将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，干燥浓缩后用柱层析分离，得到浅黄色固体化合物的中间体4；

其中2,7-双（二烷基氨基）蒽-9,10-二酮与格氏试剂的摩尔比为1:3；2,7-双（二烷基氨基）蒽-9,10-二酮与无水四氢呋喃的质量比为1:88；

第五步，中间体5的合成

将中间体4溶于干燥的n,n-二甲基甲酰胺中，然后加入氢化钠，常温（25℃）搅拌30分钟后加入碘甲烷，反应4小时，反应结束后将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，干燥浓缩后用柱层析分离，得到浅黄色固体化合物的中间体5；

其中，中间体4、氢化钠、碘甲烷的摩尔比为1:3:3；中间体4与溶剂n,n-二甲基甲酰胺的质量比为1:30；

第六步，近红外碳罗丹明荧光染料的合成

在氮气保护、-78℃条件下，将正丁基锂滴加到溶解有卤代芳烃的无水四氢呋喃中，维持温度搅拌反应1小时，然后滴加入含有中间体4或者中间体5的无水四氢呋喃溶液，缓慢恢复至室温（25℃）反应2小时后，用酸溶液将反应溶液酸化，反应溶液变为蓝绿色，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，干燥浓缩，得到近红外碳罗丹明荧光染料的粗产品；

其中，中间体4或者中间体5、卤代芳烃、正丁基锂的摩尔比为1：10：5；卤代芳烃与四氢呋喃的质量比为1：88；

第七步，近红外碳罗丹明荧光染料的提纯

将第六步中得到的近红外碳罗丹明荧光染料粗产品用乙醚和乙醇混合溶剂结晶后得到近红外碳罗丹明荧光染料的纯品。

第三步中所述的卤代烃为溴代烷烃或者碘代烷烃。

第四步中所述的格氏试剂为烷基溴化镁或者芳香基溴化镁。

第六步中所述的卤代芳烃为溴代芳烃或者碘代芳烃。

第六步中所述酸化试剂为盐酸、硫酸、高氯酸、磷酸、醋酸、氢溴酸或氢碘酸中的任意之一。

本发明的有益效果如下：

该近红外碳罗丹明荧光染料应用于发光材料，生物荧光探针，生物荧光成像等领域。

本发明所提供的新型近红外碳罗丹明荧光染料具有良好的水溶性，高的量子产率，发射波长位于近红外区（＞650nm）；合成方法具有原料廉价、合成步骤简单、产物易于分离纯化等优点。

附图说明

图1为本发明的近红外碳罗丹明荧光染料的结构示意图，其中：r1为c1-c10的直链烷基或支链烷基或苄基；r2为c1-c10的直链或支链烷基或芳基或取代芳基或杂芳基；r3为h或甲基；r4为h或c1-c10的直链或支链烷基或羧基或酯基或烷氧基或芳基或取代芳基；阴离子x^-为f^-或cl^-或br^-或i^-或clo4^-或so4^2-或ch3coo^-或po4^3-；

图2为本发明合成方法的路线图；

图3本发明实施例1制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr1-cr6的结构示意图；

图4本发明实施例2制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr7-cr8的结构示意图；

图5本发明实施例3制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr9-cr10的结构示意图；

图6本发明实施例4制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr11-cr12的结构示意图；

图7为本发明实施例1制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr1-cr6在二氯甲烷中的吸收和发射光谱图；

图8为本发明实施例2制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr7-cr8在二氯甲烷中的吸收和发射光谱图；

图9为本发明实施例3制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr9-cr10在二氯甲烷中的吸收和发射光谱图；

图10为本发明实施例4制备的近红外碳罗丹明荧光染料cr11-cr12在二氯甲烷中的吸收和发射光谱图。

具体实施方式

实施例1，近红外碳罗丹明荧光染料cr1的合成，采用中间体5-1合成cr1。

第一步，2,7-二硝基蒽-9,10-二酮的合成

冰浴0-5℃下，将蒽酮（3.90g，20mmol）溶于25ml发烟硝酸，搅拌反应2小时，升至室温后继续反应2小时，然后倒入70ml冰醋酸中，静置过夜后析出亮黄色沉淀。抽滤，滤饼用冰醋酸重结晶，得浅黄色固体化合物2,7-二硝基蒽-9,10-二酮（2.98g，10mmol），产率50%。¹h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ(ppm):8.84(d,j=2.4hz,1h);8.71(d,j=2.4hz,2h);8.49(d,j=9.0hz,2h)。

第二步，2,7-二氨基蒽-9,10-二酮的合成

将氢氧化钠（2.15g，53.5mmol）溶于80ml水中，再加入九水合硫化钠（5.40g，22.5mmol），搅拌溶解待用。将2,7-二硝基蒽-9,10-二酮（1.49g，5.0mmol）置于56ml无水乙醇中制得悬浮液，然后将上述氢氧化钠、硫化钠溶液倒入悬浮液中，加热回流，搅拌反应12小时。停止加热后冷却至室温，抽滤，滤饼用乙醇反复洗涤后真空干燥，得棕红色固体化合物2,7-二氨基蒽-9,10-二酮（0.95g，4.0mmol），产率80%。¹h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ(ppm):7.84(d,j=8.4hz,2h);7.23(d,j=2.4hz,2h);6.89(d,j=2.4hz,2h);6.36(s,4h).¹³c-nmr(dmso-d6,150mhz):189.4,184.4,158.8,140.0,127.1,123.1,114,8.hrms:calculatedfor[m+h]⁺:239.0815;found:239.2248。

第三步，2,7-双（二甲基氨基）蒽-9,10-二酮的合成

将2,7-二氨基蒽-9,10-二酮（1.43g，6.0mmol）溶于30mln,n-二甲基甲酰胺中，然后加入氢化钠（0.72g，30mmol），搅拌30分钟后加入碘甲烷（1.8ml，30mmol），加热至90℃反应过夜。自然冷却后倒入200ml水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后经柱层析分离得红色晶状固体化合物2,7-双（二甲基氨基）蒽-9,10-二酮（1.41g，4.8mmol），产率80%。¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):8.16(d,j=8.4hz,2h);7.46(d,j=3.0hz,2h);6.97(q,j=3.0hz,2h)3.15(s,12h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):185.3,181.0,153.1,135.0,129.2,123.0,115.9,108.6,40.3.hrms:calculatedfor[m+h]⁺:295.1441;found:295.1442。

第四步，2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-甲基-蒽-10-酮（中间体4-1）的合成

将2,7-双（二甲基氨基）蒽-9,10-二酮（0.10g，0.33mmol）溶于10ml无水四氢呋喃中，然后滴加甲基溴化镁（1mol/l的thf溶液，1ml），室温搅拌反应30分钟，然后用稀盐酸溶液猝灭反应。向反应液中加入50ml水，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后经柱层析分离得黄色固体化合物2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-甲基-蒽-10-酮（0.05g，0.16mmol），产率49%。¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):8.14(d,j=8.4hz,2h);7.10(s,2h);6.75(d,j=8.4hz,2h);3.12(s,12h);1.70(s,3h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):180.8,153.3,150.8,129.1,119.5,111.3,106.8,71.2,40.2,37.6.hrms:calculatedfor[m+h]⁺:311.1754;found:311.1751。

第五步，2,7-双（二甲基氨基）-9-甲氧基-9-甲基-蒽-10-酮（中间体5-1）的合成

2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-甲基-蒽-10-酮（0.31g,1.0mmol）溶于10mln,n-二甲基甲酰胺中，加入氢化钠（0.07g，3.0mmol），搅拌30分钟后加入碘甲烷（0.186ml，3mmol），常温反应4小时。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后经柱层析分离得黄色固体化合物2,7-双（二甲基氨基）-9-甲氧基-9-甲基-蒽-10-酮（0.26g，0.8mmol）产率80%.¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):8.23(d,j=8.4hz,2h);6.94(s,2h);6.81(d,j=8.4hz,2h);3.14(s,12h);2.98(s,3h);1.71(s,3h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):180.7,153.3,147.2,129.2,121.3,111.6,107.1,79.5,52.4,40.2,37.3.hrms:calculatedfor[m+h]⁺:325.1911;found:325.1009。

第六步，近红外碳罗丹明荧光染料cr1的合成

将溴苯（0.47g,3mmol）溶解于10ml干燥四氢呋喃中，丙酮液氮浴降温至-78℃，然后滴加正丁基锂溶液（2.4mol/l的thf溶液，0.5ml），搅拌反应1小时。逐滴加入含有2,7-双（二甲基氨基）-9-甲氧基-9-甲基-蒽-10-酮（0.10g，0.3mmol）的四氢呋喃溶液（5ml），缓慢恢复至室温（25℃），反应2小时，然后用2mol/l的稀盐酸酸化，溶液由黄色变为蓝绿色。反应液用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，剩余物用乙醚和乙醇混合溶剂重结晶得蓝色固体化合物cr1（0.10g，0.24mmol）产率80%。¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):7.57(m,3h);7.33(m,1h);7.28(m,2h);7.19(d,j=9.6hz,2h);6.79(q,j=2.4hz,2h);3.50(s,12h);3.14(s,3h);1.72(s,3h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):162.4,156.2,151.7,138.1,134.9,130.0,129.4,128.9,128,4,121.3,113.6,111.5,79.9,53.8,41.7,39.5.hrms:calculatedform⁺:385.2274;found:385.2271。

按照实施例1的合成步骤分别制备cr2，cr3，cr4，cr5，cr6，不同之处在于第六步中所用的反应底物溴代芳烃分别对应为2-甲基溴苯、2,6-二甲基溴苯、2-甲氧基溴苯、2,6-二甲氧基溴苯、2-溴苯甲酸叔丁酯。

实施例2，近红外碳罗丹明荧光染料cr7的合成，采用中间体4-1合成cr7。

第一步至第四步和实施例1相同。

第五步，近红外碳罗丹明荧光染料cr7的合成

将2-甲基溴苯（0.51g,3mmol）溶解于10ml干燥四氢呋喃中，丙酮液氮浴降温至-78℃，然后滴加正丁基锂溶液（2.4mol/l的thf溶液，0.5ml），搅拌反应1小时。逐滴加入含有2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-甲基-蒽-10-酮（93mg，0.3mmol）的四氢呋喃溶液（5ml），缓慢恢复至室温（25℃），反应2小时，然后用2mol/l的稀盐酸酸化，溶液由黄色变为蓝绿色。反应液用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，剩余物用乙醚和乙醇混合溶剂结晶得蓝色固体化合物cr7（96mg，0.23mmol）产率77%。¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):8.01(s,2h);7.44(t,j=7.2hz,1h);7.37(m,2h);7.07(d,j=7.8hz,1h);7.02(d,j=9.6hz,2h);6.54(d,j=9.6hz,2h);3.39(s,12h);2.12(s,3h);1.90(s,3h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):162.9,158.1,156.4,137.4,135.5,134.8,130.2,129.8,129.1,125.5,120.6,112.2,112.1,74.5,41.4,40.1.19.6.hrms:calculatedform⁺:385.2274;found:385.2272.

按照实施例2合成方法制备cr8，不同之处在于所用的反应底物溴代芳烃为溴苯。

实施例3，近红外碳罗丹明荧光染料cr9的合成，采用中间体4-2合成cr9。

第一步至第三步和实施例1相同。

第四步，2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-苯基-蒽-10-酮（中间体4-2）的合成

将2,7-双（二甲基氨基）蒽-9,10-二酮（0.10g，0.33mmol）溶于10ml干燥的四氢呋喃中，然后滴加苯基溴化镁（1mol/l的thf溶液，1ml），室温搅拌反应30分钟，然后用稀盐酸溶液猝灭反应。向反应液中加入50ml水，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后经柱层析分离得黄色固体化合物2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-苯基-蒽-10-酮（80mg，0.23mmol），产率70%。¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):8.19(d,j=9.0hz,2h);7.38(s,j=7.2hz,2h);7.20(t,j1=7.2hz,j2=8.4hz,2h);7.12(q,j1=7.2hz,j2=8.4hz,1h);6.84(d,j=1.8hz,2h);6.78(q,j=2.4hz,2h);3.00(s,12h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):180.5,153.3,151.1,149.5,128.4,128.2,126.4,125.0,119.7,111.5,109.0,72.9,40.3.hrms:calculatedfor[m+h]⁺:373.1911;found:373.1909。

第五步，近红外碳罗丹明荧光染料cr9的合成

将溴苯（0.47g,3mmol）溶解于10ml干燥四氢呋喃中，丙酮液氮浴降温至-78℃，然后滴加正丁基锂溶液（2.4mol/l的thf溶液，0.5ml），搅拌反应1小时。逐滴加入含有2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-苯基-蒽-10-酮（0.12g，0.3mmol）的四氢呋喃溶液（5ml），缓慢恢复至室温（25℃），反应2小时，然后用2mol/l的稀盐酸酸化，溶液由黄色变为蓝绿色。反应液用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，剩余物用乙醚和乙醇混合溶剂结晶得蓝色固体化合物cr9（0.11g，0.24mmol）产率80%。¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):7.68(s,2h);7.56(m,5h);7.36(m,2h);7.24(t,j=7.8hz,2h);7.16-7.09(m,3h);6.49(q,j=2.4hz,2h);3.28(s,12h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):164.3,156.3,155.9,147.6,137.9,135.4,129.3,128.6,127.1,124.4,121.2,114.2,112.2,74.8,41.2.hrms:calculatedform⁺:433.2274;found:433.2274。

按照实施例3的合成方法合成cr10。不同之处在于实施例3第五步中所用的反应底物溴代芳烃对应为2-甲基溴苯。

实施例4，近红外碳罗丹明荧光染料cr11的合成，采用中间体5-2合成cr11。

第一步至第四步和实施例3相同。

第五步，2,7-双（二甲基氨基）-9-甲氧基-9-苯基-蒽-10-酮（中间体5-2）的合成

2,7-双（二甲基氨基）-9-羟基-9-苯基-蒽-10-酮（0.37g，1.0mmol）溶于10mln,n-二甲基甲酰胺中，加入氢化钠（0.07g，3.0mmol），搅拌30分钟后加入碘甲烷（0.186ml，3.0mmol），常温反应4小时。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂后经柱层析分离得黄色固体化合物2,7-双（二甲基氨基）-9-甲氧基-9-苯基-蒽-10-酮（0.35g，0.9mmol）产率90%.¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):8.25(d,j=9.0hz,2h);7.37(d,j=7.8hz,2h);7.20(t,j=7.8hz,2h);7.11(d,j=7.2hz,1h);6.76-6.74(q,j=2.4hz,2h);6.64(d,j=2.4hz,2h);3.10(s,3h);3.00(s,12h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):181.2,153.2,148.0,146.5,128.8,128.0,126.1,125.1,121.9,111.7,109.2,79.4,51.7,40.1.hrms:calculatedfor[m+h]⁺:387.2067;found:387.2064。

第六步，近红外碳罗丹明荧光染料cr11的合成

将溴苯（0.47g,3mmol）溶解于10ml干燥四氢呋喃中，丙酮液氮浴降温至-78℃，然后滴加正丁基锂溶液（2.4mol/l的thf溶液，0.5ml），搅拌反应1小时。逐滴加入含有2,7-双（二甲基氨基）-9-甲氧基-9-苯基-蒽-10-酮（0.12g，0.3mmol）的四氢呋喃溶液（5ml），缓慢恢复至室温，反应2小时，然后用2mol/l的稀盐酸酸化，溶液由黄色变为蓝绿色。反应液用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，剩余物用乙醚和乙醇混合溶剂结晶得蓝色固体化合物cr11（0.12g，0.26mmol）产率85%。¹h-nmr(cdcl3,600mhz)δ(ppm):7.59(m,3h);7.33(m,3h);7.28-7.26(m,3h);7.21-7.19(d,j=7.8hz,3h);6.96(s,2h);6.75(d,j=9.0hz,2h);3.34(s,12h);3.24(s,3h).¹³c-nmr(cdcl3,150mhz):163.8,156.2,150.8,146.9,137.9,134.8,130.0,129.8,129.6,129.0,128.5,127.5,123.7,121.7,113.7,80.9,53.0,41.5.hrms:calculatedform⁺:447.2431;found:447.2431。

按照实施例4的合成方法合成cr12。不同之处在于实施例4第六步中所用的反应底物溴代芳烃对应为2-甲基溴苯。

实施例5，近红外碳罗丹明荧光染料光学性质的测定

1.取适量的碳罗丹明产品溶于二甲基亚砜中，制得浓度为2mmol/l^-1的母液。取2μl母液至样品池中，用溶剂稀释至2ml，得到浓度是2μmol/l^-1的待测溶液，测定其在溶剂中的吸收光谱和发射光谱并作归一化处理。染料cr1－cr12在二氯甲烷中的吸收及发射光谱如附图7至图10所示，其它溶剂中的光物理性质则在表1中显示。

2.碳罗丹明荧光染料相对量子产率的测定

取适量的碳罗丹明产品溶于二甲基亚砜中，制得浓度为2mmol/l^-1的母液。取适量的母液至样品池中，用溶剂稀释，控制其吸光强度小于0.05，然后测定其发射光谱，激发波长620nm，收集波长范围630-800nm，计算其反射光谱积分面积。以花菁染料cy-5为参比（φs=0.27），按照如下公式测定碳罗丹明荧光染料在不同溶剂中的量子产率。结果如附表1。

，上式中，φs与φu分别为参比样品与待测未知样品的量子产率，as与au分别为为参比样品与待测未知样品在620nm处的吸收强度，fas与fau分别为为参比样品与待测未知样品在波长范围630-800nm的荧光发射积分面积，η与η0分别为待测样品溶液与参比溶液的折光系数。

表1本发明所合成荧光染料在不同溶剂中的光物理性质