一种荧光探针及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及一种荧光探针及其制备方法与应用，属于纳米材料和生物成像行业领域。


背景技术：

2.与有机染料和无机半导体量子点相比，硅量子点(sinps)由于其光学特性、生物相容性和稳定性，在传感策略、生物成像和药物传递等领域得到了广泛的研究和应用。
3.替加环素(tige)是二甲胺四环素的衍生物，是第一个新的甘氨酸四环素类广谱抗菌药物，用于临床治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌等。目前，tige主要用于治疗复杂的皮肤、软组织、腹腔感染和社会获得性肺炎。然而，tige通过生活污水、制药和水产养殖废水排放到环境中，导致水生生物产生耐药性，严重影响了生态环境和人类健康。因此，人们试图尝试制备廉价、高效的荧光探针，并结合比色传感技术，实现快速、方便、高选择性的tige检测。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种荧光探针，该探针在hela细胞中表现出蓝色荧光。
5.本发明提供了一种荧光探针的制备方法，该方法制备荧光探针简单便捷。
6.本发明还提供了荧光探针在特异性检测替加环素的应用。
7.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
8.一种荧光探针，使用n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺和乙醇胺为前驱体，经一步溶剂热法合成硅量子点，硅量子点经透析和冷冻干燥后获得荧光探针b-sinps。
[0009]
荧光探针b-sinps细胞毒性小，可以有效进入细胞，在细胞中表现出明亮的蓝色，在细胞成像方面具有潜在的应用前景。
[0010]
该荧光探针的制备方法，包括以下步骤：称取n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺和乙醇胺溶解在水中，超声处理直到混合物澄清；将混合物转移到聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在180-210℃下加热3-5h；高压釜冷却至室温时，得到荧光物质；使用透析袋透析除去未反应的小分子，冷冻干燥后得到蓝色荧光硅量子点b-sinps，即为制备的荧光探针。
[0011]
该方法制备特异性检测替加环素的荧光探针b-sinps操作简单，合成方法简单易行。
[0012]
优选地，所述的n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺、乙醇胺、水的加入比例为0.8-1.2g：1.5-3g：15-30ml。
[0013]
优选地，所述的透析袋截留分子量为1000da。
[0014]
该荧光探针在特异性检测替加环素的应用。
[0015]
该荧光探针细胞毒性低，在细胞中显示出蓝色荧光，可以特异性的检测细胞中的
替加环素，对实现快速、方便、高选择性的tige检测有重要意义，也可以广泛的应用于细胞成像领域。
[0016]
优选地，可以在细胞水平上检测替加环素。
[0017]
进一步优选地，所述的细胞为hela细胞。
[0018]
进一步优选地，细胞水平检测tige的具体操作步骤为荧光探针与hela细胞共同孵育，加入不同浓度的替加环素后，进行共聚焦分析，观察荧光强度。
附图说明
[0019]
图1为本发明实施例1中b-sinps的透射电镜图；
[0020]
图2为本发明实施例1中b-sinps的x射线光电子能谱图；
[0021]
图3为本发明实施例1中b-sinps的紫外-可见吸收光谱图；
[0022]
图4为本发明实施例1中b-sinps的荧光光谱图；
[0023]
图5为本发明实施例4中b-sinps对不同浓度tige的响应；
[0024]
图6为本发明实施例4中f0/f与tige浓度的线性关系(f0为0ug/ml tige的溶液荧光强度值，f为添加当下浓度tige的溶液荧光强度值)；
[0025]
图7为本发明实施例4中离子干扰实验图；
[0026]
图8为本发明实施例4中b-sinps的细胞毒性测试结果图；
[0027]
图9为本发明实施例4中b-sinps的细胞成像图。
具体实施方式
[0028]
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
[0029]
一、本发明的一种荧光探针及制备方法的实施例
[0030]
实施例1
[0031]
本实施例的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0032]
1)称取1g n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(damo)和2g乙醇胺溶解在20ml去离子水中，超声处理30min直到混合物澄清；
[0033]
2)将混合物转移到100ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在200℃下加热4h；
[0034]
3)高压釜冷却至室温时，得到荧光物质；
[0035]
4)用透析袋(截留分子量为1000da)透析用以除去未反应的小分子后，通过冷冻干燥方法得到固体产物蓝色荧光硅量子点b-sinps，即为特异性检测替加环素的荧光探针。
[0036]
本实施例的荧光探针，以n-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺和乙醇胺为前驱体，经一步溶剂热法合成硅量子点，硅量子点经透析和冷冻干燥得到荧光探针b-sinps，具体制备方法如实施例1中步骤所述。
[0037]
图1为b-sinps的形貌表征，由图中可以看出硅量子点的平均直径约为3-6nm，分布均匀，有着明显的晶格结构。
[0038]
图2为b-sinps的xps表征，由图中可以看出硅量子点由四种元素组成，分别是碳元素(63.1％)、氧元素(25.2％)、氮元素(2.5％)以及硅元素(9.2％)。
[0039]
图3、图4为b-sinps的光谱表征表征，由图3可以看出，b-sinps在260nm-480nm处存
在明显的宽吸收带，根据分析为n-π*跃迁导致的；由图4可以看出b-sinps的荧光最佳发射峰位于452nm处。
[0040]
以硫酸奎宁(qy:54％)溶液溶于0.1m硫酸溶液为基准，测定b-sinps的荧光量子产率(qy)，计算得到b-sinps的qy为17.5％。
[0041]
实施例2
[0042]
本实施例的一种荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0043]
1)称取0.8g damo和1.5g乙醇胺溶解在15ml去离子水中，超声处理30min直到混合物澄清；
[0044]
2)将混合物转移到100ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在180℃下加热3h；
[0045]
3)高压釜冷却至室温时，得到荧光物质；
[0046]
4)用透析袋(截留分子量为1000da)透析用以除去未反应的小分子后，通过冷冻干燥方法得到固体产物蓝色荧光硅量子点b-sinps，即为特异性检测替加环素的荧光探针。
[0047]
本实施例的荧光探针由实施例2所述的制备方法制备获得。
[0048]
实施例3
[0049]
本实施例的一种荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0050]
1)称取1.2g damo和3g乙醇胺溶解在30ml去离子水中，超声处理30min直到混合物澄清；
[0051]
2)将混合物转移到100ml聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在210℃下加热5h；
[0052]
3)高压釜冷却至室温时，得到荧光物质；
[0053]
4)用透析袋(截留分子量为1000da)透析用以除去未反应的小分子后，通过冷冻干燥方法得到固体产物蓝色荧光硅量子点b-sinps，即为特异性检测替加环素的荧光探针。
[0054]
本实施例的荧光探针由实施例3所述的制备方法制备获得。
[0055]
二、本发明一种荧光探针在特异性检测替加环素的应用实施例
[0056]
实施例4
[0057]
本实施例的荧光探针b-sinps在替加环素检测方面的应用，使用实施例1中制备的b-sinps可以特异性的检测替加环素。具体操作步骤如下：
[0058]
1、b-sinps检测溶液中tige
[0059]
将不同浓度(0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,50μg/ml)的tige溶液加入到3ml浓度为0.1mg/ml的b-sinps溶液中，静置3分钟。然后，将激发波长设置于365nm处，测试混合溶液的荧光强度值，结果见图5，由图中可以看出在b-sinps溶液中加入不同浓度的tige溶液，荧光强度随着浓度的增加而逐步减弱。使用origin软件绘制tige的检测曲线，可以从图6中看出在tige浓度为4-24μg/ml区间，硅量子点的荧光减弱呈线性关系，相关系数r2达到0.993，说明该硅量子点能够应用于溶液中tige浓度的检测。
[0060]
2、离子干扰测试
[0061]
在室温条件下，用相似的方法研究了硅量子点溶液与其他干扰物溶液的荧光响应行为。相对应的离子选择性实验操作步骤和1中步骤相同，其中用干扰物(glu,suc,k+,na+,mg2+,ca2+,cl-,gsh,aa,浓度为50μg/ml)代替相对应的tige。从图7中可以看出，在相对应的干扰物存在时，只有tige对硅量子点溶液的荧光有着强烈的淬灭作用，而其他干扰物对荧光强度没有显著影响。
[0062]
3、b-sinps的细胞增殖和毒性测试
[0063]
hela细胞被接种在96孔板上，每孔104个细胞。培养基由10％胎牛血清、100u/ml青霉素-链霉素溶液和90％rpmi 1640培养基组成。孵育24h后，去除培养基，加入含不同浓度硅量子点pbs溶液的新鲜完全培养基，再孵育24h。最后，去除培养基，pbs洗涤细胞三次，采用wst-1法检测细胞活力。用酶标仪在450nm波长记录所有平板的吸收。
[0064]
由图8可知，在加入不同浓度b-sinps时，细胞存活率均保持在90％以上，证明制备的b-sinps细胞毒性较低，有良好的生物相容性。
[0065]
4、hela细胞成像及细胞水平检测tige
[0066]
为了评估b-sinps对细胞成像的影响，将hela细胞接种到35mm玻璃底培养皿中，在37℃、5％co2的湿度环境下培养。孵育24h后，去除初始培养基，加入2ml含有b-sinps浓度为100μg/ml新鲜培养基再孵育24h。去除培养液，加入1ml含有不同浓度的tige的新鲜培养液(tige浓度分别为0μg/ml、30μg/ml、60μg/ml)，37℃孵育1h后，用pbs洗涤3次，4％多聚甲醛填充细胞。hela细胞固定后，用dapi二盐酸盐进行核靶向，利用共聚焦显微镜检测细胞成像效果。
[0067]
由图9(a-d)可知，b-sinps在hela细胞表现出明亮的蓝色荧光，证明制备的b-sinps可以有效地进入hela细胞，可以对hela细胞成像。由图9中(e-l)可知，外源tige加入使b-sinps的荧光强度显著下降，其中(e-h)图是浓度为30μg/ml的tige，(i-l)图是浓度为60μg/ml的tige，可看出图中tige的浓度增大，b-sinps的蓝色荧光将近消失，说明b-sinps可以在细胞水平上对tige进行检测。
[0068]
综上所述，采用本发明制备方法制备的b-sinps细胞毒性较低，可以顺利的进入到hela细胞中，并表现出明亮的蓝色荧光，b-sinps也可以在溶液中及细胞水平上特异性检测tige，在细胞成像和tige检测方面具有潜在的应用前景。