用于在固体载体上缀合生物分子的异官能涂层及其用于生物分析的用途的制作方法

用于在固体载体上缀合生物分子的异官能涂层及其用于生物分析的用途
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请要求于2020年5月8日提交的名称为“hetero-functional coating for conjugating biomolecules on a solid support and use thereof for bioanalysis”的美国临时专利申请第63/022,047号的优先权和权益。本专利申请要求于2020年5月8日提交的名称为“hetero-functional coating for conjugating biomolecules on a solid support and use thereof for bioanalysis”的美国临时专利申请第63/022,051号的优先权和权益。各专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开涉及一种用于缀合生物分子的材料。更具体地，本公开涉及一种用于在固体载体表面上缀合生物分子的涂层，诸如异官能涂层，以及其用于生物分析的用途。


背景技术：

4.生物分子是复杂的分子，需要复杂的工作流进行分析。这些复杂的工作流涉及许多步骤，包括各种样品制备步骤，诸如样品清洁和蛋白质消化。在不影响样品质量的同时获得基本上完全的消化(例如，不引入需要附加清洁的副产物)具有挑战性。例如，用于消化的一些酶在溶液中使用时可能变得不稳定，从而导致副产物。这些酶的固定有助于使酶稳定。然而，用于固定酶的常规技术导致感兴趣分析物与载体表面的次级相互作用，从而影响消化效率和样品回收率。


技术实现要素：

5.一般来讲，本公开的技术涉及一种用于分析生物分子的材料。更具体地，该技术涉及能够被施加到基底，例如固体载体上的异官能涂层用于缀合生物分子的用途。异官能涂层提供优于用于处理生物分子的常规技术的许多优点。该技术涉及用于复杂样品的生物分析并适于向下面的固体载体提供两种或更多种官能团(例如，异官能涂层)的涂层。这些官能团被设计成对生物分析工作流提供改善的效率并提供分析物的改善回收率。具体地，异官能涂层提供生物分子缀合的官能团，同时提供消除或减少样品处理期间的次级相互作用(例如，消化、亲和清洁)的官能团。此外，本技术的材料是有利的，因为它们通常是蒸气或液体沉积的，从而均匀地(即，没有间隙或孔)涂覆下面的固体载体。
6.在一个方面，本公开涉及一种施加在固体载体(例如，颗粒、膜、平面基底、小瓶的一部分、孔板、移液管尖端等)上的异官能涂层。涂层对固体载体的表面赋予第一官能团和第二官能团。第一官能团是用于缀合生物分子来进行蛋白质或核酸分析。第二官能团是用于防止感兴趣分析物与固体载体的表面之间不期望的相互作用。例如，第二官能团能够对载体的表面赋予亲水性。异官能涂层能够均匀地涂覆下面的固体载体并提供至少5μmol/m2或更大(例如，7μmol/m2、9μmol/m2、15μmol/m2)的总表面覆盖率。由于这是异官能涂层，因此
下面载体的表面被赋予有至少两个官能团。在一些实施方案中，第二官能团与第一官能团的比率为总表面覆盖率的至少15％(例如，18％、20％、30％、45％等)。
7.在另一方面，本公开涉及使用施加到固体载体的异官能涂层来分析生物分子。具体地，施加到所公开的固体载体中的一种或多种固体载体的异官能涂层可以用于复杂生物样品的样品处理中。例如，施加到固体载体的异官能涂层可以与固定化亲和配体一起使用以用于亲和处理步骤，或与固定化酶一起使用以用于消化或酶催化反应步骤。
8.在另一方面，本公开涉及一种涂覆固体载体的方法。该方法包括活化固体载体表面，在固体载体表面上沉积涂层，以形成大于5μmol/m2的表面覆盖率；以及处理涂层以形成两个部分：具有用于生物缀合的官能团的第一涂层部分和具有用于减少不期望的相互作用的官能团的第二涂层部分。一般来讲，沉积涂层并然后处理涂层以提供具有两个或更多个官能团的固体载体的表面。
9.在另一方面，本技术涉及在固体载体表面(例如，颗粒、膜、微芯片、平面基底、玻璃载片、pcr管、移液管尖端、多孔板等)上的异官能涂层。为了产生异官能涂层(即，形成两个或更多个官能团)，执行以下步骤。首先，活化固体载体表面。接着，制备包含环氧化物基团的涂层。涂层沉积在固体载体表面上以形成大于5μmol/m2的表面覆盖率；环氧化物基团被水解或其环被打开成二醇以形成亲水性涂层(例如，第一官能团)；然后，二醇以受控方式氧化成醛基团(例如，以提供第二官能团)以形成异官能涂层。在一些实施方案中，至少15％(例如15％、17％、20％、25％)的二醇基团已被氧化成醛基团。
10.本技术包括由其它工艺制成但仍可用于分析生物分子的其它异官能涂层。在另一方面，本技术涉及在固体载体表面上的异官能涂层。为了产生异官能涂层(即，形成两个或更多个官能团)，执行以下步骤。首先，活化固体载体表面。接着，制备包含环氧化物基团的涂层。涂层沉积在固体载体表面上以形成大于5μmol/m2的表面覆盖率；环氧化物基团被水解或其环被打开成二醇以在固体载体表面上形成亲水性涂层，其中固体载体表面上的二醇百分比大于25％(例如，30％、35％、40％等)。产生异官能涂层的方法还可以包括用一种或多种接头化学物质活化涂层的步骤，该一种或多种接头化学物质带有用于缀合生物分子的官能团。此活化步骤可以是使用与残基环氧化物反应的多个异官能分子和同官能分子的单步或多步过程。
11.本技术还涵盖其它异官能涂层和产生它们的工艺。在一个方面，该技术涉及在固体载体表面上的异官能涂层。为了产生异官能涂层，执行以下步骤。首先，活化固体载体表面。接着，制备包含二醇基团的涂层。涂层沉积在固体载体表面上以形成大于5μmol/m2的表面覆盖率；通过使用与醛基团反应的多个异官能和同官能分子在多步过程中制备一种或多种接头化学物质，用这些接头化学物质活化该涂层。在一些实施方案中，多个异官能和同官能分子选自以下中的任一项：烷基二胺、烷基二酰肼、二叠氮化物、双官能peg二胺、双官能peg酰肼、多臂peg叠氮化物、多臂peg酰肼、丙烯酸酯peg胺、生物素peg胺、硫醇peg胺或它们的衍生物。
12.本技术还涉及包括在固体载体上的异官能涂层的设备。在一些实施方案中，经涂覆的固体载体基底位于被设计成接收样品以进行处理的容器内部内。在其它实施方案中，异官能涂层沉积在处理设备的样品接收部分上。
13.一般来讲，根据本技术提供的材料和方法提供了许多优点。例如，材料提供用于生
物分子处理的稳定平台，同时防止分析物与固体载体之间不期望的次级相互作用。因此，可以实现效率增加(例如，消除进一步清洁或处理步骤，通过减少漏切百分比来增加消化)以及回收率增加(例如，消除次级相互作用)。除了效率和回收率的增加之外，其它优点也是可能的，诸如热和化学稳定性的增加，从而允许在不同条件下使用生物缀合物生物分子。例如，可以定制本技术的材料和方法以适应各种形式和设备。具体地，可以施加和定制涂层以提供最佳结果。也就是说，涂层可以均匀地涂覆任何下面的基底，包括用于处理样品的各种设备。此外，第二官能团与第一官能团的比率可以针对特定的生物分子处理步骤(例如，特定蛋白质的消化)进行调整或适配。
附图说明
14.通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
15.图1为示出根据本公开的方法的流程图。
16.图2a显示了示例性二醇键合过程。
17.图2b显示了在颗粒或表面上的示例性涂层。
18.图2c显示了在颗粒或表面上的示例性涂层。
19.图3显示了具有异官能涂层以使生物分子共轭的示例性装置。
20.图4a是溶液内胰蛋白酶消化示例的nist mab肽图。
21.图4b是smart digest
tm
示例的nist mab肽图。
22.图4c是根据本公开的原型的nist mab肽图。
23.图5是显示根据本公开的序列覆盖率的柱形图。
24.图6是显示根据本公开的漏切百分比的柱形图。
25.图7是展示肽图分析工作流的流程图。
26.图8是亲和当前工作流的示例的流程图。
27.图9是胰蛋白酶消化当前工作流的示例的流程图。
28.图10是具有固定化亲和配体和酶的挑战的信息图表。
29.图11是包括本公开与smart digest
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之间的比较的热谱图的图。
30.图12是包括本公开与smart digest
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之间的比较的肽回收的图。
31.图13是包括本公开与smart digest
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之间的比较的释放胰蛋白酶的图。
具体实施方式
32.基于蛋白质的治疗剂已成为疑难病症的一类重要药物。类似于小分子药物，基于蛋白质的药物必须进行广泛的表征。必须完全确定基于蛋白质的药物的关键质量属性以确保安全性和功效。与小分子药物相比，基于蛋白质的药物是大的且复杂的。在一些示例中，需要复杂的工作流来分析这些复杂分子。因此，基于蛋白质的药物可能难以表征和分析。
33.质谱法的进展已经使液相色谱/质谱方法(lc/ms)成为用于表征和分析基于蛋白质的药物的重要技术。生物分子(诸如蛋白质)的lc/ms表征需要若干步骤，包括使用亲和装置的样品清洁，然后是消化以将生物分子减小到能够容易分离和分析的亚基。因此，样品制备(需要清洁和消化步骤)可以是用于分析生物分子样品的工作流的重要部分。
34.用于基于蛋白质的药物的当前样品制备工作流是耗时的，有时导致样品损失、结
果不一致和不可重复性。例如，样品清洁需要具有较低的次级相互作用、较高的特异性和较高的捕获效率的高效亲和装置。另一方面，对消化步骤优选的是更快、更少的样品损失和最少的转化后修饰以及完全消化。
35.这些挑战的一些示例解决方案包括使用具有固定化配体以用于样品清洁的亲和装置和用溶液酶的消化。如胰蛋白酶等溶液酶可用于消化生物治疗剂。然而，基于溶液胰蛋白酶的工作流可能是耗时的，并且有时需要样品清洁，这可能导致样品损失。此外，溶液酶工作流可能被限制为离线的，并且无法轻松转换为在线工作。如胰蛋白酶等溶液酶具有热和化学限制。固定化酶提供优于溶液酶的若干优点。但是，尚未实现固定化酶的全部潜力。
36.例如，一些解决方案包括固定在琼脂糖或聚合物珠上的亲和配体，这可能具有机械稳定性限制。溶液酶消化方案通常用于消化供lc/ms分析的生物治疗剂。固定化酶提供优于溶液酶的若干优点，诸如增加的温度和化学稳定性。然而，由于次级相互作用造成的样品损失和不完全消化，这些产物的使用受到限制。
37.在一个示例中，当前状态工作流包括：蛋白质清洁、变性、还原和烷化；消化；淬灭肽清洁；和lc/ms。
38.smart digest
tm“(可购自thermo fisher scientific，waltham，ma)是一种基于固定在聚合物颗粒上的胰蛋白酶的产品。这些颗粒具有压力限制。此外，固定过程仅能够用在聚合物颗粒上，而不能用在二氧化硅或无机表面或颗粒或装置表面上。此外，smart digest
tm
遭受次级相互作用，导致更高的漏切、结果不一致和较低的样品回收率。
39.通过增加稳定性和消除与分析物的次级相互作用，在具有本公开所述的官能团的固体载体或表面上固定酶和亲和配体将获得增加的适用性。
40.对于蛋白质样品的消化，本公开解决了消化后产生的疏水性肽与固定化酶的固体载体表面之间的次级相互作用的问题。当将本公开与溶液酶(更具体地，胰蛋白酶)进行比较时，溶液酶遭受了自溶、热不稳定性和化学不稳定性。酶的固定有助于使酶在这些情况下保持稳定。然而，大多数固定化酶遭受次级相互作用，这影响了消化效率重复性和样品回收率。本公开的涂层减少了次级相互作用和次级相互作用的负面影响，产生了一致的高消化效率。
41.具体地，本公开是具有两个部分的异官能涂层。涂层的一个部分具有连接和缀合生物分子(例如，酶或亲和配体)的官能团，并且涂层的第二部分具有消除次级相互作用的官能团。涂层的第二部分可以包括亲水性基团以消除固体载体表面与感兴趣分析物之间不期望的次级相互作用。
42.本公开的涂层沉积在固体载体上并以受控方式处理以产生两种官能团。对于亲和装置，涂层可以施加在不同的表面上，诸如颗粒、膜、整料、装置的表面、i微芯片通道或任何材料类型(聚合物或二氧化硅)的任何表面以及不同类型的材料，诸如聚合物、二氧化硅、无机物或任何组合。由于减少的次级相互作用，能够增加感兴趣分析物(诸如蛋白质)的回收率。
43.本公开的涂层在样品处理期间排斥感兴趣分析物离开下面的固体表面。一些涂层特性包括较厚的亲水性涂层、表面上的官能团和针对不同表面的涂层多用性。涂层特性有助于减少或消除次级相互作用，从而允许酶和亲和配体发挥全部潜力。通过在完全潜力下操作，数据质量得到改善，例如序列覆盖率增加、漏切减少以及样品回收率增加。在一些示
例中，涂层是基于环氧化物的涂层。涂层可以是异官能涂层，例如环氧化物基团和二醇基团。环氧化物基团可以生物缀合生物分子并活化成不同的接头化学物质。二醇基团可以消除样品与表面不期望的相互作用。
44.图7是展示肽图分析工作流700的流程图。在一些示例中，肽图分析工作流700包括四个部分。第一部分702包括展开具有感兴趣分析物诸如蛋白质的样品。第二部分704包括使样品脱盐以去除展开步骤中使用的试剂，这包括被展开的感兴趣分析物。第三部分706包括利用酶的选择消化样品的感兴趣分析物。此处，用于消化感兴趣分析物的装置包含本公开的异官能涂层。在感兴趣分析物被消化之后，第四部分708包括收集具有消化的感兴趣分析物的样品，以便用下游过程进行分析。
45.在一些示例中，第一部分702和第二部分704可以取决于感兴趣分析物。例如，第一部分702和第二部分704可以被认为是预处理步骤，并且基于感兴趣分析物诸如蛋白质，可能不需要。
46.图8是亲和当前工作流800的示例的流程图。
47.图9是胰蛋白酶消化当前工作流900的示例的流程图。本技术的重点是通过消除不期望的相互作用来改善消化步骤。
48.图10是具有固定化亲和配体和酶的挑战的信息图表1000。
49.为了解决这些挑战，本技术提供了一种新的材料，该材料被定制成提高样品处理效率以及样品回收率。材料包括施加到固体载体的异官能涂层。
50.图1公开了一种系统100，该系统具有固体表面102、活化的表面106、涂覆有亲水性表面基团130的涂层110a、载体表面112、包括用于生物缀合的官能团116和亲水性表面基团130的亲水性涂层110b、具有亲水性表面基团130和连接到生物分子122或淬灭剂(端帽)124的用于生物缀合的官能团116的亲水性涂层110c。涂层110a、亲水性涂层110b、亲水性涂层110c统称为涂层110。
51.系统100的涂层110可以在多步过程中制备。第一步104将固体表面102活化成活化的表面106以能够接收涂层。有许多方法可用于活化固体表面102，只要该方法将固体表面102准备好接受涂层。例如，可以通过诸如但不限于溶液蚀刻、等离子体、活性基团的分子气相沉积、活性基团的化学气相沉积、气相蚀刻、聚合和与活性官能团的表面键合的过程来活化固体表面102。
52.固体表面102可以是许多不同类型的固体表面。例如，固体表面102可以包括颗粒、树脂、整料、膜、装置或芯片或微芯片上的通道的表面。在一些示例中，装置的表面是小瓶、管、孔、移液管或玻璃载片的内表面。在一些示例中，颗粒的表面可以是无孔颗粒、表面多孔或完全多孔颗粒。在一些示例中，颗粒由于顺磁性核、顺磁性壳或它们的混合物而是顺磁性的。
53.当添加涂层110a时，活化的表面106形成载体表面112。第二步108包括将涂层110a沉积在载体表面上以形成载体表面的表面覆盖。在一些示例中，将涂层110a沉积在载体表面112上包括通过使含有环氧化物的烷氧基硅烷预聚合来制备涂层110a以及使预聚物与固体载体表面反应。
54.烷氧基硅烷可以是选自5.5环氧基三官能硅烷、3缩水甘油丙基三官能硅烷或2-(3，4-环氧环己基)乙基三官能硅烷的含有环氧化物的硅烷。烷氧基硅烷可以是羧基硅烷正
羟基琥珀酰亚胺酯。缀合生物分子可以包括通过羧基正羟基琥珀酰亚胺酯经由取代反应来缀合生物分子。第二步108的涂覆过程可以包括使用有机单体和聚合技术。有机分子可以选自一个组，该组包括缩水甘油、苯基缩水甘油和衍生物、三甲基丙烷三缩水甘油醚、三(4-羟基苯基)甲烷三缩水甘油醚、peg二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、缩水甘油基甘油(三缩水甘油基)多官能醚、三羟甲基丙烷三缩水甘油醚、双酚a二缩水甘油醚和衍生物。使用单体和聚合技术包括在载体表面112诸如聚合物表面上共价键合涂层110a。涂层110a可以吸附在载体表面112上。
55.第三步114将涂层110a活化成具有亲水性表面基团130以及用于生物缀合的官能团116。在一些示例中，用于生物缀合的官能团(第一官能团)116是用于缀合供在生物治疗剂分析中应用的生物分子的第一官能团，并且亲水性表面基团(第二官能团)130是用于防止感兴趣分析物与固体载体表面之间不期望的相互作用的第二官能团。在一些示例中，第三步114可以被称为处理涂层以形成两个部分(第一涂层部分和第二涂层部分)。第一涂层部分可以包含用于生物缀合的第一官能团，并且第二涂层部分可以包含用于减少感兴趣分析物与固体载体表面之间不期望的相互作用的第二官能团。第一涂层部分可以通过将生物分子固定在亲水性涂层110上形成。固定化生物分子可以在用于分析生物治疗剂、蛋白质或核酸的工作流中的样品清洁、目标捕获和消化步骤中使用。
56.第二官能团可以是亲水性的，并且二醇可以赋予亲水性。第一官能团可以是醛，并且生物分子的缀合可以经由还原胺化。第二官能团的二醇可以用于受控过程中以获得第一官能团的醛。
57.当第一官能团是醛时，生物分子的缀合可以经由还原胺化。当第一官能团是环氧化物时，生物分子的缀合可以经由该环氧化物。
58.用于生物缀合的官能团116可以通过将亲水性表面基团130开环或水解来形成。例如，当亲水性表面基团130是环氧化物时，可以将环氧化物水解或开环成二醇基团，二醇基团是用于生物缀合的官能团116。
59.第二官能团与第一官能团的比率可以是总表面覆盖率的至少5％、15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％或95％(任何中间值或范围，例如至少12％，或介于7％和24％之间)。并且总表面覆盖率的厚度可以确保在固体载体112与感兴趣分析物或不期望的化合物之间不发生不期望的相互作用。例如，总表面覆盖率可以大于4μmol/m2、5μmol/m2、9μmol/m2或15μmol/m2。
60.涂层110可以是由烷氧基硅烷活化的异官能涂层。烷氧基硅烷可以是醛。在一些示例中，缀合生物分子包括通过醛经由还原胺化来缀合生物分子。烷氧基硅烷也可以是丙烯酰氧基硅烷。并且生物分子可以通过丙烯酰氧基硅烷经由迈克尔加成进行缀合。烷氧基硅烷也可以是羧基硅烷正羟基琥珀酰亚胺酯。并且生物分子可以通过取代反应进行缀合。也就是说，生物分子可以通过经由取代反应进行反应来固定。当烷氧基硅烷是胺硅烷时，胺硅烷可以进一步与二丙烯酸酯基团或二醛基团反应。固定化生物分子可以经由还原胺化与二醛基团反应。并且固定化生物分子也可以经由迈克尔加成与二丙烯酸酯基团反应。
61.处理亲水性涂层110b以形成第二涂层部分的第二官能团130可以通过以受控方式水解环氧化物基团以将环氧化物基团的一部分转化成表面二醇来完成。未转化成表面二醇的环氧化物基团的部分可用于处理第一涂层部分的第一官能团116，并且第一涂层部分的
第一官能团116可以缀合生物分子，诸如酶和/或亲和配体。转化成表面二醇的环氧化物基团的部分可以是大于约1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和中间值，诸如55.1％。未转化成表面二醇的环氧化物基团的部分可用于固定生物分子，诸如酶或亲和配体。
62.在一些示例中，处理涂层包括将未打开的环氧化物水解成亲水性二醇以形成第一涂层部分，以及将亲水性二醇的一部分氧化成醛以用于经由还原胺化进行生物分子的生物缀合。氧化亲水性二醇的一部分可以包括控制二醇的氧化程度以达到预定的氧化部分。在一些示例中，被氧化成醛的亲水性二醇的量可以是大于或等于1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和中间值，诸如55.1％。
63.用于生物缀合的官能团116可以包括不同的接头化学物质以产生具有接头化学物质的涂层110。涂层110可以具有混合的表面化学物质。在一些示例中，涂层110可以在多步过程中制备。第一步涉及制备含环氧化物的涂层110，然后将环氧化物水解成二醇以制成涂层110的亲水性表面。涂层110由此是亲水性的并且可以用不同的接头化学物质活化。接头化学物质可以带有用于缀合生物分子的官能团，诸如醛或丙烯酰氧基化学物质。接头化学物质也可以使用若干异官能和同官能分子在多步过程中制备，以形成用于生物缀合的官能团116。
64.在一些示例中，经涂覆的固体载体可以与胺硅烷反应，然后是与二丙烯酸酯或二醛反应。然后可以通过丙烯酸酯基团经由迈克尔加成或通过醛经由还原胺化来固定生物分子。接头化学物质可以具有长度可变的亲水性或疏水性间隔部。
65.可以通过将所有环氧化物水解成二醇，然后将一组特定的二醇受控氧化成醛来进一步处理涂层。所得表面具有亲水性二醇和醛基团二者，这些基团然后用于经由还原胺化进行生物分子的生物缀合。
66.在一些示例中，涂层110的表面可以包含二氧化硅表面上的硅烷醇或聚合物上的羟基。然后以受控方式对这些表面上产生的二醇进行氧化，以产生一组用于生物缀合的醛基团和一些用于消除次级相互作用的残基二醇。
67.第四步120将生物分子固定在用于生物缀合的官能团116上。
68.对于不具有固定化生物分子的用于生物缀合的官能团116，可以将用于生物缀合的官能团116封端以淬灭。淬灭包括引入与任何未使用的反应物结合并有效停止反应的材料。淬灭剂不应以与一种或多种反应物结合以外的任何方式参与反应。在一些示例中，封端包括含胺分子，诸如乙醇胺和甘氨酸。在一些示例中，封端包括peg化二胺，或具有至少一个胺基团和亲水性端基的异官能peg化分子。
69.在一些示例中，生物分子在固定之前被预修饰。生物分子可以被醛或丙烯酸酯化学物质预修饰。生物分子也可以被生物素修饰。
70.固定化生物分子可以是一种或多种酶，即单一酶或混合酶。酶可以选自包括以下的组：蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、连接酶、转移酶、氧化还原酶、异构酶、水解酶或它们的混合物。
71.固定化生物分子是选自蛋白酶的组的单一酶或酶的混合物。蛋白酶可以是胰蛋白酶、lyc-c、asp-n、胃蛋白酶、glu-c或它们的混合物。蛋白酶也可以是idez或ides，并且用于表征抗体和抗体药物缀合物。酶可以是用于o-聚糖和n-聚糖谱分析的糖苷酶以及它们的混
合物。对于糖苷酶，示例性酶包括但不限于pngase f、endo h、endo s和内-α-n-乙酰半乳糖胺酶。当酶来自糖苷酶家族时，酶可以用于葡糖苷酸药物缀合物的水解。
72.除了酶之外，固定化生物分子还可以是一种或多种亲和配体。在一些示例中，亲和配体是免疫球蛋白结合蛋白，诸如蛋白质a、g、l或它们的混合物。亲和配体还可以是抗原结合的，诸如抗体、纳米体或它们的混合物。亲和配体也可以是核酸配体。亲和配体可以含有抗生物素蛋白，并且在一些示例中，可以与生物素化的蛋白质样品一起使用。含抗生物素蛋白的亲和配体可以是链霉亲和素、抗生物素蛋白或中性亲和素。
73.固定化生物分子可以包含至少一种酶和/或至少一种亲和配体。换句话说，固定化生物分子可以是至少一种酶、至少一种亲和配体或它们的混合物。例如，固定化生物分子可以是两种酶和一种亲和配体、一种酶和两种亲和配体、三种酶和三种亲和配体等。
74.载体表面112可以包含二氧化硅、玻璃或杂化无机有机表面上的硅烷醇或聚合物或纤维素表面上的羟基。载体表面112可以包含聚合物或纤维素表面上的表面羟基。
75.在一些示例中，用于缀合生物分子的第二涂层部分的第二官能团130可以跨亲水性涂层110c和第一涂层部分的表面分散。
76.固体表面102被阻止了相互作用，因为固体表面102被亲水性涂层110完全覆盖。固体表面102提供与亲水性涂层126的永久连接。
77.在一些示例中，并非所有环氧化物都转化成二醇，并且没有二醇被氧化形成醛基团。以这种方式，仅一部分环氧化物转化成二醇。剩余的环氧化物(未转化成二醇的环氧化物)用作用于生物缀合的官能团，并且二醇用作亲水性表面基团。例如，通过使含有环氧化物的烷氧基硅烷预聚合来制备涂层，使预聚物与颗粒、树脂、膜或装置上的表面反应。涂层沉积在固体载体(优选地具有一些表面积的颗粒)上，并加以处理以产生两种官能团。沉积后，以受控方式水解环氧化物，以将一部分转化成二醇。表面二醇用作涂层的亲水性部分并且剩余的环氧化物基团可以用于固定诸如酶或亲和配体等任何生物分子。一个重要的方面是控制二醇与环氧化物的比率以实现更好的性能。
78.类似的硅烷可以用作键合，但由于过程覆盖限制，效果将是不同的。键合覆盖率通常仅能够达到至多3μmol/m2。减少的覆盖率留下对次级相互作用有害的未反应的下面表面基团。
79.如果涂层太薄，不能确认均匀的涂覆，并且下面的表面可能不被完全覆盖。表面覆盖的量可以大于键合覆盖，其通常为3-4μmol/m2。
80.在一些示例中，涂层110a可以含有二醇基团而不是环氧化物基团。第三步114可以氧化二醇基团的一部分以形成醛。醛可以用作用于生物缀合的官能团。剩余的二醇基团将用作亲水性表面基团130。
81.在一些示例中，本公开的异官能涂层(诸如亲水性涂层110c)可以用于在用液相色谱检测设备处理之前分析蛋白质或核酸的设备中。该设备可以包括具有用于接收固定在载体表面112上的生物分子的开放体积的隔室。隔室可以是在添加固定化生物分子材料之前具有开放的两端的中空管。两端可以在添加材料之后封闭以允许设备在高压下操作。高压包括如在时间上或静态上使用以破坏分析物构象的大于500psi、大于3000psi和大于10,000psi的压力。
82.在一些示例中，仅隔室的一端被封闭以保持固定化材料，并且另一侧保持打开以
添加样品。例如，隔室的仅一侧可以用玻璃料封闭以保持固定化材料，但允许流体自由通过。
83.本公开的异官能涂层(诸如亲水性涂层110℃)也可以用于在液相色谱检测设备之前分析蛋白质或核酸的设备中，其中设备选自由以下组成的组：小瓶、移液管、pcr管、微孔板、微芯片上的通道或玻璃载片。并且本公开的异官能涂层可以直接施加到设备，并且载体表面112可以是设备的内表面。
84.如本公开中所论述，固定化生物分子是酶或亲和配体。液相色谱检测设备可以是液相色谱-质谱、液相色谱-紫外线或液相色谱-荧光设备。
85.图2a显示了利用二醇键合过程在二氧化硅颗粒和表面上的涂层的示例。图2a中的sec 450(即，示例性基于二氧化硅的固体载体)是基于杂化的颗粒(可购自waters technologies corporation，milford，ma)。二醇键合过程为较厚涂层(例如，亲水性涂层110c)提供条件。较厚的涂层确保下面的表面(例如，固体表面112)被完全覆盖。例如，通过确保固体表面112被亲水性涂层110c完全覆盖，固体表面112不发生不期望的反应。在一些示例中，亲水性涂层可以提供大于5μmol/m2、大于9μmol/m2或大于15μmol/m2的表面覆盖率。
86.图2b显示了在颗粒或表面上的示例性涂层。图2c显示了在颗粒或表面上的示例性涂层。在一些示例中，二醇键合过程可以用于二氧化硅颗粒和表面上的涂层。对于固定，可以针对较厚涂层调整条件。厚涂层确保下面的表面被完全覆盖。图2b示出了孔径为大约、范围为约4-5μmol/m2的表面覆盖率。图2c示出了孔径为大约、范围为约12-17μmol/m2的表面覆盖率。
87.图3显示了具有装置302、异官能涂层304和生物分子306的系统300。装置302可以包括pcr管、微芯片通道、多孔板、管或小瓶、柱和移液管尖端。在一些示例中，异官能涂层304固定诸如亲和配体或酶的生物分子。在一些示例中，异官能涂层含有亲和配体或酶的混合物以缀合生物分子。装置302可以用于含有生物分子306，诸如固定化生物分子(亲和配体上的酶)。装置302还涂覆有异官能涂层304，该异官能涂层是亲水性涂层以消除与样品不期望的相互作用。装置302可以制备成具有固定化的用于亲和的亲和配体或用于消化的酶。
88.图4a、图4b和图4c分别显示了用于不同方法的nist mab肽图，所述不同方法包括溶液中酶消化、smart digest
tm
和本公开。对于图4a，在37℃的工艺温度下，溶液中消化需要两小时。如图2a的谱图中所示，该过程仅产生一个不完全消化特征。对于图4b，在70℃的工艺温度下，smart digest
tm
需要十分钟。如图2b的谱图中所示，该过程产生十个不完全消化特征。对于图4c，在70℃的工艺温度下，具有固定化胰蛋白酶的本公开示例的原型需要十分钟。如图2c的谱图中所示，该过程产生两个不完全消化特征。
89.比较图4a、图4b和图4c的nist mab肽图的结果表明了具有固定化胰蛋白酶的原型的优点。相比之下，图4c的原型具有比图4b的smart digest
tm
优异的消化效率。具体地，图4c的原型的消化留下两个不完全消化特征，而图4b的smart digest
tm
留下十个不完整消化特征。并且与图4a的溶液中消化相比，图4c的原型具有更高的吞吐量。具体地，图4c的原型的消化需要十分钟，而溶液中的消化需要两小时。
90.图5是显示图4a、图4b和图4c的肽图的序列覆盖率计算的柱形图。包括smart digest
tm
(图4a)、溶液中(图4b)和本公开的原型(图4c)的方法分别具有98、94和93的序列，这均是可接受的序列覆盖率水平。可接受的序列覆盖率水平已被定义为大于90的序列覆盖
率。序列覆盖率值的可变性可以归因于下游分析。
91.图6是显示溶液中、smart digest
tm
和具有固定化胰蛋白酶的原型的漏切的柱形图。漏切的公式是具有漏切的肽的提取离子色谱图(xic)的总和除以所有已识别肽的xic的总和。然后将商乘以100来计算漏切百分比。参见等式1。
[0092][0093]
smart digest
tm
消化具有24.5％的漏切。而溶液中消化和具有固定化胰蛋白酶的原型分别具有2％和2.3％的漏切。结果显示，通过将消化方法从溶液中改变为原型，消化的时间可以从两小时减少到十分钟，同时维持2.3的较低漏切百分比。
[0094]
结果显示出当使用本公开的原型对比smart digest
tm
时，对于相同量的消化时间(十分钟)，漏切的百分比可以从24.5改善到2.3。漏切从24.5改善到2.3是显著的改善。并且，由于消化时间相同，改善更加显著。也就是说，漏切可以从24.5改善到2.3，而不必增加消化时间。本公开的原型实现了漏切的显著改善，而不必经历延长消化时间的缺点，即，具有潜在的负面方面(如自溶和不稳定性)的长消化时间。
[0095]
异官能涂层具有两个部分，一部分具有连接生物分子的官能团，并且第二部分含有用于消除次级相互作用的亲水性基团。涂层沉积在固体载体上并以受控方式处理以产生两种官能团。在本公开中，通过使含有环氧化物的烷氧基硅烷预聚合来制备涂层，使预聚物与颗粒、树脂、膜或装置上的表面反应。将涂层沉积在固体载体(例如具有一些表面积的颗粒)上，并进行处理以产生两种官能团。沉积后，以受控方式水解环氧化物，以将一部分转化成二醇。表面二醇用作涂层的亲水性部分并且剩余的环氧化物基团用于固定诸如酶或亲和配体等任何生物分子。为了改善性能，控制二醇与环氧化物的比率。一些硅烷可以用作键合、对次级相互作用有害的下面的表面基团。＞9μmol/m2的较高覆盖率对应于具有较低次级相互作用的较厚涂层。
[0096]
可以通过将所有环氧化物水解成二醇，然后将一组特定的二醇受控氧化成醛来进一步处理涂层。所得表面具有亲水性二醇和醛基团二者，这些基团然后用于经由还原胺化进行生物分子的生物缀合。优选地，二氧化硅表面上的硅烷醇或聚合物上的羟基基团。然后以受控方式对这些表面上产生的二醇进行氧化，以产生一组用于生物缀合的醛基团和一些用于消除次级相互作用的残基二醇。
[0097]
在共同待决的申请ussn 17/314,541(据此全文以引用方式并入)中提供了使用固定化酶的nist mab消化的方法。
[0098]
比较例
[0099]
在图11-图13中，将本公开的性能与smart digest
im
进行比较。如上所述，smart digest
tm
(可购自thermo fisher scientific，waltham，ma)是可用于消化的另一种产品。图11是包括本公开与smart digest
tm
之间的比较的热谱图的图。图11显示游离胰蛋白酶、smart digest
tm
胰蛋白酶和一种优选固定化酶(例如，胰蛋白酶)原型(例如，具有根据本技术的涂层的基于二氧化硅的固体载体)的nanodsc热谱图，其中t
m-一半蛋白质展开的温度，t
onset-蛋白质开始展开的温度。例如，与smart digest
tm
相比，具有固定化胰蛋白酶的本公开的原型(即，具有涂层的基于二氧化硅的固体载体)显示出更好的热稳定性(图1)。本公开的tm和t
onset
均大于smart digest
tm
的tm和t
onset
。在共同待决的申请ussn 17/314,541(据此
全文以引用方式并入)中提供了通过nanodsc获得固定化酶的热稳定性的方法。
[0100]
图12是肽回收的图，包括本公开(即，具有本技术的涂层的固体载体，原型)与smart digest
tm
之间的比较。具体地，图12是根据本公开与固定化酶一起孵育后疏水性肽混合物的回收的图。图12展示了在与所选的固定载体混合仅5分钟后疏水性肽的回收百分比。本公开的原型，即具有胰蛋白酶的修饰的二氧化硅，在每种酶情况下都优于smart digest
tm
。也就是说，相对于smart digest
tm
，图12中的原型(即，具有涂层的基于二氧化硅的固体载体)对于每种酶都具有更大的回收百分比。在共同待决的申请ussn 17/314,541(据此全文以引用方式并入)中提供了用于对释放的胰蛋白酶进行定量的方法。
[0101]
图13是包括本公开与smart digest
tm
之间的比较的释放胰蛋白酶的图。图13是在70℃下在消化缓冲液中孵育30分钟和60分钟后的释放胰蛋白酶的图，其比较了本公开的原型(即，具有本技术的涂层的基于二氧化硅的固体载体)与smart digest
tm
。优选的产物在消化期间具有最小限度的酶遗漏。本公开的原型在30分钟和60分钟下都明显优于smart digest
tm
。在共同待决的申请ussn 17/314,541(据此全文以引用方式并入)中提供了使用固定化酶的nist mab消化的方法。
[0102]
实施例
[0103]
除非另有说明，否则所有材料均按原样使用。
[0104]
表征：
[0105]
通过使用leco trumac碳-氮/硫分析仪(可购自leco corporation，michigan，us)进行燃烧分析来测量碳百分比(％c或％碳)和氮百分比(％n或％氮)值。这些材料的比表面积(ssa)和平均孔径(apd)使用多点n2吸附方法(micromeritics asap 2400；micromeritics instruments inc.，norcross，ga.)测量。使用brunauer-emmett-teller(bet)方法计算ssa，使用barrett-joyner-halenda(bjh)方法从等温线的解吸段计算apd。粒度使用beckman coulter multisizer 3分析仪(30μm孔，70000计数；可购自beckman coulter inc.，brea，ca)测量。用hitachi sem s3400(可购自hitachi，ltd.，tokyo，japan)对颗粒形貌进行成像。将粒径测量为体积粒度分布的50％累积直径。在即将使用之前，在环境温度下，使用oakton ph100系列仪表(可购自cole-palmer，vernon hills，il)进行ph测量，并使用缓冲液(可购自thermo electron corp.，beverly，mass.)ph缓冲标准品进行校准。使用716dms自动滴定仪(可购自metrohm ag，hersau，switzerland)进行滴定，并报告为每克毫当量(mequiv/g)。通过滴定添加硫代硫酸钠后释放的oh来确定环氧化物的覆盖水平。
[0106]
实施例1
[0107]
杂化有机多孔二氧化硅上厚异官能涂层的制备
[0108]
反应缓冲液制备步骤对于最终产物的涂覆效率是重要的。此反应是ph敏感的，其中ph值在5.50与5.55之间时导致可重现的厚的异官能涂层、多层涂层，在ph 4.00-5.00时有利于薄涂层或单层。ph增加到超过5.55可能存在凝胶化的风险。通过将2.379g乙酸钠三水合物(可购自fisher scientific，waltham，ma)溶解在1000ml milliq水中并用冰醋酸(j.t.baker inc.，philipsburg，nj)调节ph值来制备20mm缓冲液ph 5.54
±
0.01。
[0109]
使用新鲜制备的20mm ph 5.54乙酸钠来制备杂化多孔二氧化硅颗粒的异官能涂
层。向配备有机械搅拌器和适当的叶片、冷凝器、温控加热、温度探针和转接器的干净3颈250ml圆底烧瓶中，添加100ml反应缓冲液。在搅拌的同时将缓冲溶液预加热至70℃，在设定温度下监测ph并保持恒定在ph 5.54。向干净的50ml烧杯中，使用涡旋混合器将6.50g再蒸馏(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷(gptms)(可购自gelest，inc.，morrisville，pa)预溶解于3.12ml甲醇中1分钟，并在室温下在水浴中超声波处理1分钟，然后在混合下转移到含有热缓冲液的烧瓶中。将反应混合物在70℃下连续搅拌孵育60分钟。在70℃下55分钟后测量反应ph。在热ph 5.4缓冲液中保持60分钟期间，gptms经历预聚合，导致ph变化。在这种情况下，ph变为6.42。如果孵育期后的预聚合gtpms ph升高到高于6.5，则由于可能的凝胶化而停止反应；有时，溶液可能变得混浊。
[0110]
另一方面，如果ph不从原始缓冲液ph 5.5改变，则反应也应停止，表明预聚合不足。孵育精确60分钟，将总共10克的杂化有机多孔二氧化硅材料(表面积79m2/g，apdwaters corporation，milford，ma)添加到热反应混合物中，并在70℃下继续孵育20小时，然后将反应混合物冷却至40℃。冷却至40℃后，将颗粒用100ml milliq水洗涤三次并用100ml 2-丙醇洗涤两次，在恒定氮气流下干燥至少20分钟，并在4℃下储存。提交最终材料的小量样品用于分析。通过燃烧分析来测量碳含量，并且由涂覆前后％c之间的差异来计算涂层厚度。使用滴定法来对环氧基定量。所得产物1涂层厚度为15μmol/m2，其中残基环氧化物基团61％和二醇基团31％。
[0111]
实施例2
[0112]
通过环氧化物接头化学物质在厚涂的异官能杂化有机多孔二氧化硅上的胰蛋白酶生物缀合
[0113]
通过在ph 8的磷酸盐缓冲液中用高浓度硫酸铵溶液进行盐析沉淀来进行异官能涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒上的胰蛋白酶生物缀合。将以下化学物质添加到干净的100ml体积烧瓶中：153mg磷酸氢二钠(可购自milliporesigma，st.louis，mo)、16.7mg磷酸一钠(可购自milliporesigma，st.louis，mo)和38.06g硫酸铵(可购自milliporesigma，st.louis，mo)。向烧瓶中加入至多50ml milliq水，并在浴超声波仪中超声波处理，直到所有化学物质均匀混合。然后用milliq水将烧瓶填充到100ml，并且用10m naoh将ph调节至ph 8。最终浓度为2.88m硫酸铵和10mm磷酸盐缓冲液ph 8，并且对于盐析是重要的。向干净的小瓶中，添加18mg的l-(甲苯磺酰胺-2-苯基)乙基氯甲基酮(tpck)处理的胰蛋白酶(可购自worthington biochemical corp.，lakewood nj)和70mg胰蛋白酶抑制剂、苄脒(可购自milliporesigma，st.louis，mo)，与1.168ml的10％甘油(可购自milliporesigma，st.louis，mo)/milliq水(g/g)混合，并在室温下在浴超声波仪中超声波处理1分钟。用涡旋混合将1.168ml固定缓冲液(2.88m硫酸铵，10mm磷酸盐缓冲液ph 8)逐滴添加到胰蛋白酶溶液中。向干净的玻璃小瓶中，将300mg异官能涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒(实施例1，产物1，waters corporation，milford，ma)分散在10ml固定缓冲液(2.88m硫酸铵，10mm磷酸盐缓冲液ph 8)中，并在室温下在浴超声波仪中超声波处理1分钟以分散颗粒。将胰蛋白酶溶液逐滴缓慢添加到颗粒溶液中，在室温下涡旋混合。一旦完成胰蛋白酶溶液添加，将反应物置于倒置混合器(rotobot旋转混合器，可购自benchmark scientific inc.，edison，nj)上，并在室温下伴随倒置混合孵育20小时。控制混合使泡沫形成最少，这可能导致生物缀合效率较低。20小时后，添加122mg甘氨酸(可购自milliporesigma，st.louis，mo)并将其混合
30分钟以淬灭残留的环氧化物基团。将反应小瓶内容物转移到50ml离心管(可购自corning，sigma aldrich，st.louis，mo)中进行洗涤。通过将颗粒浸泡15分钟、然后以4000rpm离心10分钟来用40ml ph 4水(通过将几滴盐酸添加到milliq水中制备)洗涤颗粒两次，用40ml milliq水离心洗涤四次。最后，将材料再分散于0.01％甲酸中含有10mm cacl2的储存溶液中，并在4℃下储存。分析最终材料的小量样品。使用微量bca
tm
测定试剂盒(可购自thermo fisher scientific，waltham，ma)对生物缀合的胰蛋白酶的量进行定量。最终产物2的胰蛋白酶含量为34.4mg/g颗粒，对应于57％的生物缀合效率。
[0114]
实施例3
[0115]
环氧化物基团水解或开环以形成二醇
[0116]
在干净的100ml 3颈圆底烧瓶中添加来自实施例1的大约5g二醇/环氧化物产物1(15μmol/m2涂层厚度，61％残留环氧化物)，该烧瓶配备有搅拌轴、轴承和适当的叶片、水冷式冷凝器、温控加热套、温度探针和转接器。向烧瓶中添加50ml 1m乙酸溶液，并且将反应混合物在混合下在70℃下孵育20小时，随后冷却。冷却至低于40℃后，用过量的milliq水洗涤颗粒直到ph＞5，然后用50ml甲醇洗涤两次，并在真空烘箱中在70℃下干燥16小时。分析最终材料的样品。最终材料，产品3，具有0.0μeq/g残留环氧化物，通过环氧化物滴定确认完全水解。
[0117]
实施例4
[0118]
二醇基团受控氧化成醛以用于生物缀合
[0119]
使用高碘酸钠(可购自milliporesigma，st.louis，mo)以受控方式氧化实施例3的产物3的亲水性二醇涂覆杂化多孔二氧化硅颗粒。在即将使用之前在琥珀色玻璃瓶中制备氧化剂溶液，以防止光诱导的分解。向配备有搅拌轴、轴承和适当叶片的干净的100ml三颈透明玻璃烧瓶中，将4.5g实施例3的产物3和70ml 0.1m高碘酸钠溶液在25℃下混合5小时。氧化水平由浓度控制，浓度越高，形成醛的二醇氧化水平越高。反应完成后，将产物用10ml/g milliq水洗涤三次，并用10ml/g乙醇洗涤两次。将所得产物4在氮气的正压流下干燥20分钟并在4℃下储存。用傅里叶变换红外光谱(ftir)表征醛材料；通过燃烧分析测量碳含量。通过用诸如乙醇胺等伯胺分子还原胺化来对醛基团定量。向50ml离心管(可购自corning，fisher scientific，waltham，ma)中添加1.0g来自实施例4的产物4并分散于10ml 100mm乙醇胺ph 9.5中(用1n盐酸调节乙醇胺溶液的ph值)。将反应混合物在室温下涡旋混合10分钟。向干净的小瓶中添加760mg硼氢化钠(可购自milliporesigma，st louis，mo)，并在3ml 100mm乙醇胺ph 9.5中预混合。将硼氢化钠溶液添加到反应混合物中，用石蜡膜覆盖，并在室温下涡旋混合3小时。之后，将材料用大量水洗涤，直到洗涤液的ph＜6。然后将材料用10ml/g甲醇洗涤四次，并在真空烘箱中在80℃下干燥16小时。分析最终材料的样品。通过燃烧分析测量碳和氮含量，并且计算在还原胺化前后％c或％n覆盖率的差异。最终材料的％n计算得到产物4的5.4μmol/m2乙醇胺，对应于在氧化步骤后存在的相同量的醛基团；和二醇到醛的36％转化率。
[0120]
实施例5
[0121]
在厚涂的异官能涂覆醛活化的杂化有机多孔二氧化硅颗粒上的胰蛋白酶生物缀合
[0122]
通过还原胺化将tcpk处理的胰蛋白酶生物缀合在产品4的异官能杂化有机多孔二
氧化硅颗粒上。反应在100mm三乙醇胺(可购自sigma aldrich，st louis，mo)ph 9缓冲液、10mm氯化钙(可购自sigma aldrich，st louis，mo)和10％(g/g)作为分散剂的甘油(可购自sigma aldrich，st louis，mo)中进行。向干净的20ml小瓶中，将12mg tpck处理的胰蛋白酶(可购自worthington biochemical corporation，lakewood，nj)和46.8mg苄脒(可购自sigma aldrich，st louis，mo)在10ml缓冲液中通过超声波处理1分钟预混合。将胰蛋白酶混合物添加到干净的200ml烧瓶中，并且添加额外的40ml ph 9缓冲液，并在室温下继续混合10分钟。控制混合速度以防止泡沫形成，这可能显著影响生物缀合效率。将大约300mg异官能涂覆颗粒，产物4，与40ml生物缀合缓冲液预混合，在浴超声波仪中超声波处理1分钟，并在混合下转移到具有胰蛋白酶的烧瓶中。使混合物混合10分钟。向干净的闪烁小瓶中，将400mg氰基硼氢化钠(可购自sigma aldrich，st louis，mo)还原剂预溶解于5ml生物缀合缓冲液中，并将其添加到含有胰蛋白酶和颗粒的烧瓶中。使生物缀合反应在室温下进行3小时。混合3小时后，将材料转移到600ml离心管中，用过量的ph 4milliq水(通过添加几滴盐酸制备)洗涤一次，并以4000rpm离心10分钟。通过将材料再分散于以下中来淬灭未反应的醛基团：1m乙醇胺溶液ph 9.5，以及10mm cacl2、46.8mg苄脒(可购自sigma aldrich，st louis，mo)和400mg氰基硼氢化物。将反应混合物在室温下混合30分钟。然后将材料用45ml ph 4milliq水(通过添加几滴盐酸制备)洗涤两次，每次洗涤浸泡15分钟，并以4000rpm离心10分钟，并且用milliq水洗涤四次。洗涤后，将材料再分散于0.01％甲酸和10mm cacl2中，产生产物5，在4℃下储存。提交产物5的样品以进行分析。用bca
tm
测定(可购自thermo fisher，waltham，ma)对生物缀合的胰蛋白酶的量进行定量。产物5的胰蛋白酶含量为38mg/g颗粒，对应于96％的固定效率。
[0123]
实施例6
[0124]
杂化有机多孔二氧化硅颗粒上薄的异官能涂层的制备
[0125]
为了制备低ph缓冲液，将0.412g乙酸钠三水合物(可购自fisher scientific，waltham，ma)溶解于1000ml milliq水中，并用冰醋酸(可购自j.t.baker inc.，philipsburg，nj)将ph值调节至ph 4.0。向配备有搅拌轴、适当的叶片、冷凝器、温控加热、温度探针和转接器的干净圆底烧瓶中添加60ml ph 4。将缓冲液在混合下预热至70℃经时1小时，并测量ph。反应缓冲液ph从ph 4.01轻微变化到3.95。向干净的20ml小瓶中添加2.130g再蒸馏(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷(gptms)(可购自gelest inc.，morrisville，pa)，并在涡旋混合器上与0.530ml甲醇预混合，超声波处理1分钟，在混合下转移至具有热缓冲液的烧瓶中，并在70℃下继续孵育55分钟。加热55分钟后，将混合物的ph记录为4.03。在孵育精确60分钟时，将杂化有机多孔二氧化硅颗粒(ssa 79m2/g，apv，waters corporation，milford，ma)添加到热反应混合物中，并在70℃下继续混合20小时，随后冷却。冷却至低于40℃后，将材料用100ml milliq水洗涤三次，并用2-丙醇洗涤两次，在恒定氮气流下干燥至少20分钟，得到产物6，在4℃下储存。分析产物6的样品。通过燃烧分析测量碳含量，并且将涂覆前后％c的差异用于计算涂层厚度。残留的环氧基含量通过环氧基滴定方法进行定量。产品6的涂层厚度为3.13μmol/m2，其中残留环氧化物基团37％和二醇基团67％。通过改变硅烷浓度、4-5之间的ph和硅烷进料(charge)来控制涂层厚度。
[0126]
实施例7
[0127]
在具有环氧化物基团的薄的异官能涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒上的胰蛋白
酶生物缀合
[0128]
在实施例6的产物6的薄异官能涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒上的胰蛋白酶固定如下进行：如对于实施例2的产物2所述，使用10mm磷酸盐ph 8缓冲液中的2.88m硫酸铵溶液的相同盐析方法。向干净的小瓶中，将18mg的tpck处理的胰蛋白酶(可购自worthington biochemical corp.，lakewood，nj)和70mg胰蛋白酶抑制剂、苄脒(可购自sigma aldrich，st.louis，mo)与1.168ml的10％甘油(可购自sigma aldrich，st.louis，mo)/milliq水(g/g)混合，并在浴中超声波处理1分钟。在涡旋混合下将附加的1.168ml固定缓冲液逐滴添加到胰蛋白酶溶液中。向干净的玻璃小瓶中，将300mg产物6分散在10ml固定缓冲液中，并在室温下超声波处理1分钟。在室温下，在涡旋混合下将胰蛋白酶溶液逐滴添加到颗粒溶液中，以将胰蛋白酶沉淀在颗粒表面上。一旦添加了所有胰蛋白酶溶液，就将反应物置于倒置混合器(rotobot旋转混合器，可购自benchmark scientific，edison，nj)上，并在室温下保持20小时，以完成反应。20小时后，将122mg甘氨酸(可购自milliporesigma，st.louis，mo)添加到反应混合物中并将其再混合30分钟以淬灭残留的环氧化物基团。将小瓶内容物转移到50ml离心管(可购自corning，sigma aldrich，st.louis mo)中，用40ml ph 4水(通过将几滴盐酸滴加到milliq水中制备)洗涤两次，每次洗涤浸泡15分钟，随后以4000rpm离心，再用milliq水洗涤四次。将最终材料，产物7，再分散于0.01％甲酸中的含有10mm cacl2的储存溶液中，并在4℃下储存。使用微量bca
tm
测定试剂盒(可购自thermo fisher，waltham，ma)对生物缀合的胰蛋白酶的量进行定量。产物7的胰蛋白酶含量为30.3mg/g，对应于50.6％的固定效率。
[0129]
实施例8
[0130]
薄的亲水性二醇涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒的制备
[0131]
如实施例1中所述制备反应缓冲液，一个不同之处是将缓冲液ph调节至5。向配备有搅拌轴、适当的叶片、冷凝器、加热的干净三颈1000ml圆底烧瓶中添加720ml的ph 5缓冲液。将缓冲液在混合下预热至70℃经时1小时，并监测ph。向干净的100ml三颈圆底烧瓶中，将62.8g再蒸馏(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷(gptms)(可购自gelest，inc.，morrisville，pa)与14.7ml甲醇预混合，超声波处理2分钟，转移至具有热缓冲液的烧瓶中，并在70℃下继续孵育55分钟。加热55分钟后，将混合物的ph记录为5.2。在孵育精确60分钟时，将150g的多孔杂化有机多孔二氧化硅(ssa 77m2/g，apdwaters corporation，milford，ma)添加到热反应混合物中，并在70℃下继续混合20小时，随后冷却。冷却至低于40℃后，将材料用100ml milliq水洗涤三次，并用2-丙醇洗涤两次，并在恒定氮气流下干燥至少20分钟。按照实施例3中描述的程序，在干燥后立即水解材料。向干净的三颈1l圆底烧瓶中添加新鲜制备的材料并与实施例3中制备的750ml 1m乙酸溶液混合。将反应混合物在混合下在70℃下孵育20小时，随后冷却。冷却至低于40℃后，用过量的milliq水洗涤材料直到ph＞5，然后用50ml甲醇洗涤两次，并在真空烘箱中在70℃下干燥16小时，得到产物8。通过燃烧分析测量碳含量，并且用环氧化物滴定确认完全水解。最终产物8具有0.0μeq/g残留环氧化物和由涂覆过程前后％c的变化计算的4.6μmol/m2的涂层厚度。
[0132]
实施例9
[0133]
薄的亲水性涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒的醛活化
[0134]
使用实施例4中描述的程序完成实施例8的产物8的薄亲水性涂覆杂化有机多孔二
氧化硅颗粒的氧化，得到产物9。类似地，用ftir表征产物9的醛材料。通过燃烧分析测量碳含量，使用sem确认颗粒形貌，使用beckman coulter multisizer 3分析仪(30μm孔，70,000计数；可购自beckman coulter inc.，brea，ca)测量粒度，并使用如实施例4中所述的还原胺化对醛基团覆盖率进行定量。利用燃烧测量最终材料％n，并将其用于计算对应于产物9上醛的量的乙醇胺的量。基于这些计算，产物9在氧化步骤后具有2.7μmol/m2的醛基团，对应于二醇到醛的59％转化率。
[0135]
实施例10
[0136]
与醛活化的薄的异官能涂覆杂化多孔颗粒的胰蛋白酶生物缀合
[0137]
通过醛基团按照实施例5中描述的程序进行还原胺化，将tcpk处理的胰蛋白酶生物缀合于产物9的异官能涂覆氧化杂化多孔材料上。用fisher微量bca
tm
测定(可购自thermo fisher，waltham，ma)对生物缀合的胰蛋白酶的量进行定量。最终产物，产物10，具有36.5mg/g颗粒的胰蛋白酶含量，对应于91％的固定效率。
[0138]
实施例11
[0139]
二氧化硅核-壳颗粒上厚的异官能涂层的制备
[0140]
按照实施例1中描述的程序制备异官能涂覆二氧化硅核-壳颗粒。在使用相同的缓冲液ph时，通过改变gptms浓度和颗粒浓度来实现不同涂层厚度的材料。制备20mm ph 5.5乙酸钠缓冲液并立即使用。在这些反应中，将100ml反应缓冲液添加到配备有搅拌轴、轴承和适当的叶片、水冷冷凝器、温控加热套、温度探针和转接器的干净三颈200ml圆底烧瓶中。在搅拌的同时将反应缓冲液预热至70℃。将再蒸馏的(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷(gptms)(可购自gelest，inc.，morrisville，pa)在涡旋混合器上与21％v/v甲醇预混合，超声波处理1分钟，然后在混合下转移到含有热缓冲液的烧瓶中，在70℃下继续孵育60分钟。改变gptms的量以得到不同的产物；参见下表1。在孵育55分钟之后并且在添加固体材料之前监测ph。在孵育恰好60分钟时，将不同量的二氧化硅核-壳材料(ssa23m2/g，apd，available from waters corporation，milford，ma)添加到含有热缓冲液的烧瓶中，得到具有不同涂层厚度的产物，如表所示。类似于上述实施例1，将反应混合物在70℃下孵育20小时，洗涤并干燥。按照实施例3中描述的程序，在干燥后立即水解这些材料。
[0141]
表1：异官能涂覆二氧化硅核-壳颗粒
[0142][0143]
实施例12
[0144]
在亲水性涂覆二氧化硅核-壳颗粒上受控的醛活化
[0145]
通过使用类似于实施例4的程序来实现产物11c的亲水性涂覆二氧化硅核-壳颗粒的氧化，得到产物12。用ftir表征最终材料的样品；通过燃烧分析测量碳含量，使用sem确认颗粒形貌，使用beckman coulter multisizer 3分析仪(30μm孔，70,000计数；可购自
beckman coulter inc.，brea，ca)测量粒度，并进行热重分析。如实施例4中所述，使用与乙醇胺的还原胺化反应来对醛基团覆盖率进行定量。最终材料％n用于计算醛的量。产物12在氧化步骤后具有4.7μmol/m2的醛基团，对应于二醇到醛的37％转化率。
[0146]
实施例13
[0147]
在厚的异官能涂覆二氧化硅核-壳颗粒上的胰蛋白酶生物缀合
[0148]
按照实施例5中描述的程序将胰蛋白酶固定在实施例12产物12的材料上，并在4℃下储存，得到产物13。固定在这些材料上的胰蛋白酶量为18mg/g颗粒，固定效率为91％。
[0149]
实施例14
[0150]
控制杂化有机多孔二氧化硅颗粒上异官能涂层的厚度
[0151]
异官能涂层厚度可以由若干因素控制，诸如gptms浓度、总表面积与硅烷添加量的比率以及ph。按照实施例1，使用杂化多孔材料(ssa85m2/g，apd可购自waters corporation，milford，ma)、可变量的gptms和按照实施例1制备的不同缓冲液ph，来制备若干产物。按照实施例3中描述的程序水解所有这些材料。对于具有不同亲水性二醇涂层厚度的材料，参见下表2。
[0152]
表2：控制杂化有机多孔二氧化硅颗粒上异官能涂层的厚度
[0153][0154]
实施例15
[0155]
也可以用具有不同孔隙率的材料来制备异官能涂层厚度。通过改变反应混合物中gptms的浓度、总表面积与硅烷添加量的比率、ph和在反应前用于使硅烷预溶解的甲醇量，来制备若干产物。甲醇有助于在反应期间形成的硅酸盐物质的溶解度。较高量的甲醇导致较薄的涂层。按照实施例1中描述的程序，使用杂化多孔材料(ssa 79m2/g，apd，可购自waters corporation，milford，ma)实现各产物。对于具有不同亲水性涂层厚度的材料，参见下表3。按照实施例3中的程序，将所有材料水解以使环氧化物开环。
[0156]
表3：甲醇对杂化有机多孔二氧化硅颗粒上的异官能涂层厚度的影响
[0157][0158]
实施例16
[0159]
具有恒定涂层厚度的亲水性二醇涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒的受控氧化
[0160]
使用实施例4中所述的修改的程序，对来自实施例15的所选材料，均具有13μmol/m2的涂层覆盖率的产物15c和产物15f，进行受控的二醇氧化。将不同的材料暴露于氧化剂溶液以得到不同的氧化水平，从而产生不同的二醇/醛比。参见下表4。
[0161]
表4：具有不同醛覆盖率的异官能涂覆杂化有机多孔二氧化硅材料
[0162][0163]
实施例17
[0164]
对于不同涂层厚度的亲水性二醇涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒的受控氧化
[0165]
如实施例4中所述将具有不同涂层厚度的所选材料暴露于相同浓度的氧化剂，得到具有不同氧化水平和类似二醇转化百分比的产物。参见下表5。
[0166]
表5：亲水性二醇涂覆杂化有机多孔二氧化硅颗粒的受控氧化
[0167][0168][0169]
实施例18
[0170]
使用固定在异官能涂覆杂化有机多孔二氧化硅上的胰蛋白酶的nist mab消化
[0171]
nist mab用作模型蛋白，以评估通过使用上述实施例5中描述的程序将胰蛋白酶固定在异官能涂覆杂化有机多孔二氧化硅上制备的原型的性能。将大约50pg的nist mab变性，并用5mm二硫苏糖醇(dtt)在8m胍缓冲液中还原一小时，然后在黑暗中用15mm碘乙酰胺(iam)烷化30分钟。然后使用nap-5柱(可购自ge healthcare，general electric，boston，ma)使烷化的蛋白质脱盐并与15pl固定化胰蛋白酶混合。对于每种产品，将15pl固定化胰蛋白酶浆液在摇床上在70℃下消化10分钟，之后将样品离心，并且提交100pl的上清液用于lc-ms分析。通过来自不同原型的标准lc-ms测定产生的肽图具有与溶液中胰蛋白酶消化相似的谱图。不同的测试原型具有类似的涂层厚度，但在异官能涂层上的二醇百分比中不同，这由如实施例16中所述的氧化水平控制。下表6示出了所述原型的性能的差异。对于在具有二醇到醛的较低转化百分比的异双官能涂层上生物缀合的胰蛋白酶，总离子回收率较高。可以调整二醇与醛之间的比率以适合表面与分析物之间期望的相互作用。
[0172]
表6：具有不同二醇至醛转化率的原型的性能比较
[0173][0174]
虽然本公开已经参考其示例性实施方案具体示出和描述，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本技术的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。例如，可以使用其它色谱系统或检测系统。