采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶A检测方法与流程

采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶a检测方法
技术领域
1.本发明属于临床监测技术领域，尤其涉及一种采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶a检测方法。


背景技术：

2.蛋白激酶a，简称pka，是一个全酶(holoenzyme，由许多次单位组成，是完整的且有作用的酶)，它包含了两个调控次单位以及两个代谢次单位。当细胞中的camp较少时，pka虽然会暂时失去活性，但仍然可以保持结构完整。当camp浓度增加，camp会接上位于两个调控次单位上的活性区(binding site)，并使蛋白激酶a的构形改变，进而将两个代谢次单位释放。自由的代谢次单位，则可以参与一些化学反应。
3.蛋白激酶参与多种细胞功能，包括新陈代谢、细胞周期调节、生存和分化。蛋白激酶调节失调与多种致癌过程有关。在哺乳动物中，环磷酸腺苷(camp)是细胞内的第二信使，通常由激素和神经递质与g蛋白偶联受体(gpcrs)结合而产生。camp通过激活camp依赖的蛋白激酶a(pka)发挥许多生理作用，pka反过来磷酸化并调节下游蛋白靶标的功能，包括离子通道、酶和转录因子。蛋白激酶超家族约占人类基因组的2％，包括至少500种激酶。这些激酶负责在约18000蛋白质中的17万多个非冗余磷酸化位点。除此之外，蛋白激酶活性或特异性通常还与糖尿病、阿尔茨海默病、再狭窄、免疫缺陷、内分泌紊乱或心血管疾病等严重疾病密切相关。在哺乳动物中，环磷酸腺苷(camp)是细胞内的第二信使，通常由激素和神经递质与g蛋白偶联受体(gpcrs)结合而产生。camp通过激活camp依赖的蛋白激酶(pka)发挥许多生理作用，pka反过来磷酸化并调节下游蛋白靶标的功能，包括离子通道、酶和转录因子。camp/pka信号通路在多个水平上调节葡萄糖稳态，包括胰岛素和胰高血糖素的分泌、葡萄糖摄取、糖原合成和分解、糖异生以及神经调控葡萄糖稳态。
4.据估计，有超过25％的药物开发工作是针对蛋白激酶抑制剂的开发。蛋白激酶a(pka)是一种典型的嗜碱性丝氨酸/苏氨酸激酶。其在癌细胞异常增殖中起关键作用，它在许多癌细胞或组织(如黑素瘤、肺癌或乳腺癌)中特别亢奋活跃。因此，pka活性监测对癌症诊断有着重要作用。因此，蛋白激酶调节成为治疗疾病的关键领域之一。
5.然而，传统的蛋白激酶a活性检测方法可大致归结为如下几类。首先是放射性标记技术,曾是蛋白激酶a活性分析的标准方法。由于存在放射性污染问题,对人体及环境都存在一定危害，因此虽尚有一些应用，但正逐渐被其它技术所取代。除此之外还有基于抗体的识别技术。主要是利用对特定磷酸化氨基酸位点具有特异性识别能力的亲和抗体,结合荧光、光散射、电化学及比色等各种检测技术，是当前蛋白激酶a活性分析领域最为热门的研究方向。现有的检测蛋白激酶a的检测方法存在特异性不好、准确性不够、操作复杂、检测时间长、对人体及环境存在危害等缺陷。
6.因此，建立一种简便、快速的蛋白激酶a鉴定和检测方法对很多疾病的有效诊断和治疗至关重要。


技术实现要素：

7.鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶a检测方法。利用氧化碳纳米角的猝灭效应，联合羧肽酶和荧光探针进行蛋白激酶a检测，氧化碳纳米角结构稳定，可发生明显的猝灭反应。并且，该方法对人体及环境无危害，具有特异性好、准确性好、操作简单、更加快捷的优点，对于临床应用所需要的高速检测有较好的帮助，该方法对很多疾病的有效诊断和治疗至关重要，解决了现有的技术难点。
8.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
9.一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：苹果酸熔化，冷却，与氢氧化钠溶液混合，蒸发，制备碳量子点ccqd，将碳量子点ccqd与多肽段溶液孵育，制备荧光探针。
10.采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法制备的荧光探针具有特异性好、准确性好、安全无毒、无污染、对人体及环境无害、合成简便以及材料易获得等优点。
11.进一步，多肽段溶液中的多肽段的序列包括5'-nh2-lrraslg-3
′
。
12.采用上述技术方案的有益效果包括：该序列可被蛋白激酶a磷酸化，并且该肽段含有带正电荷的精氨酸基团，能够更好的通过静电作用吸附到氧化碳纳米角上发生猝灭反应。
13.进一步，多肽的序列包括seq id no.1所示的氨基酸序列。
14.进一步，苹果酸与氢氧化钠的质量比例为12:1；将苹果酸在200℃加热直到熔化将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温；氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.25m，与氢氧化钠溶液混合后，调整ph值至5.5-7.5；蒸发采用旋蒸仪在40℃条件下蒸发至100ml；孵育过程中，碳量子点ccqd与多肽段溶液等体积孵育，多肽段溶液的浓度为40μm，孵育的条件为25℃孵育2h。
15.优选地，与氢氧化钠混合后，调整ph值为6.0。
16.采用上述技术方案的有益效果包括：当ph为5.5-7.5之间可获得较好的荧光强度，当调整ph值为6.0荧光强度更好。严格控制苹果酸和氢氧化钠的比例有助于碳量子点的ph值的稳定性，控制蒸发温度防止温度过高或过低对碳量子点的荧光强度造成影响，孵育时间2h可确保碳量子点与多肽适配体结合成功。
17.本发明提供一种氧化碳纳米角的制备方法，包括以下步骤：将碳纳米角、n,n-二甲基甲酰胺、发烟硝酸混合，搅拌，回流；降温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，离心，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
18.采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法制备的氧化碳纳米角结构稳定，可发生明显的猝灭反应、对蛋白激酶a检测具有特异性好、准确性好等优点。
19.进一步，混合时加入材料的顺序为碳纳米角、n,n-二甲基甲酰胺、发烟硝酸；碳纳米角、n,n-二甲基甲酰胺、发烟硝酸的质量体积比为4g：4ml：4ml；回流的条件为：140℃油浴锅中搅拌回流24h，之后降温至室温；离心的条件为13000rpm离心10min。
20.采用上述技术方案的有益效果包括：加入材料的顺序为碳纳米角、n,n-二甲基甲酰胺、发烟硝酸，采用这样的顺序有利于防止加入发烟硝酸后出现反应体系温度过高，出现爆沸情况。碳纳米角、n,n-二甲基甲酰胺、发烟硝酸的质量体积比为4g：4ml：4ml，采用这样的比例有利于在制备完成水洗过过程中保留较多的氧化碳纳米角。回流条件为140℃油浴锅中搅拌回流24h，之后降温至室温是因为温度过高无法进行离心、分离上清液和水洗等操
作。离心的条件为13000rpm离心10min，有利于分析反应过后残留在上清液的液体，得到较为纯净的氧化碳纳米角固体。
21.本发明提供一种用于检测蛋白激酶a的试剂，包括上述制备方法制备的荧光探针；
22.和/或上述制备方法制备的氧化碳纳米角。
23.本发明提供一种用于检测蛋白激酶a的试剂盒，包括上述用于检测蛋白激酶a的试剂。
24.所述试剂盒还可以包括atp、tris-hcl、mgcl2、pka待测液、羧肽酶中的一种或几种的组合。
25.采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述试剂或试剂盒进行蛋白激酶a的检测，具有猝灭反应明显、操作简单、快捷、快速检测、特异性好、准确性好等优点。
26.上述制备方法制备的荧光探针、上述制备方法制备的氧化碳纳米角、上述试剂、上述试剂盒中的一种或几种的组合均可以在蛋白激酶a检测中的应用。例如：上述制备方法制备的荧光探针、上述制备方法制备的氧化碳纳米角、上述试剂、上述试剂盒中的一种或几种的组合均可以制备用于检测蛋白激酶a的试剂或试剂盒。
27.采用上述技术方案的有益效果包括：可在室温下灵敏检测蛋白激酶a的浓度变化情况，并且所使用的的材料安全无毒无污染。
28.本发明提供一种采用氧化碳纳米角猝灭荧光探针对蛋白激酶a检测的方法，包括以下步骤：准备pka反应液作为反应体系，反应液中包括荧光探针，荧光探针采用上述制备方法制备；将pka反应液第一次孵育；加入羧肽酶，第二次孵育，加入氧化碳纳米角，氧化碳纳米角采用上述制备方法制备，猝灭反应，测荧光。
29.采取上述技术方案的有益效果包括：利用氧化碳纳米角的猝灭效应，联合羧肽酶和荧光探针进行蛋白激酶a检测，氧化碳纳米角结构稳定，可发生明显的猝灭反应。并且，该方法具有特异性好、准确性好、操作简单、更加快捷、对人体及环境无危害的优点，对于临床应用所需要的高速检测有较好的帮助，该方法对很多疾病的有效诊断和治疗至关重要，解决了现有的技术难点。
30.进一步，pka反应液中还包括atp、tris-hcl、mgcl2、pka待测液中的一种或几种的组合；荧光探针的浓度为10μm，atp的浓度为0.1mm，tris-hcl的浓度为50mm，mgcl2的浓度为10mm，pka反应液ph为7-7.5；羧肽酶的浓度为2.1u/ml，羧肽酶的加入体积为反应体系体积的1/2；第一次孵育的条件为25℃孵育≥30min；氧化碳纳米角的浓度为50μg/ml，加入氧化碳纳米角的体积与第二次孵育后的混合溶液体积相同；猝灭反应时间为≥2min；根据测得的荧光值猝灭程度，计算蛋白激酶a的的浓度。
31.采用上述技术方案的有益效果包括：猝灭反应时间为≥2min荧光猝灭效应好，尤其在反应时间达到大于2min后，氧化碳纳米角可以达到最大荧光猝灭效应。孵育反应时间≥30min有利于获得较好的检测结果，当反应时间为大于30min检测结果更好。pka反应液ph为7-7.5的情况下，荧光猝灭程度较好，反应较明显。
32.羧肽酶的浓度为2.1u/ml，羧肽酶的加入体积为反应体系体积的1/2，氧化碳纳米角的浓度为50μg/ml，加入氧化碳纳米角的体积与第二次孵育后的混合溶液体积相同，采取上述参数有利于获得更好的荧光猝灭效果。
附图说明
33.图1为碳量子点不同ph下的稳定性的结果。
34.图2为氧化碳纳米角猝灭时间考察的结果。
35.图3为不同浓度下pka孵育时间的考察的结果。
36.图4为不同ph条件下pka的反应变化的结果。
37.图5为不同浓度pka的荧光变化的结果。
38.图6为pka荧光变化线性关系结果。
39.图7为检测方法特异性对比结果。
具体实施方式
40.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
41.本发明提供了一种采用氧化碳纳米角对荧光探针的猝灭情况变化检测蛋白激酶a的方法。包括以下技术方案。
42.(1)氧化碳纳米角的制备：取圆底烧瓶加入4g碳纳米角后依次再加入4ml n,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
43.(2)碳量子点荧光探针的制备：将6克苹果酸装入带盖的玻璃烧杯或坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml 0.25m氢氧化钠，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，(激发波长为365nm)，并在4℃下保存。取等体积的碳量子点与10-40μm多肽段溶液(序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃下孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
44.本发明采用结合氧化碳纳米角进行猝灭反应测定蛋白激酶a，同时也拓宽了蛋白激酶a的途径，具有很好的应用前景。
45.在一些实施例中很好的解释了该方法检测蛋白激酶a的反应的反应条件。下面通过具体实施例进行介绍。
46.实施例中，多肽段序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
，多肽段序列包括seq id no.1所示的氨基酸序列，多肽段序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供。0.1mm atp购自生工生物工程(上海)股份有限公司，10mm mgcl2购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司，30mu/μl pka购自new england biolabs(neb)。
47.本发明中未经特殊说明的实验材料均可通过本领域常规方法制备或者通过市购途径获得。
48.一、碳量子点稳定性的考察
49.实施例1
50.将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml氢氧化钠溶液(氢氧化钠浓度为0.25m)，然后调整ph值至4。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd测量荧光变化。
51.实施例2，与实施例1不同的是ph调整至4.5。
52.实施例3，与实施例1不同的是ph调整至5。
53.实施例4，与实施例1不同的是ph调整至5.5。
54.实施例5，与实施例1不同的是ph调整至6。
55.实施例7，与实施例1不同的是ph调整至6.5。
56.实施例8，与实施例1不同的是ph调整至7。
57.实施例9，与实施例1不同的是ph调整至7.5。
58.实施例10，与实施例1不同的是ph调整至8。
59.实施例11，与实施例1不同的是ph调整至8.5。
60.实施例12，与实施例1不同的是ph调整至9。
61.实验结果：
62.采用苹果酸制备的碳量子点，激发波长为365nm，考虑到人体内稳态ph变化，采用该碳量子点合成的荧光探针用于蛋白激酶a检测应适应生物样本的常见ph范围，实施例1-12中不同ph对荧光探针稳定的影响如图1所示，可见当ph＝5.5-7.5之间均可获得较好的荧光强度，尤其当ph＝6.0时荧光强度更好。
63.二、考察氧化碳纳米角对荧光探针的的猝灭反应时间
64.实施例13
65.(1)合成氧化碳纳米角：取圆底烧瓶加4g碳纳米角后依次再加入4mln,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
66.(2)碳量子点荧光探针的制备：将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml氢氧化钠溶液(氢氧化钠浓度为0.25m)，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，(激发波长为365nm)，并在4℃下保存。取等体积碳量子点与40μm多肽段溶液(多肽段序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
67.(3)将50μl 50μg/ml的氧化碳纳米角，加入50μl荧光探针中，猝灭反应30s后以365nm为激发波长测定荧光。
68.实施例14，与实施例13不同的是猝灭反应时间调整至1min。
69.实施例15，与实施例13不同的是猝灭反应时间调整至1.5min。
70.实施例16，与实施例13不同的是猝灭反应时间调整至2min。
71.实施例17，与实施例13不同的是猝灭反应时间调整至10min。
72.实施例18，与实施例13不同的是猝灭反应时间调整至20min。
73.实施例19，与实施例13不同的是猝灭反应时间调整至30min。
74.实施例20，与实施例13不同的是猝灭反应时间调整至60min。
75.实验结果：
76.氧化碳纳米角具有优异的电化学、光学、机械生物相容性、热学和吸附性能，考察猝灭时间可以更好的判断反应的完整程度。实施例13-20中不同反应时间对猝灭反应影响如图2所示氧化碳纳米角在与荧光探针的猝灭反应时间在1-1.5min之间呈现了明显的荧光下降的情况，在反应时间达到≥2min后，氧化碳纳米角达到了最大荧光猝灭效应。
77.三、采用荧光分析法测定不同浓度下pka孵育时间对荧光变化的影响。
78.实施例21
79.合成氧化碳纳米角：取圆底烧瓶加4g碳纳米角后依次再加入4ml n,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
80.合成荧光探针：将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml氢氧化钠溶液(氢氧化钠浓度为0.25m)，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，并在4℃下保存。取等体积碳量子点与40μm多肽段溶液(序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃下孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
81.测定蛋白激酶a：配置pka反应液40μl，pka反应液包括10μm荧光探针、0.1mm atp、50mm tris-hcl、10mm mgcl2(ph＝7.5)、0mu/μl pka，荧光探针采用上述方法制备；在25℃条件将pka反应液孵育0min。
82.在该体系中加入20μl浓度为2.1u/ml羧肽酶，在25℃孵育30min后再加入40μl 50μg/ml的氧化碳纳米角，氧化碳纳米角采用上述方法制备，反应2min后以365nm为激发波长测定荧光。
83.实施例22，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为1min。
84.实施例23，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为2min。
85.实施例24，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为5min。
86.实施例25，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为10min。
87.实施例26，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为15min。
88.实施例27，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为20min。
89.实施例28，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为30min。
90.实施例29，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为40min。
91.实施例30，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为60min。
92.实施例31，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为90min。
93.实施例32，与实施例21不同的是调节pka反应液的孵育时间为120min。
94.实施例33，与实施例21不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
95.实施例34，与实施例22不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
96.实施例35，与实施例23不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
97.实施例36，与实施例24不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
98.实施例37，与实施例25不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
99.实施例38，与实施例26不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
100.实施例39，与实施例27不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
101.实施例40，与实施例28不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
102.实施例41，与实施例29不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
103.实施例42，与实施例30不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
104.实施例43，与实施例31不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
105.实施例44，与实施例32不同的是调节pka反应液中pka的浓度为10mu/μl。
106.实施例45，与实施例21不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
107.实施例46，与实施例22不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
108.实施例47，与实施例23不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
109.实施例48，与实施例24不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
110.实施例49，与实施例25不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
111.实施例50，与实施例26不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
112.实施例51，与实施例27不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
113.实施例52，与实施例28不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
114.实施例53，与实施例29不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
115.实施例54，与实施例30不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
116.实施例55，与实施例31不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
117.实施例56，与实施例32不同的是调节pka反应液中pka的浓度为15mu/μl。
118.实施例57，与实施例21不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
119.实施例58，与实施例22不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
120.实施例59，与实施例23不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
121.实施例60，与实施例24不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
122.实施例61，与实施例25不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
123.实施例62，与实施例26不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
124.实施例63，与实施例27不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
125.实施例64，与实施例28不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
126.实施例65，与实施例29不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
127.实施例66，与实施例30不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
128.实施例67，与实施例31不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
129.实施例68，与实施例32不同的是调节pka反应液中pka的浓度为30mu/μl。
130.实验结果：
131.实施例21-68中对不同浓度下pka孵育时间测定结果如图3所示。可见当pka反应液的孵育时间≥30min即可达到较好的检测结果。
132.四、采用荧光分析法测定不同ph环境下的浓度为30mu/μl的pka荧光变化
133.实施例69
134.合成氧化碳纳米角：取圆底烧瓶加4g碳纳米角后依次再加入4ml n,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
135.合成荧光探针：将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml 0.25m氢氧化钠，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，并在4℃下保存。取等体积碳量子点与40μm多肽段溶液(序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃下孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
136.测定蛋白激酶a：配置ph＝5的pka反应液40μl，pka反应液包括10μm荧光探针、0.1mm atp、50mm tris-hcl、10mm mgcl2、30mu/μl pka，在25℃条件下孵育30min。在该体系中加入20μl浓度为2.1u/ml羧肽酶，在25℃孵育30min后再加入40μl 50μg/ml的氧化碳纳米角，反应2min后以365nm为激发波长测定荧光。
137.实施例70，与实施例69不同的是调节pka反应液ph＝5.5。
138.实施例71，与实施例69不同的是调节pka反应液ph＝6。
139.实施例72，与实施例69不同的是调节pka反应液ph＝6.5。
140.实施例73，与实施例69不同的是调节pka反应液ph＝7。
141.实施例74，与实施例69不同的是调节pka反应液ph＝7.5。
142.实施例75，与实施例69不同的是调节pka反应液ph＝8。
143.实验结果：
144.实施例69-75中不同的是在不同ph条件下利用测定pka与该荧光体系的反应能力，结果如图4所示。可见ph＝7-7.5的情况下，荧光猝灭程度较好，反应较明显。
145.五、采用荧光分析法测定不同浓度pka的荧光变化
146.实施例76
147.合成氧化碳纳米角：取圆底烧瓶加4g碳纳米角后依次再加入4ml n,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
148.合成荧光探针：将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml氢氧化钠溶液(氢氧化钠浓度为0.25m)，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，并在4℃下保存。取等体积碳量子点与40μm多肽段溶液(序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃下孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
149.测定蛋白激酶a：配置pka反应液40μl，pka反应液包括10μm荧光探针、0.1mm atp、50mm tris-hcl、10mm mgcl2(ph＝7.5)、0mu/μl pka，在25℃条件下孵育30min。在该体系中加入20μl浓度为2.1u/ml羧肽酶，在25℃孵育30min后再加入40μl 50μg/ml的氧化碳纳米角，反应2min后以365nm为激发波长测定荧光。
150.实施例77，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为1.5mu/μl pka。
151.实施例78，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为4.5mu/μl pka。
152.实施例79，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为6mu/μl pka。
153.实施例80，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为12mu/μl pka。
154.实施例81，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为18mu/μl pka。
155.实施例82，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为36mu/μl pka。
156.实施例83，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为54mu/μl pka。
157.实施例84，与实施例76不同的是调节pka反应液中pka的浓度为72mu/μl pka。
158.实施例85，与实施例76不同的是调节pka反应液中的pka浓度为144mu/μl pka。
159.实施例86，与实施例76不同的是调节pka反应液中的浓度为288mu/μl pka。
160.实验结果：
161.实施例76-86中是测定不同浓度下pka与该荧光体系的反应能力，结果如图5所示，体系中pka浓度越高荧光猝灭程度越大，结果越明显。
162.六、采用荧光分析法测定不同浓度pka的荧光变化的线性关系
163.实施例87
164.合成氧化碳纳米角：取圆底烧瓶加4g碳纳米角后依次再加入4ml n,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
165.合成荧光探针：将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml氢氧化钠(氢氧化钠的浓度为0.25m)，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，并在4℃下保存。取等体积碳量子点与40μm多肽段溶液(序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃下孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
166.测定蛋白激酶a：配置不同浓度的pka反应液40μl，pka反应液包括10μm荧光探针、0.1mm atp、50mm tris-hcl、10mm mgcl2(ph＝7.5)、1-20mu/μl pka(分别为1mu/μl、4mu/μl、7mu/μl、10mu/μl、13mu/μl、17mu/μl、20mu/μl)，在25℃条件下孵育30min。在该体系中加入20μl浓度为2.1u/ml羧肽酶，在25℃孵育30min后再加入40μl 50μg/ml的氧化碳纳米角，反应2min后以365nm为激发波长测定荧光。
167.实施例87中是测定不同浓度下pka与该荧光体系的反应能力，结果如图6所示，体系中pka浓度越高荧光猝灭程度越大，结果越明显。以pka的浓度为横坐标，以荧光强度猝灭的程度f0-f为纵坐标(f0为未加待检测样品的荧光强度，f为加入待检测样品的荧光强度，猝灭的程度为f0-f)，构建标准曲线方程，检测待检测样品的荧光强度猝灭的程度，通过标准曲线方程可以计算待测样品中pka的浓度，计算荧光强度猝灭的程度与反应液中pka的浓度呈较好的线性关系(r2＝0.995)。
168.七、采用荧光分析法测定血清样品中pka的荧光变化并新型回收率计算
169.实施例88
170.合成氧化碳纳米角：取圆底烧瓶加4g碳纳米角后依次再加入4ml n,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
171.合成荧光探针：将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml氢氧化钠溶液(氢氧化钠的浓度为0.25m)，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，并在4℃下保存。取等体积碳量子点与40μm多肽段溶液(序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃下孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
172.测定实际血清样品：进行加样回收率实验，将三组血清样品稀释100倍分别加入0、5、10、15mu/μl的pka，在25℃条件下孵育30min。在该体系中加入20μl浓度为2.1u/ml羧肽酶，在25℃孵育30min后再加入40μl 50μg/ml的氧化碳纳米角，反应2min后以365nm为激发波长测定荧光。
173.实施例88中是测定血清样品中的pka与该荧光体系的反应能力，结果如表1所示，表1为血清样品中pka荧光变化的回收率结果，从三个样品中得到回收率在96.57％-102.67％之间，说明采用上述方法检测pka具有准确性好的优点。
174.表1
[0175][0176]
“‑”
代表未测出
[0177]
八、采用荧光分析法测定该方法特异性
[0178]
实施例89
[0179]
合成氧化碳纳米角：取圆底烧瓶加4g碳纳米角后依次再加入4ml n,n-二甲基甲酰胺和4ml发烟硝酸，加入磁力搅拌子，并且在连接好冷凝回流装置后，放入140℃油浴锅中搅拌回流24h。再将所得溶液放凉至室温，去除上清液后加入蒸馏水混匀，在13000rpm下离心10min，反复重复上述水洗操作，直至ph＝7。
[0180]
合成荧光探针：将6克苹果酸装入坩埚中，然后在200℃加热直到熔化。将温度保持在200℃35min，然后冷却至室温。然后向体系中加入50ml氢氧化钠溶液(氢氧化钠的浓度为0.25m)，然后调整ph值至6.0。然后旋蒸仪在40℃下蒸发至100ml，制备碳量子点ccqd，并在4℃下保存。取等体积碳量子点与40μm多肽段溶液(序列：5'-nh2-lrraslg-3
′
)在25℃下孵育2h，制备出可用于检测蛋白激酶a的荧光探针。
[0181]
特异性测定：配置含有30ng/ml蛋白激酶a、葡萄糖氧化酶、尿激酶、胰蛋白酶、α-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶反应液40μl，pka反应液包括10μm荧光探针、0.1mm atp、50mm tris-hcl、10mm mgcl2(ph＝7.5)，在25℃条件下孵育30min。在该体系中加入20μl浓度为2.1u/ml羧肽酶，在25℃孵育30min后再加入40μl 50μg/ml的氧化碳纳米角，反应2min后以365nm为激发波长测定荧光。
[0182]
实施例89中是测定蛋白激酶a、葡萄糖氧化酶、尿激酶、胰蛋白酶、α-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶与该荧光体系的反应能力，结果如图7所示，可以看出该检测方法对蛋白激酶a具有很好的特异性和选择性。
[0183]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。