一种新型生物素功能化复合荧光探针的制备及其应用

本发明涉及蛋白质组学分析领域，具体涉及一种新型生物素功能化复合荧光探针的制备及其应用。

背景技术：

1、外泌体是由细胞分泌的膜外囊泡(直径30-150纳米)，它携带丰富的分子信息，如来自母体细胞的rna和蛋白质。外泌体作为特殊分泌的囊泡，自然存在于血液、尿液和脑血管液等体液中，参与肿瘤的发生、信号转导和免疫反应，并可作为介导细胞间交流的信使最近的研究表明，外泌体的异常表达往往与肿瘤的发生和发展有关。此外，人们发现外泌体在丰度和稳定性方面优于其他物质，如循环肿瘤囊泡和循环肿瘤dna。因此，从血清中分离和提取外泌体进行分析，在临床诊断或治疗方面有很大的潜力。

2、作为最常见的翻译后修饰之一，外泌体糖基化与神经传导和癌症进展有关。因此，外泌体糖基化的特征对于理解外泌体的生物学意义和探索临床生物标志物至关重要。尽管研究人员已经认识到外泌体糖基化在生理过程中的重要性，但糖类组成的复杂性和修饰位点的多样性给检测糖基化程度和进行功能研究带来了挑战。目前，已经报道了一些技术，包括蛋白免疫印迹法、凝集素阵列法和质谱法来分析外泌体糖基化的蛋白质。最近，基于荧光的检测方法因其快速反应和定量测量的优势而受到关注。荧光探针不仅增强了外泌体的细胞靶向特异性，而且还将外泌体-细胞结合事件转变成可激活的信号，用于实时监测。由于荧光探针具有很强的可修改性，因此，设计新的荧光探针对识别和标记特定的目标具有实际意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种新型生物素功能化复合荧光探针，采用一系列的修饰方式实现荧光放大，并将该策略应用于定量检测外泌体表面聚糖。

2、实现本发明目的的技术方案是提供一种新型生物素功能化复合荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

3、s1、将氯化镉和碲化钠分散在50ml的蒸馏水中，加入l-半胱氨酸、柠檬酸三钠二水合物和硼氢化钠并充分混合，在一定温度下搅拌并回流，迅速冷却并通过0.22微米的过滤器过滤，一锅法制备得到l-半胱氨酸修饰的cdte纳米晶体；

4、s2、将生物素作为外层修饰，以步骤s1所得l-半胱氨酸修饰的cdte纳米晶体作为基体，生物素连接l-半胱氨酸形成外层修饰；

5、进一步的，所述s1中反应温度为100℃，回流时间为45分钟。

6、进一步的，所述s2中反应温度为室温，反应时间为12～13h。

7、进一步的，所述步骤s1中，氯化镉、碲化钠、l-半胱氨酸的质量比为1:(0.3～0.4):(1.7～1.8)。

8、进一步的，所述的新型生物素功能化复合荧光探针用于荧光信号放大策略。

9、进一步的，包括以下步骤：将fe3o4@tio2-cd63aptamer@exosome与naio4溶液(1mm，500μl)在4℃下孵育30分钟，以氧化外泌体上的糖；将苯胺和生物素酰肼(10mm：100μm)的溶液(500μl)加入上述样品中；在磁铁的作用下弃去上清液，并用pbs洗涤沉淀物三次；最后，加入streptavidin-fitc和准备好的荧光探针，在室温下分别孵育30分钟；

10、进一步的，孵育过程中的旋转速度均为1250rpm。

11、进一步的，所述新型生物素功能化复合荧光探针用于检测外泌体表面聚糖表达。

12、进一步的，包括以下步骤：将fe3o4@tio2-cd63aptamer@exosome与naio4溶液(1mm，500μl)在4℃下孵育30分钟，以氧化外泌体上的糖；将苯胺和生物素酰肼(10mm：100μm)的溶液(500μl)加入上述样品中；在磁铁的作用下弃去上清液，并用pbs洗涤沉淀物三次；最后，加入streptavidin-fitc和准备好的荧光探针，在室温下分别孵育30分钟；将产品分散在2ml水中，在450nm的激发波长下测量并记录荧光值。

13、进一步的，孵育过程中的旋转速度都是1250rpm。

14、采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：

15、(1)相对于现有技术，本发明的制备方法可以制得新型生物素功能化复合荧光探针。采用一锅法合成l-半胱氨酸修饰的cdte纳米晶体，得到了尺寸均匀的纳米线，通过控制反应时间可以调整所得的cdte纳米晶体的激发和发射波长。在cdte纳米晶体的水相合成中，使用l-半胱氨酸作为合成的保护剂和表面涂层剂，不仅有效地降低了其毒性，而且在表面提供了丰富的基团，以便通过基团间的反应进一步修饰。通过nhs/edc偶联法对d-生物素的羧基进行活化，然后与氨基反应生成酰胺键，用于偶联到cdte@cys的表面，成功地在cdte纳米晶体上进行修饰。形成的荧光探针可以被具有链霉素亲和力的生物素特异性地识别并进行荧光标记。

16、(2)本发明通过优化反应时间和原料浓度，可以调整新型生物素功能化复合荧光探针的微观形貌和尺寸，从而获得性能最佳的材料，大大提高荧光放大的能力。

17、(3)本发明合成的新型生物素功能化复合荧光探针在荧光放大策略并检测外泌体表面聚糖表达应用中具有合成路径简便、高特异性等优势，具有很好的应用前景。

18、(4)本发明合成的荧光探针不仅能定量检测外泌体表面的聚糖，还能高度准确地区分来自正常人和肾病患者血清的外泌体，为癌症诊断中外泌体的敏感检测提供了一个强大的平台。

技术特征：

1.一种新型生物素功能化复合荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的新型生物素功能化复合荧光探针的制备方法，其特征在于，所述s1中反应温度为100℃，回流时间为45分钟。

3.根据权利要求1所述的新型生物素功能化复合荧光探针的制备方法，其特征在于，所述s2中反应温度为室温，反应时间为12～13h。

4.根据权利要求1所述的新型生物素功能化复合荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，氯化镉、碲化钠、l-半胱氨酸的质量比为1:(0.3～0.4):(1.7～1.8)。

5.一种如权利要求1所述的新型生物素功能化复合荧光探针在荧光信号放大策略中的应用，其特征在于，所述的新型生物素功能化复合荧光探针用于荧光信号放大策略。

6.根据权利要求5所述的新型生物素功能化复合荧光探针在荧光信号放大策略中的应用，其特征在于，包括以下步骤：将fe3o4@tio2-cd63aptamer@exosome与naio4溶液(1mm，500μl)在4℃下孵育30分钟，以氧化外泌体上的糖；将苯胺和生物素酰肼(10mm：100μm)的溶液(500μl)加入上述样品中；在磁铁的作用下弃去上清液，并用pbs洗涤沉淀物三次；最后，加入streptavidin-fitc和准备好的荧光探针，在室温下分别孵育30分钟。

7.根据权利要求6所述的新型生物素功能化复合荧光探针在荧光信号放大策略中的应用，其特征在于，孵育过程中的旋转速度均为1250rpm。

8.一种如权利要求1所述的新型生物素功能化复合荧光探针在外泌体表面聚糖表达检测中的应用，其特征在于，所述新型生物素功能化复合荧光探针用于检测外泌体表面聚糖表达。

9.根据权利要求8所述的新型生物素功能化复合荧光探针在外泌体表面聚糖表达检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：将fe3o4@tio2-cd63aptamer@exosome与naio4溶液(1mm，500μl)在4℃下孵育30分钟，以氧化外泌体上的糖；将苯胺和生物素酰肼(10mm：100μm)的溶液(500μl)加入上述样品中；在磁铁的作用下弃去上清液，并用pbs洗涤沉淀物三次；最后，加入streptavidin-fitc和准备好的荧光探针，在室温下分别孵育30分钟；将产品分散在2ml水中，在450nm的激发波长下测量并记录荧光值。

10.根据权利要求9所述的新型生物素功能化复合荧光探针在外泌体表面聚糖表达检测中的应用，其特征在于，孵育过程中的旋转速度都是1250rpm。

技术总结
本发明涉及本发明提供了一种新型生物素功能化复合荧光探针(记为CdTe@cys‑biotin)的制备及其应用。基于化学氧化策略和链霉亲和素与生物素之间的高亲和力，实现荧光放大并首次应用于外泌体表面聚糖表达的检测。该荧光探针不仅能定量检测外泌体表面的聚糖，还能高度准确地区分来自正常人和肾病患者血清的外泌体，为癌症诊断中外泌体的敏感检测提供了一个强大的平台。

技术研发人员：闫迎华,罗依婷,丁传凡
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15